Seminar kĩ thuật cố đinh enzyme

Cố định enzyme α-chymotrypsin trên chất mang nano Người trình bày Nguyễn Thị Lan Hương – 13313228 Lê Thị Mỹ Duyên - 13310294 1 BÁO CÁO BÁO CÁO Tháng 04.2014 Cố định enzyme α-chymotrypsin trên chất mang nano 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 2. Nguồn thu nhận 3. Phương pháp cố định 4. Kết quả 5. Ứng dụng NỘI DUNG 2 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 3 1.1. Mô tả  α-chymotrypsin = chymotrypsin A (EC 3.4.21.1)  Là một serine endopeptidase được tổng hợp từ tụy và hoạt động ở môi trường base.  Là 1 protease ngoại bào.  Hoạt hóa từ chymotrypsinogen bởi sự thủy phân liên kết peptide nhờ trypsin.  Phân cắt chọn lọc các liên kết peptide nội mạch của chuỗi polypeptide (liên kết ở các amino acid thơm như tyrosine, phenylalanine, tryptophan). 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 4 1.2. Lịch sử phát triển  Năm 1901, thí nghiệm phomat của Vernon xác định có ít nhất hai enzyme ổn định trong dịch tụy (Vernon 1902).  Năm 1934, Kunitz và Northrop xác nhận sự hiện diện của một loại enzyme ngoài trypsin, đặt tên là chymotrypsin, có thể kết tinh chymotrypsin, cũng như tiền chất chymotrypsinogen.  Năm 1938, Kunitz cô lập các hình thức hoạt động khác nhau của chymotrypsin, xác định chúng như alpha, beta, gamma (Kunitz 1938). 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 5 1.2. Lịch sử phát triển  Năm 1948, Schwert đưa ra khối lượng phân tử của chymotrypsin và chymotrypsinogen.  Năm 1954, cơ chế ba bước của chymotrypsin thủy phân amide và ester đã được báo cáo bởi Hartley và Kilby.  Năm 1964, Hartley xác định trình tự acid amin của chymotrypsin A và thu nhận.  Năm 1968, Smillie xác định trình tự acid amin của chymotrypsin B, trong đó có 80% tương đồng với chymotrypsin A. 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 6 1.2. Lịch sử phát triển  Trong những năm 1970 – 1980, nghiên cứu về cơ chế hoạt động, và xác định sự khác biệt về trình tự amino acid giữa trypsin và chymotrypsin (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth và Polgar năm 1983, và Graf et al . 1988).  Trong những năm 1990, chymotrypsin được tinh chế từ các nguồn khác bao gồm cả cá tuyết Đại Tây Dương (Ásgeirsson và Bjarnason 1991), và lạc đà (Al-Ajlan và Bailey 1997).  Năm 2010, Ghaouar nghiên cứu tính gấp và biến tính của chymotrypsin trên nồng độ tác dụng, tương tác chymotrypsin với chất hạt nano (Jordan, 2009). 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 7 1.3. Cấu trúc − Dạng không hoạt động (chymotrypsinogen) gồm 245 amino acid. − Dipeptide 14-15 và 147-148 bị cắt bỏ, hình thành dạng hoạt động là chymotrypsin (241 amino acid). − Chymotrypsin gồm ba chuỗi protein liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide: + Chuỗi A: 13 amino acid + Chuỗi B: 131 amino acid + Chuỗi C: 97 amino acid 8 1. Tổng quan về α-chymotrypsin Cấu trúc trung tâm hoạt động 9 1. Tổng quan về α-chymotrypsin Cấu trúc α-chymotrypsin 1. Tổng quan về α-chymotrypsin 10 1.4. Đặc tính  Trọng lượng phân tử: 25.6 kDa (Wilcox 1970)  pH tối ưu: 7.8 – 8.0 (Rick 1974)  Điểm đẳng điện: 8.52 (chymotrypsinogen) và 8.33 (chymotrypsin)  Trung tâm hoạt động: nhóm OH của  Histidine (H57)  Aspartate (D102)  Serine (S195) [...]... 3 Phương pháp cố định 18  Enzyme cố định: α-chymotrypsin  Vật liệu cố định: hạt Fe3O4 nano  Chất liên kết: EDC.HCl (1-ethyl-3-(3-dimethylaminepropyl) carbodiimide hydrochloride)  3 Phương pháp cố định 19  Phản ứng cố định:  3 Phương pháp cố định 20  Các bước cố định: 3 bước Phủ polyacrylamide lên hạt Fe3O4 nano Hoạt hóa nhóm amino trên hạt nano gel Cố định enzyme  3 Phương pháp cố định 21 Bước... polyacrylamide lên hạt Fe3O4 nano  3 Phương pháp cố định 22 Bước 2: Hoạt hóa nhóm amino trên hạt nano gel  3 Phương pháp cố định 23 Bước 3: Cố định enzyme  4 Kết quả 24 − Hoạt tính riêng: 0.93 UI/mg − % hoạt tính so với enzyme tự do: 59.3% − Lượng enzyme cố định: 102 mg enzyme/ g nanogel − Số lần tái sử dụng: 6 − Nhiệt độ biến tính: >850C (cao hơn so với enzyme tự do) − Thời gian bảo quản : 36 ngày ở... phân, làm mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các dạng dịch thuỷ phân dễ hấp thu, dễ tiêu hoá  1 Tổng quan về α-chymotrypsin 16 1.6 Ứng dụng  Y học  Thủy phân protein giúp hỗ trợ phẫu thuật  Chống phù nề và kháng viêm dạng men và giảm đau hạ sốt  Làm lỏng các dịch tiết đường hô hấp ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh viêm phổi và viêm xoang  Đẩy nhanh hoạt động của tuyến bã... tái sử dụng: 6 − Nhiệt độ biến tính: >850C (cao hơn so với enzyme tự do) − Thời gian bảo quản : 36 ngày ở 40C hoạt tính không thay đổi, ở 250C mất khoảng 10% hoạt tính  5 Ứng dụng 25 α-chymotrypsin cố định được sử dụng để: − Nghiên cứu mức độ phosphoryl hóa porcine pepsin A, mô hình protein và phosphoprotein có tính acid (Barbora et al 2009) − Xúc tác sự tổng hợp các liên kết peptide trong hỗn hợp . pháp cố định  Enzyme cố định: α-chymotrypsin  Vật liệu cố định: hạt Fe 3 O 4 nano  Chất liên kết: EDC.HCl (1-ethyl-3-(3-dimethylaminepropyl) carbodiimide hydrochloride) 19  3. Phương pháp cố. pháp cố định  Phản ứng cố định: Phủ polyacrylamide lên hạt Fe 3 O 4 nano Hoạt hóa nhóm amino trên hạt nano gel Cố định enzyme 20  3. Phương pháp cố định  Các bước cố định: 3 bước . Cố định enzyme α-chymotrypsin trên chất mang nano Người trình bày Nguyễn Thị Lan Hương – 13313228 Lê Thị Mỹ Duyên - 13310294 1 BÁO CÁO BÁO CÁO Tháng 04.2014 Cố định enzyme α-chymotrypsin