Khảo sát bệnh tồn lưu tối thiểu trên bệnh nhân đa u tủy bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy tại bệnh viện chợ rẫy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGHIÊM LÝ THANH THẢO KHẢO SÁT BỆNH TỒN LƢU TỐI THIỂU TRÊN BỆNH NHÂN ĐA U TỦY BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐẾM TẾ BÀO DÒNG CHẢY TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGHIÊM LÝ THANH THẢO KHẢO SÁT BỆNH TỒN LƢU TỐI THIỂU TRÊN BỆNH NHÂN ĐA U TỦY BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐẾM TẾ BÀO DÒNG CHẢY TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY NGÀNH: NỘI KHOA (HUYẾT HỌC VÀ TRUYỀN MÁU) MÃ SỐ: 8720107 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết luận văn hoàn toàn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn NGHIÊM LÝ THANH THẢO MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT - i DANH MỤC ĐỐI CHIẾU ANH - VIỆT - ii DANH MỤC BẢNG -v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC SƠ ĐỒ - vii DANH MỤC HÌNH - viii ĐẶT VẤN ĐỀ -1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU -4 1.1 QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CHUNG  1.1.1 Dịch tễ  1.1.2 Sinh bệnh học -4  1.1.3 Chẩn đoán -5  1.1.4 Điều trị đa u tủy -7  1.1.5 Vai trò Bortezomib điều trị đa u tủy -9  1.1.6 Vai trò đánh giá MRD đa u tủy - 11  1.1.7 Các phƣơng pháp đánh giá MRD đa u tủy - 14 1.2 GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT ĐẾM TẾ BÀO DÒNG CHẢY - 17  1.2.1 Nguyên lý kĩ thuật đếm tế bào dòng chảy 17  1.2.2 Một số khái niệm 19  1.2.3 Sơ đồ phát triển dấu ấn miễn dịch 22  1.2.4 Một số ứng dụng đếm tế bào dòng chảy đa u tủy 24  1.2.5 Một số dấu ấn có ý nghĩa tiên lƣợng đa u tủy - 30  1.2.6 Tình hình nghiên cứu FC đa u tủy - 33 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 36 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 36  2.1.1 Dân số đích 36  2.1.2 Dân số mục tiêu - 36  2.1.3 Tiêu chuẩn chọn bệnh 36  2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ - 36 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36  2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 36  2.2.2 Cỡ mẫu - 37  2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu - 38  2.2.4 Quy trình phân tích dấu ấn miễn dịch 38  2.2.5 Các bƣớc phân tích dấu ấn miễn dịch tƣơng bào - 40 2.3 PHƢƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 41  2.3.1 Nguồn số liệu 41  2.3.2 Xử lý số liệu - 41  2.3.3 Định nghĩa biến số nghiên cứu - 42  2.3.4 Tóm tắt biến số - 53 2.4 VẤN ĐỀ Y ĐỨC - 46 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA BỆNH NHÂN - 47  3.1.1 Đặc điểm dịch tễ học - 47  3.1.2 Đặc điểm lâm sàng - 48  3.1.3 Đặc điểm cận lâm sàng 48  3.1.4 Phác đồ điều trị - 50  3.1.5 Đánh giá đáp ứng - 51 3.2 TỶ LỆ TƢƠNG BÀO LÚC CHẨN ĐOÁN 52 3.3 ĐẶC ĐIỂM DẤU ẤN MIỄN DỊCH - 53  3.3.1 Tỷ lệ biểu kháng nguyên 53  3.3.2 Kiểu hình tƣơng bào lúc chẩn đoán 54 3.4 MRD SAU ĐỢT ĐIỀU TRỊ 57 3.5 THỜI GIAN SỐNG CÒN - 57  3.5.1 Thời gian sống cịn tồn 12 tháng 57  3.5.2 Thời gian sống không tiến triển bệnh 12 tháng - 58 3.6 MỘT SỐ MỐI TƢƠNG QUAN - 59 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 72 4.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA BỆNH NHÂN - 72  4.1.1 Đặc điểm dịch tễ học - 72  4.1.2 Đặc điểm lâm sàng - 73  4.1.3 Đặc điểm cận lâm sàng 73  4.1.4 Điều trị đáp ứng sau điều trị - 77 4.2 TỶ LỆ TƢƠNG BÀO LÚC CHẨN ĐOÁN 78 4.3 ĐẶC ĐIỂM DẤU ẤN MIỄN DỊCH - 80  4.3.1 Kiểu hình tƣơng bào 80  4.3.2 Biểu dấu ấn - 81 4.4 MRD SAU ĐỢT ĐIỀU TRỊ 88 4.5 THỜI GIAN SỐNG CÒN - 89 4.6 MỘT SỐ MỐI TƢƠNG QUAN - 90 4.7 HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU 93 KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ - 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT TÊN ĐẦY ĐỦ TÊN VIẾT TẮT TBG Tế bào gốc TB Tƣơng bào DAMD Dấu ấn miễn dịch ii DANH MỤC ĐỐI CHIẾU ANH - VIỆT TÊN VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ - Ý NGHĨA ASO-PCR Allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction (PCR đặc hiệu allen) ASO-RQ-PCR Aallele-specific oligonucleotide real-time quantitative PCR (PCR định lƣợng đặc hiệu allen) B2M Beta-2-microglobulin BMI Body mass index (chỉ số khối thể) CD Cluster of differentiation (cụm biệt hóa) Cdkl Cyclin-dependent kinase-like CR Complete response (đáp ứng hoàn toàn) CT Computed tomography (chụp cắt lớp vi tính) DNA Deoxyribonucleic acid EBMT European Society for Blood and Marrow Transplantation (tổ chức ghép tế bào máu châu Âu) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EFS Event free survival (thời gian sống không kiện) FASC Flourescence activated cell sorters (phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang) FC Flow cytometry (đếm tế bào dòng chảy) FDA Food and Drug Administration (cục quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ) FISH Fluorescence in situ hybridization (lai chỗ phát huỳnh quang) FSC Forward scatter (tán xạ trƣớc) iii HBsAg Hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HLA.DR Human Leukocyte Antigen DR isotype (kháng nguyên bạch cầu ngƣời dạng DR) HLDA Human leukocyte differentiation antigens (kháng nguyên biệt hóa bạch cầu ngƣời) Ig Immunoglobulin (globulin miễn dịch) IgH Immunoglobulin heavy (globulin miễn dịch chuỗi nặng) IL Interleukin IMWG International Myeloma Working Group (tổ chức đồng thuận quốc tế đa u tủy) ISS International Staging System (hệ thống đánh giá giai đoạn quốc tế) IUIS International Union of Immunological Societies (hiệp hội y tế miễn dịch quốc tế) LDH Lactate dehydrogenase FC Multiparameter flow cytometry (đếm tế bào dịng chảy đa thơng số) MGUS Monoclonal gammopathy of undetermined significance (bệnh gamma globulin đơn dịng có ý nghĩa không xác định) MR Minimal response (đáp ứng tối thiểu) MRD Minimal residual disease (bệnh tồn lƣu tối thiểu) MRI Magnetic resonance imaging (chụp cộng hƣởng từ) Myc Đột biến gen Myc NCCN National Comprehensive Cancer Network (mạng lƣới ung thƣ toàn diện quốc gia) nCR Near complete response (đáp ứng gần hoàn toàn) iv NGF Next generation flowcytometry (đếm tế bào dòng chảy hệ mới) NGS Next generation sequencing (giải trình tự gen hệ mới) OS Overall survival (thời gian sống cịn tồn bộ) PAX5 Paired box protein PCR Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase) PD Progresssive disease (bệnh tiến triển) PET Positron emission tomography positron) PFS Progression free survival (thời gian sống không tiến triển bệnh) PR Partial response (đáp ứng phần) Ras Đột biến Ras R-ISS Revised International Staging System (hệ thống đánh giá giai đoạn quốc tế cải tiến) SD Stable disease (bệnh ổn định) SMM Smoldering multiple myeloma (đa u tủy không triệu chứng) SSC Side scatter (tán xạ bên) SUV Standardized uptake value (giá trị hấp thu tiêu chuẩn hóa) TCR T-cell receptor (thụ thể tế bào T) TdT Terminal deoxynucleotidyl transferase TP53 Tumor protein p53 VGPR Very good partial response (đáp ứng phần tốt) WHO World Health Organization (tổ chức y tế giới) (chụp cắt lớp phát xạ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU MRD ĐA U TỦY I Hành Số hồ sơ: Ngày thu thập: Họ tên (viết tắt): Số NV: Địa (tỉnh, thành phố): Điện thoại: Ngày NV: Lý NV: Tuổi: Nghề nghiệp: Giới: Nam II Nữ BHYT:  Có Khơng Tiền Khơng THA Khác:………… III ĐTĐ Bệnh thận mạn Lâm sàng CN(kg): Lâm sàng CC(m): BMI(kg/m2): Lúc chẩn đoán Sau đợt (Ngày…………) (Ngày………… ) Thiếu máu Khơng Có Khơng Có Xuất huyết Khơng Có Khơng Có Nhiễm trùng Khơng Có Khơng Có Đau nhức xƣơng Khơng Có Khơng Có Gan to Khơng Có Khơng Có Lách to Khơng Có Khơng Có Triệu chứng B Khơng Có Khơng Có Phù Khơng Có Khơng Có Tiểu Khơng Có Khơng Có Khác Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh IV Cận lâm sàng Lúc chẩn đoán Cận lâm sàng Sau đợt Hb (g/L) PLT (G/L) WBC (G/L) S.Neu (G/L) HbsAg Dƣơng Âm Protein niệu (mg/dl) Protein Bence jones LDH (U/L) B2M (µg/l) Creatinin (mg/dl) Ca TP (mmol/l) Albumin (g/dl) Protein TP (g/l) Acid uric (mmol/l) IgA IgG IgM Free Kappa Free Lambda Điện di protein huyết Albumin Albumin (%) Alpha1 Alpha1 Alpha2 Alpha2 Beta Beta Gamma Gamma A/G A/G Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điện di miễn dịch cố định Protid(g/l) Protid(g/l) IgG(mg/dl) IgG(mg/dl) IgA(mg/dl) IgA(mg/dl) IgM(mg/dl) IgM(mg/dl) Kappa:Có Khơng Khơng Lambda:Có Tổn thƣơng xƣơng Khơng Kappa:Có Khơng Lambda:Có Xƣơng sọ Xƣơng sọ Cột sống Cột sống Xƣơng sƣờn Xƣơng sƣờn Xƣơng tứ chi Xƣơng tứ chi Khung chậu Khung chậu % tƣơng bào tủy đồ Bất thƣờng nhiễm sắc thể t(4;14) FISH t(14;16) t(11;14) t(4;14) t(11;14) t(6;14) t(14;16) t(6;14) t(14;20) del(17p) t(14;20) del(17p) del(13q) 1q21 del(13q) 1q21 Khác:…………………… Nhóm nguy Thấp TB Cao Giai đoạn Durie-Salmon I II III Giai đoạn ISS I II III Giai đoạn R-ISS I II III Khác:…………………… % tƣơng bào FC Kiểu hình miễn dịch Bright Inter CD45 CD38 CD138 CD19 CD56 CD117 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Dim Neg Bright Inter Dim Neg Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CD27 CD28 CD81 B2M CyK CyL Điều trị V Chu kì Ngày bắt đầu Ngày kết thúc Phác đồ Tên thƣơng mại Liều Ghi (lý dùng liều 2,75 mmol/L (>11mg/dL) canxi tăng >0,25 mmol/L (>1mg/dL) giới hạn bình thƣờng  Suy thận: độ lọc creatinin < 40ml/phút creatinin huyết > 177 mol/L (> 2mg/dL)  Thiếu máu: hemoglobin < 100 g/L giảm >20 g/L giới hạn dƣới bình thƣờng  Tổn thƣơng xƣơng: nhiều tổn thƣơng xƣơng đƣợc phát hình ảnh học Một nhiều dấu hiệu ác tính sau:  Tƣơng bào tủy xƣơng 60%  Tỉ lệ chuỗi nhẹ tự bệnh/khơng bệnh 100  Có nhiều tổn thƣơng MRI > 5mm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ GIAI ĐOẠN I PHÂN GIAI ĐOẠN THEO DURIE-SALMON  Giai đoạn I: bao gồm tất tiêu chuẩn sau: o Hb > 10 g/dl o Canxi máu bình thƣờng 12 mg/dl o Tổn thƣơng xƣơng nhiều nơi o Tỷ lệ protein M cao: IgG > 7g/dl, IgA > g/dl, protein Bence Jones niệu > 12 g/24  Hai nhóm phụ cho tất giai đoạn: o Nhóm A: Creatinin huyết < mg/dl o Nhóm B: Creatinin huyết ≥ mg/dl II PHÂN GIAI ĐOẠN THEO ISS  Giai đoạn I: B2M < 3500 µg/Lvà albumin huyết > 3,5 g/dL  Giai đoạn II: không thuộc giai đoạn I III  Giai đoạn III: B2M > 5500 µg/L Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh III PHÂN GIAI ĐOẠN THEO RISS  Giai đoạn I: Tất tiêu chuẩn sau: o Albumin > 3,5g/dL o B2M < 3500 µg/L o LDH giới hạn bình thƣờng o Khơng có del(17p), t(4;14) t(14;16) FISH  Giai đoạn II: Không thuộc giai đoạn I III  Giai đoạn III: tiêu chuẩn sau: o B2M > 5500 µg/L bất thƣờng del(17p), t(4;14), t(14;16) FISH o B2M > 5500 µg/L LDH lớn giới hạn bình thƣờng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ ĐA U TỦY CÓ BORTEZOMIB Tên thuốc Liều lƣợng Thời gian dùng Đƣờng dùng Phác đồ VD, chu kì 21 ngày Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày N 1, 4, 8, 11 Tiêm dƣới da Dexamethasone 40 mg/ngày CK 1,2: N 1-4, N9-12 Uống CK 3,4: N 1, 4, 8, 11 Phác đồ VTD, chu kì 21 ngày Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày N 1, 4, 8, 11 Tiêm mạch Thalidomide 100 mg/ngày N – 21 Uống Dexamethasone 40 mg/ngày N 1, 4, 8, 11 Uống Phác đồ VCD, chu kì 21 ngày Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày N 1, 4, 8, 11 Tiêm mạch Cyclophosphamide 500 mg/ngày N 1, 8, 15 Uống Dexamethasone N 1-4, 8-11 Uống 40 mg/ngày Phác đồ VRD, chu kì 21 ngày Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày N 1, 4, 8, 11 Tiêm mạch Lenalidomide 15 mg/m2/ngày N1-14 Uống Dexamethasone 40 mg/ngày N 1, 8, 15 Uống Phác đồ VMP, chu kì tuần Bortezomib 1,3 mg/m2/ngày N 1, 4, 8, 11, 22, 25, Tiêm mạch 29, 32 Mephalan mg/m2/ngày N 1-4 Uống Prednisone 60 mg/m2/ngày N 1-4 Uống Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY Phân loại đáp ứng Đáp ứng phần tốt (VGPR) Tiêu chuẩn Một tiêu chuẩn sau:  Protein đơn dòng phát điện di cố định miễn dịch huyết nhƣng âm tính điện di đạm máu  Giảm 90% protein đơn dòng huyết Đáp ứng phần (PR) Đáp ứng tối thiểu (MR) Bệnh ổn định Giảm từ 50% đến 90% protein đơn dòng huyết Giảm protein đơn dòng huyết từ ≥ 25% đến 49% (SD) Không thỏa tiêu chuẩn VGPR, PR, MR hay PD Bệnh tiến triển Một tiêu chuẩn sau: (PD) Gia tăng 25% protein đơn dòng huyết (trị số tuyệt đối phải tăng ≥ 0,5g/dl) Chênh lệch nồng độ chuỗi nhẹ tự bệnh không bệnh phải > 10 mg/dl Tỉ lệ tƣơng bào tủy xƣơng phải >10% so với ban đầu Xuất tổn thƣơng xƣơng u tƣơng bào tiến triển rõ ràng kích thƣớc tổn thƣơng xƣơng cũ - ≥ 50% tƣơng bào tủy đồ Tăng canxi tiến triển (chỉ số canxi huyết > 11,5 mg/dl > 2,5 mmol/l) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC Quy trình xét nghiệm chẩn đốn phân loại bệnh lý dòng tƣơng bào bệnh viện Chợ Rẫy Xử lý mẫu - Ghi mã số bệnh nhân kháng thể đơn dòng tƣơng ứng lên ống nghiệm - Hút loại kháng thể đơn dòng nhuộm ngoại bào (5 µL 20 µL tùy loại kháng thể) vào ống nghiệm Vortex lọ kháng thể trƣớc sử dụng - Rửa mẫu với dung dịch Sheath: hút 500 µL mẫu cho ml dung dịch Sheath, ly tâm 300g phút, hút bỏ dịch Rửa lần Nhuộm ngoại bào - Cho 50 µL mẫu vào ống nghiệm có thuốc nhuộm - Vortex nhẹ tube - Ủ 15 phút tối nhiệt độ phịng - Sau ly giải hồng cầu với ml dung dịch FASC Lysing (1X) Vortex - Đậy kín, ủ tối 15 phút 37 độ C Sau ly tâm 300g phút Đổ bỏ dịch - Thêm ml dung dịch Sheath vào tube, vortex, tiếp tục ly tâm 300g phút Sau ly tâm, đổ bỏ dịch - Sau thêm 350 µL dung dịch Sheath vào tube Vortex, thu thập mẫu Nhuộm nội bào - Cho 50 µL mẫu vào ống nghiệm có thuốc nhuộm - Vortex nhẹ tube - Ủ 15 phút tối nhiệt độ phòng - Thêm 100 µL dung dịch A (trong IntraSure) (dung dịch A phải vortex để nhiệt độ phòng trƣớc sử dụng) Vortex Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Ủ tối nhiệt độ phịng phút - Sau ly giải hồng cầu với ml dung dịch FASC Lysing (1X) Vortex - Ủ tối 15 phút nhiệt độ phòng - Ly tâm 800g phút Đổ bỏ dịch Thêm 50 µL dung dịch B - Cho 20 µL thuốc nhuộm nội bào vào tube Vortex - Ủ tối 15 phút nhiệt độ phòng - Thêm ml dung dịch Sheath Vortex - Ly tâm 800g phút Đổ bỏ dịch - Sau thêm 350 µL dung dịch Sheath vào tube Vortex, thu thập mẫu Chuẩn bị máy - Kiểm tra bình đựng dung dịch Sheath, dung dịch Shutdown Solution, dung dịch Clean (bên dƣới máy) - Mở máy (nhấn nút công tắc màu xanh phía bên trái máy) mở máy vi tính, hình ra, nhập username password để khởi động phần mềm - Chọn phần mềm BD FACS Diva, tạo thƣ mục để chạy mẫu - Trong hộp thoại “Acquistion Dashboard”: - Chọn “Acquire” để kiểm tra tín hiệu, “Record data” để thu thập mẫu - Mẫu thu thập đƣợc ghi nhận dƣới dạng biểu đồ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC Quy trình xét nghiệm đánh giá tồn lƣu tế bào ác tính dịng tƣơng bào bệnh viện Chợ Rẫy Xử lý mẫu - Ghi mã số bệnh nhân kháng thể đơn dòng tƣơng ứng lên ống nghiệm - Hút loại kháng thể đơn dịng nhuộm ngoại bào (5 µL 20 µL tùy loại kháng thể) vào ống nghiệm Vortex lọ kháng thể trƣớc sử dụng - Rửa mẫu với dung dịch Sheath: hút 500 µL mẫu cho ml dung dịch Sheath, ly tâm 300g phút, hút bỏ dịch Rửa lần Nhuộm ngoại bào - Cho 100 µL mẫu vào ống nghiệm có thuốc nhuộm - Vortex nhẹ tube - Ủ 15 phút tối nhiệt độ phịng - Sau ly giải hồng cầu với ml dung dịch FASC Lysing (1X) Vortex - Đậy kín, ủ tối 15 phút 37 độ C Sau ly tâm 300g phút Đổ bỏ dịch - Thêm ml dung dịch Sheath vào tube, vortex, tiếp tục ly tâm 300g phút Sau ly tâm, đổ bỏ dịch - Sau thêm 350 µL dung dịch Sheath vào tube Vortex, thu thập mẫu Nhuộm nội bào - Cho 100 µL mẫu vào ống nghiệm có thuốc nhuộm - Vortex nhẹ tube - Ủ 15 phút tối nhiệt độ phòng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Thêm 100 µL dung dịch A (trong IntraSure) (dung dịch A phải vortex để nhiệt độ phòng trƣớc sử dụng) Vortex - Ủ tối nhiệt độ phịng phút - Sau ly giải hồng cầu với ml dung dịch FASC Lysing (1X) Vortex - Ủ tối 15 phút nhiệt độ phòng - Ly tâm 800g phút Đổ bỏ dịch Thêm 50 µL dung dịch B - Cho 20 µL thuốc nhuộm nội bào vào tube Vortex - Ủ tối 15 phút nhiệt độ phòng - Thêm ml dung dịch Sheath Vortex - Ly tâm 800g phút Đổ bỏ dịch - Sau thêm 350 µL dung dịch Sheath vào tube Vortex, thu thập mẫu Chuẩn bị máy - Kiểm tra bình đựng dung dịch Sheath, dung dịch Shutdown Solution, dung dịch Clean (bên dƣới máy) - Mở máy (nhấn nút cơng tắc màu xanh phía bên trái máy) mở máy vi tính, hình ra, nhập username password để khởi động phần mềm - Chọn phần mềm BD FACS Diva, tạo thƣ mục để chạy mẫu - Trong hộp thoại “Acquistion Dashboard”: - Chọn “Acquire” để kiểm tra tín hiệu, “Record data” để thu thập mẫu - Mẫu thu thập đƣợc ghi nhận dƣới dạng biểu đồ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn