Nghiên cứu tổng hợp tinh chế và thử nghiệm cisplatin để làm thuốc điều trị ung thư

Các thuốc chống ung thư có chứa Cisplatin tác dụng bằng cách gắn với ADN, qua đó ức chế tổng hợp ADN, Cisplatin có pha - vòng không đặc hiệu, mặc dù cơ chế tác dụng chủ yếu của Cisplatin

Công ty cổ phần dược TW mediplantex

Báo cáo tổng kết khoa học và công nghệ

đề tài cấp nhà nước

nghiên cứu tổng hợp tinh chế

và thử nghiệm cisplatin để làm thuốc

1 tổng quan

1.1 Thuốc Cisplatin

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Cisplatin có tên khoa học là: Cis-diamminedichloroplatinum (II) là một phức chất chứa nguyên tử trung tâm platin, được bao quanh trong một mặt phẳng, bởi 2 nguyên tử Clo và 2 nhóm amoniac ở vị trí cis

Cl NH3 Cl NH3

Cl NH3 NH3 Cl

Cis-diammine dichloro Trans-diammine dichldro Platinum (II) Platinum (II)

Hình 1.1 : Công thức cấu tạo của Cisplatin

Chỉ có đồng phân cis mới có hoạt tính chống ung thư, còn đồng phân trans không có hoạt tính chống ung thư

Trên thế giới, Cisplatin được Peyrone điều chế năm 1845 vì thế còn được gọi

là muối peyrone [1] Trong một thời gian dài Cisplatin chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu để điều chế các phức vuông phẳng của platin, phục vụ cho nghiên cứu cơ bản hoá học phức chất của platin Năm 1965 Rosenberg và những người cộng tác đã phát hiện ra hoạt tính chống ung thư của Cisplatin [2] Cisplatin ức chế chọn lọc lên quá trình tổng hợp ADN và kìm hãm tổng hợp ARN ở tế bào ung thư Năm 1978 Cisplatin được sử dụng trong lâm sàng [3] và đã được dùng có hiệu quả để chữa các bệnh ung thư phổi, buồng trứng, bàng quang, ung thư đầu, mặt, cổ, thực quản, vòm họng, giáp trạng, u tinh hoàn Cisplatin đã được nhiều nước sử dụng và đưa vào Dược điển như Dược

điển châu âu 1997 trang 647, Dược điển Mỹ USP 22, USP 23, trang 312, 397, Dược điển Anh BP 2000, Dược điển Pháp, Trung Quốc, Nhật Bản, Nga, Hiện nay trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều phương pháp tổng hợp Cisplatin và nghiên cứu hoạt tính sinh học của Cisplatin bằng các phương pháp khác nhau

1) AgNO3, 2H2O 2) 2KCl

4KI

100%

2NH3 4KI

Việc tổng hợp Cisplatin có 2 phương pháp chính được ứng dụng trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp:

1) Tác dụng potassium tetrachloroplatinate (II) với amoniac, phương pháp này

đã được Kauffman (Mỹ) [4], Brauer (Đức) [5] và Frantiser (Tiệp) [6] công bố

Cl Br

I ư > ư > ư >

Như vậy trong phản ứng:

60%

3 3

2

NH X

Pt

NH X

cis NH NH

X Pt

X X

NH X

X

Pt

X X

x = Cl, I

đều dẫn đến sự tạo thành đồng phân cis là sản phẩm chính, nhưng do hiệu ứng trans của Iư > Clư nên khi X = I thì phản ứng thế xảy ra dễ dàng hơn, hầu như không có sự tạo thành đồng phân trans và các sản phẩm phụ khác, thu

được Cisplatin với hiệu suất ~ 90% tính từ K2[PtCl4] và rất tinh khiết

Trong nước:

Năm 1998 GS.TS Nguyễn Hữu Định, Giảng viên chính khoa Hóa trường DDHKHTN- ĐHQGHN đã tiến hành nghiên cứu phương pháp tổng hợp và tính chất vật lý, hóa học các hợp chất cơ kim của các kim loại chuyển tiếp, trong đó

có phức chất Platin như Cisplatin Đây là nội dung nghiên cứu cơ bản trong khuôn khổ của đề tài NN 42-24b, chương trình KT.04 Kết quả nghiên cứu đã thu được Cisplatin ddat độ tinh khiết cao

Ngày 1 – 12 - 2001 Công ty Dược liệu TWI (nay là công ty CP Dược TW Mediplantex), trường ĐHKHTN và bệnh viện K đã tổ chức hội thảo, nhất trí phối hợp 3 cơ quan, đã có phân công cụ thể để nghiên cứu sản xuất thuốc chống ung thư Cisplatin

Công ty Dược liệu TWI đã bàn bạc và hợp đồng với bộ môn Dược lý trường Đại học Y khoa Hà Nội để kết hợp thử tác dụng dược lý thực nghiệm của Cisplatin về độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, ảnh hưởng của thuốc lên các

bộ phận gan, thận, niêm mạc ruột, ảnh hưởng của thuốc lên chức năng sinh hoá máu, nước tiểu, men gan,

Công ty Dược liệu TWI phối hợp với Viện K để thử tác dụng dược lý lâm sàng của Cisplatin sản xuất tại công ty

Công ty Dược liệu TWI hợp đồng với Khoa Sinh trường Đại học KHTN- ĐHQG để thử tác dụng dược lý thực nghiệm của Cisplatin trên mô hình gây ung thư thực nghiệm cho chuột và thỏ

+ Ngoài ra trong nước còn có TS Trần Thị Đà [9] Trường Đại học Sư phạm I Hà Nội cũng đã công bố một số kết quả nghiên cứu phức platin, trong

đó đã tổng hợp được Cisplatin theo Patent của Mỹ [8] và thu được hiệu suất 24% tính từ K2[PtCl4] và sản phẩm cũng chưa được kiểm nghiệm

1.1.2 Cơ chế tác dụng của Cisplatin

Cisplatin là thuốc có đặc tính sinh hoá giống với các thuốc alkyl hoá hai chức năng Các thuốc chống ung thư có chứa Cisplatin tác dụng bằng cách gắn với ADN, qua đó ức chế tổng hợp ADN, Cisplatin có pha - vòng không đặc hiệu, mặc dù cơ chế tác dụng chủ yếu của Cisplatin là ức chế tổng hợp ADN, nhưng các cơ chế khác có thể thúc đẩy tăng miễn dịch khối liên quan đến hoạt tính chống ung thư của nó

Tính trung hoà về điện và cấu hình cis cần cho phức hợp Cisplatin sử dụng cho hoạt tính chống ung thư, ở nồng độ Clorua trong huyết tương tương

đối cao phức hợp Cisplatin được cho là không bị ion hoá, cho phép nó đi qua màng tế bào Trong nội bào sự có mặt của nồng độ thấp Clorua, dây nối Clorua của phức hợp bị thay thế bởi nước dẫn đến sự hình thành các phức hợp Platin điện dương động và phản ứng với các vị trí ái nhân trên ADN Cisplatin gắn với ADN và ức chế ADN tổng hợp Protein và ARN cũng bị ức chế nhưng yếu hơn Thuốc gây các liên kết chéo mạnh trong và giữa các ADN với các liên kết chéo trong chuỗi do hình thành các vòng khép giữa các phức hợp Platin bị hoạt hoá của thuốc và khu vực các chuỗi base, các liên kết chéo ADN – Protein cũng được hình thành Tầm quan trọng của các liên kết chéo trong hoặc giữa các chuỗi ADN đối với hoạt tính chống ung thư được xác định rõ ràng Tuy nhiên, liên kết giữa các chuỗi ADN liên quan chặt chẽ với độc tính của thuốc đối với tế bào, liên kết chéo giữa các chuỗi trong chuỗi xoắn ADN cùng xẩy ra, các liên kết chéo giữa và trong các chuỗi ADN là các liên kết bền vững không dễ bị phá vỡ trong khi cơ chế qua đó chuỗi kép AND sử dụng tác dụng tế bào của chúng thì chứng cứ hạn chế chỉ ra rằng sự khép vòng Protein

có thể ức chế sự sao chép, phiên mã ADN và cuối cùng là sự phân chia tế bào

Cisplatin cũng có đặc tính ức chế miễn dịch, nhạy cảm phóng xạ và kháng khuẩn

Cần tiếp tục nghiên cứu để làm sáng tỏ hơn về mức độ kháng chéo giữa Cisplatin và Carboplatin Mặc dù một số khối u kháng Cisplatin có thể đáp ứng với Carboplatin, nhưng mức độ kháng chéo cao xảy ra giữa hai thuốc Cơ chế kháng tế bào của các thuốc chống ung thư có chứa Platin vẫn chưa được sáng tỏ đầy đủ, nhưng sự kháng có thể liên quan đến giảm hấp thu tế bào của thuốc hoặc thúc đẩy sửa chữa ADN và có thể liên quan đến tăng nồng độ tế bào của hợp chất Sulhydryl (thyol) gồm Glutathione Glutathyone đóng vai trò thiết yếu trong bảo vệ tế bào khỏi tác dụng của hơi độc do các chất độc gồm cả các thuốc chống ung thư Tăng nồng độ các hợp chất Sulhydryl này đã

được biết ở các dòng tế bào kháng Cisplatin và các chất tương tự Tăng sửa chữa các khép vòng AND bởi phức hợp Platin cũng đã được biết ở dòng các tế bào kháng Vai trò liên quan của các cơ chế kháng này và mối liên quan của chúng với những thất bại điều trị ở bệnh nhân không đáp ứng với các thuốc chống ung thư chứa Platin vẫn chưa được xác định đầy đủ

1.1.3 Dược động học của Cisplatin

Phân bố thuốc: Sau khi tiêm tĩnh mạch thuốc nhanh chóng đi vào các mô,

đạt nồng độ cao nhất ở thận, gan, buồng trứng và phổi

Gắn với protein huyết tương >90%

Thời gian bán huỷ: Ban đầu 20-30 phút; Beta: 60 phút; cuối cùng: 24 giờ; thời gian bán huỷ thứ phát: 44-73 giờ

Chuyển hoá: Chuyển hoá không có sự tham gia của các enzym; thuốc bị làm bất hoạt bởi các nhóm Sulfthydryl; Cisplatin có thể gắn đồng hoá trị với Glutathione và Thiosulfate

Đào thải: >90% bài tiết qua nước tiểu và 10% qua mật

1.1.4 Chỉ định

Ung thư tinh hoàn, buồng trứng, nội mạc tử cung, cổ tử cung, bàng quang,

đầu cổ, dạ dày, ruột, phổi, ung thư xương và phần mềm

1.1.5 Chống chỉ định

Mẫn cảm với Cisplatin hoặc các hợp chất có Platin

Phụ nữ có thai hoặc cho con bú

Creatinin máu > 200 àmol/l

Chống chỉ định tương đối với bệnh nhân có thương tổn ở thận, thiếu máu hoặc suy tuỷ

1.1.6 Liều dùng

Liều dùng rất khác nhau tuỳ thuộc loại bệnh, phác đồ điều trị và mục đích

điều trị, có thể từ 15 - 120mg/m2 da cơ thể

1.1.7 Tác dụng phụ của Cisplatin

Cisplatin có thể gây ra các tác dụng phụ rất nặng, mức độ nặng tuỳ thuộc vào liều dùng Các cơ quan bị tổn thương như: tuỷ xương, gan, ống thận, thần kinh

• Phản vệ : Có thể xuất hiện trong vòng vài phút sau khi dùng Cisplatin Và

có thể khắc phục bằng tiêm tĩnh mạch Epinephrin, Corticosteroid và các thuốc kháng Histamin

• ức chế tuỷ: Mức độ nhẹ đến vừa tuỳ theo liều lượng thuốc Thiếu máu

hay gặp và có thể có tan huyết Thiếu máu có thể cải thiện khi dùng Erythropoietin

• Buồn nôn và nôn: Nặng và thường khó điều trị, xuất hiện trong vòng 1

giờ bắt đầu điều trị và kéo dài 8- 12 giờ, đôi khi các triệu chứng này kéo dài hơn Sử dụng thuốc chống nôn để hạn chế các triệu chứng này như dexamethasone, odansetron hoặc metoclopramide, lopazepam

• Hoại tử ống thận kèm thoái hoá ống thận và phù kẽ, đặc biệt khi truyền dịch và lợi niệu không đủ Độc tính với thận thường xuất hiện vào tuần thứ hai sau điều trị, biểu hiện bằng tăng ure, creatinin máu Khắc phục bằng truyền dịch và thuốc lợi niệu manitol hoặc furosemide

• Độc với cơ quan thính giác: ù tai hay xuất hiện ngay khi dùng liều đầu tiên, thường khỏi, chỉ kéo dài vài giờ đến một tuần sau khi ngừng điều trị Xảy

ra khi thuốc tích luỹ hoặc dùng liều cao Giảm thính lực ở tần số 4000- 8000

Hz ở trẻ em độc tính ở tai nặng hơn

• Các bất thường về điện giải nặng gồm: Giảm natri, magiê, canxi, kali

• Tăng acid uric máu hiếm gặp, song song với tình trạng suy thận

• Gây độc thần kinh ngoại biên: Dị cảm đầu chi, rung giật, yếu cơ, mất vị giác, chuột rút, co giật

• Quá liều Cisplatin cấp có thể gây tử vong, gây suy thận cấp, độc cho tai, có thể gây điếc không hồi phục, giảm sản tuỷ nặng, buồn nôn khó chữa, nôn và viêm thần kinh

- Độc tính gan ít xảy ra (suy gan: tăng nồng độ transaminase huyết thanh, tăng thời gian đông máu, thời gian prothrombin)

- Độc tính đối với thần kinh trung ương: Co giật toàn thân, ảo giác, loạn vận ngôn, dự cảm, suy yếu vị giác

- Đối với mắt: Thay đổi thị giác, mắt mờ, thay đổi cảm nhận mầu, có thể gây hỏng võng mạc, bong võng mạc

- Giảm sản tuỷ, độc tính với thận, với mắt và thần kinh có thể hồi phục một phần hoặc toàn bộ Tuy nhiên độc tính cho tai (Ví dụ: mất nghe cảm giác song song) thường có thể hồi phục và ở bệnh nhân bị quá liều không phải do dùng đường tĩnh mạch (Ví dụ: khi Cisplatin được dùng thay thế Carboplatin một cách vô ý) thì suy thận cũng có thể hồi phục

1.2 Thuốc 5-Fu [3,4]

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi sử dụng 5-FU như là một hóa chất phối hợp với Cisplatin để điều trị ung thư vùng đầu cổ nói chung và ung thư vòm họng nói riêng Dưới đây là một số vấn đề tổng quan về 5-FU

1.2.1 Tờn chung quốc tế

Fluorouracil, cỏc tờn khỏc: 5-Fluorouracil, 5-FU

1.2.2 Cơ chế tỏc dụng

Fluorouracil là thuốc chống chuyển hoỏ pyrimidin cú Fluoro, thuộc nhúm thuốc chống ung thư kỡm tế bào Fluorouracil gõy tỏc dụng chống chuyển hoỏ là do:

- Trước hết Fluorouracil bị chuyển hoỏ thành 5-fluorodeoxouridin

5-monophosphate, chất này với sự cú mặt của N-methylentrahydrofolate liờn kết với men thymidinlate synthetase phong bế phản ứng methylhoỏ acid deoxyuridylic thành acid thymidylic, do đú ngăn cản tổng hợp acid deoxyribonucleic (DNA)

- Mặt khỏc fluorouracil bị phosphoryl hoỏ thành fluorouracil triphosphate

và chiếm chỗ của uracil trong RNA gõy sự sai lạc trong mó di truyền dẫn tới

ức chế phõn bào

1.2.3 Dược động học

Phõn bố thuốc: Sau khi tiờm tĩnh mạch, thuốc nhanh chúng phõn bố vào cỏc mụ khối u, niờm mạc tiờu hoỏ, tuỷ xương, gan và cỏc mụ khỏc Dễ dàng thấm qua hàng rào mỏu nóo

Thời gian bỏn thải trung bỡnh 16 phỳt (8-20 phỳt) tuỳ thuộc vào liều dựng 7-20% thuốc thải trừ qua thận ở dạng khụng biến đổi sau 6 giờ, trong

đú 90% thải trừ trong giờ đầu tiờn Phần cũn lại chuyển hoỏ qua gan tạo thành dạng khụng cũn hoạt tớnh và được thải trừ qua thận sau 3-4 giờ

1.2.4 Tương tỏc thuốc

Phối hợp 5-FU và leucovorin làm tăng hiệu quả của thuốc, cơ chế chưa rừ

1.2.5 Chỉ định

UT biểu mô tuyến vú, UT Đường tiêu hoá, UT đầu cổ, UT Bàng quang,

UT da tế bào đáy và tế bào vảy

- Dị ứng: shock phản vệ và dị ứng toàn thân

- Trên da và niêm mạc như viêm niêm mạc đường tiêu hoá

- Rụng tóc: ít gặp

- Tăng sắc tố của da mặt, tay và tĩnh mạch nơi tiêm truyền thuốc

+ Hội chứng bàn tay bàn chân: có nhiều mức độ, từ dị cảm đầu chi, nổi ban đỏ, da khô bong vảy, tới nứt loét gan bµn chân bàn tay

+ Ức chế tuỷ xương: BC giảm thấp nhất vào ngày10-14 của chu kỳ điều trị

+ Buồn nôn và nôn có thể xảy ra nhưng không nặng

+ Ph©n vïng dÞch tÔ gåm: Khu vùc cã nguy c¬ rÊt cao lµ MiÒn nam Trung Quèc vµ c¸c n−íc §«ng nam ¸, khu vùc cã nguy c¬ m¾c trung b×nh gåm c¸c n−íc vïng B¾c Phi, nguy c¬ thÊp ë c¸c n−íc Ch©u ©u, Ch©u Mü

- Ở Việt Nam: Tỷ lệ mắc UT vòm họng đứng hàng thứ năm sau UT phổi, gan, dạ dày, đại trực tràng, nam là 6,9/100000 dõn, ở nữ là 2,7/100000 dõn

- Chẩn đoán bệnh ung thư vòm họng thường bị chậm do đặc điểm về giải phẫu, khó khám và trình độ đân trí còn thấp, vì vậy bệnh nhân thường đến khám và điều trị ở giai đoạn muộn

- Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, nhưng độ tuổi hay gặp nhất là 40-50 Tỷ lệ mắc bệnh ở nam là 26,5/1000, ở nữ là 10,2/1000

1.3.2 Cỏc triệu chứng lõm sàng và cận lõm sàng bệnh ung thư vũm họng

Triệu chứng lõm sàng [6,7,8,9,28]

ư Đau đầu õm ỉ, một bờn, khụng thành cơn Ù tai một bờn, ự tai tiếng trầm như tiếng xay thúc hoặc tiếng ve kờu Ngạt mũi một bờn kốm theo cú chảy mỏu mũi lờ lờ mỏu cỏ Cỏc triệu chứng này cú đặc điểm thường ở cựng bờn, tăng dần

ư Nổi hạch cổ, hạch gúc hàm là vị trớ hay gặp nhất, đụi khi đõy là triệu chứng đầu tiờn của bệnh

ư Liệt cỏc dõy thần kinh sọ nóo: Cỏc DTK cú thể bị tổn thương đơn độc Dõy số V và VI hay bị tổn thương và tổn thương sớm nhất Ở giai đoạn muộn, tổn thương tạo thành cỏc hội chứng như: Hội chứng khe bướm (liệt cỏc dõy vận nhón), hội chứng lỗ rỏch sau (liệt cỏc DTK số IX, X, XI), hội chứng đỏ bướm (liệt cỏc DTK số VI, VII), hội chứng Garcin (liệt cỏc DTK sọ một bờn)

[6,7,27,37]

Triệu chứng cận lõm sàng [6,7,8,9,28,10,37]

ư X Quang: chụp phim Hirtz, blondeau, tốt nhất là chụp CTscan và MRI

để đỏnh giỏ mức độ xõm lấn của u ra xung quanh và vào xương nền sọ

ư Cỏc xột nghiệm tỡm khỏng thể như IgA/VCA, IgA/EA, IgA/EBNA

ư Ngoài ra cần làm cỏc xột nghiệm khỏc để đỏnh giỏ tỡnh trạnh toàn thõn như siờu õm ổ bụng, XQ phổi, chụp xạ hỡnh xương,

1.3.3 Chẩn đoỏn bệnh ung thư vũm họng [6,11,28]

- Chẩn đoỏn xỏc định

Chẩn đoỏn xỏc định bệnh dựa vào cỏc triệu chứng LS và CLS như trờn

- Chẩn đoán mô bệnh học

Gồm các típ mô bệnh học sau:

+ UTBM không biệt hoá: là típ hay gặp nhất

+ UTBM vảy không sừng hoá

+ UTBM vảy sừng hoá

+ UTBM tuyến nang

+ Các loại khác: lymphomalin, plasmocytoma, melamoma…

T2 khối u xâm lấn mô mềm

T2a: khối u xâm lấn họng miệng và hoặc họng mũi nhưng chưa xâm lấn thành họng

T2b : khối u đã xâm lấn thành họng

T3 khối u xâm lấn xương và hoặc các xoang cạnh mũi

T4 khối u xâm lấn não, thần kinh sọ não, hố thái dương, hốc mắt, hạ

N2a di căn nhiều hạch cổ cùng bên ≤3cm

N2b di căn hạch cổ đối bên hoặc 2 bên ≤3cm

N2c di căn hạch cổ từ 3 đến 6 cm

N3 di căn hạch cổ >6cm

• M (di căn xa)

Mx không đánh giá được di căn xa

1.3.4 Điều trị bệnh ung thư vũm họng

Điều trị bệnh tùy thuộc vào giai đoạn bệnh Xạ trị là phương pháp chính

điều trị bệnh ung thư vòm họng bao gồm cả u nguyên phát và hạch, liều và kích thước trường chiếu phụ thuộc vào vị trí, kích thước của u và hạch Xạ trị

đơn thuần có thể kiểm soát được 50% số bệnh nhân Hóa chất nhằm mục đích

điều trị bổ trợ cho xạ trị Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hóa chất phối hợp với xạ trị làm tăng tỉ lệ đáp ứng, cải thiện thời gian sống không bệnh và thời gian sống thêm Nhiều hóa chất được nghiên cứu trong điều trị ung thư vòm họng như Cisplatin, 5-FU Doxorubicin, Bleomycin Methotrexate và gần đây là nhóm taxane Các hóa chất này có thể dùng đơn độc hoặc phối hợp, nhưng cho tới nay phác đồ chuẩn trong điều trị hóa chất tân bổ trợ cho ung thư vùng

đầu cổ nói chung và ung thư vòm họng nói riêng vẫn là sự phối hợp giữa Cisplatin và 5-FU Điều trị hóa chất tân bổ trợ bằng Cisplatin và 5-FU phối hợp với xạ trị đạt tỉ lệ đáp ứng toàn bộ là 93%, thời gian sống thêm 6 năm là 67% [12,1,1921,23,27,30,34,40]

Phỏc đồ điều trị cụ thể cho giai đoạn III, IV: Điều trị phối hợp hoỏ chất và

xạ trị

1.4 CáC CHỉ TIÊU NGHIÊN CứU

− Trước điều trị : Tuổi Giới Đau đầu: khụng đau, đau nhẹ, vừa, nặng

Ngạt mũi: tắc hoàn toàn, khụng hoàn toàn Ù tai: nhẹ, nặng Chảy mỏu mũi:

cú, khụng Triệu chứng thần kinh: cú, khụng Hạch: vị trớ, số lượng, kớch

thước U: mức độ lan rộng Giai đoạn bệnh: theo UICC 1987

- Đỏnh giỏ đỏp ứng sau mỗi đợt điều trị hoỏ chất và sau 3 đợt Dựa theo tiêu

chuẩn của tổ chức y tế thế giới chia làm 4 mức độ:

• Đỏp ứng hoàn toàn (Complete response): khối u và hạch tan hoàn toàn ớt nhất kộo dài trong 4 tuần và khụng xuất hiện tổn thương mới

• Đỏp ứng một phần (Partial response): giảm ≥50% kớch thước lớn nhất của tất cả cỏc tổn thương và khụng xuất hiện thờm tổn thương mới trong

ớt nhất 4 tuần Khi cú nhiều hơn 3 tổn thương thỡ cú thể đỏnh giỏ dựa vào tổn thương đại diện

• Bệnh khụng thay đổi (Stable disease): khi kớch thước của cỏc tổn thương giảm đi dưới 50% hoặc tăng lờn khụng quỏ 25%

• Bệnh tiến triển (Progression disease) : Tăng kớch thước của cỏc tổn thương tăng trờn 25% hoặc xuất hiện bất kỳ tổn thương mới

− Đỏnh giỏ độc tớnh của hoỏ chất sau mỗi đợt điều trị theo 5 mức độ của WHO Sau ghi nhận độc tớnh, mọi BN đều được điều trị đầy đủ cỏc độc tớnh

Hb (g/l) 120-140 100- BT 80-99 65-79 <65

TC (G/l) ≥100 75-99 50-74,9 25-49,9 <25

1.4.2 Độc tính trên gan thận

B¶ng 1.2: §éc tÝnh trªn gan thËn

Độ Độ 0 Độ 1 Độ 2 Độ 3 Độ4 SGOT

(mmol/l) <7,5 7,6-10,9 11-18 >18 >18 Creatinin

Viêm

miệng Không

Nổi ban, chợt, loét nhẹ

Nổi ban, phù nề, loét nhưng còn

ăn được

Nổi ban, phù nề, loét, không thể ăn được

Cần nuôi dưỡng bằng đường tĩnh mạch

Tiêu chảy Không 2-3

lần/ngày

4-6 lần/ngày 7-9 lần/ngày

≥10 lần/ngày

Rụng tóc Không

rụng Rụng nhẹ

Rụng gần hết hoặc toàn bộ

Như độ 2 Như độ 2

1.5 Phân loại chỉ số toàn trạng Karnofky

100% Không có triệu chứng rõ ràng của bệnh, khả năng hoạt động mạnh 90% Khả năng hoạt động bình thường, triệu chứng bệnh tối thiểu

80% Khả năng hoạt động bình thường nhưng phải cố gắng Có mặt của

triệu chứng của bệnh

70% Không có khả năng hoạt động hoặc làm việc bình thường nhưng còn

tự phục vụ

60% Cần có sự trợ giúp cần thiết hoặc chăm sóc y tế

50% Cần có sự trợ giúp rất lớn và được chăm sóc y tế thường xuyên 40% Không tự phục vụ tối thiểu, cần có sự trợ giúp liên tục và được chăm

2 mục tiêu và Nội dung nghiên cứu

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

1) ứng dụng công nghệ tiên tiến, để tạo ra qui trình công nghệ tổng hợp và tinh chế Cisplatin làm thuốc điều trị ung thư đạt tiêu chuẩn quốc tế BP 2001 2) Tạo ra sản phẩm điều trị ung thư trong nước có hiệu quả chữa bệnh cao, giá thành hạ so với nhập ngoại từ 20 –30%, giảm thuốc nhập khẩu, chủ động trong điều trị, có ý nghĩa lớn về kinh tế, xã hội, khoa học công nghệ

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tổng hợp, tinh chế Cisplatin

Nghiên cứu quy trình khoa học công nghệ tổng hợp Cisplatin

Nghiên cứu qui trình sản xuất trong nước, môi trường thực hành sản xuất an toàn đạt hiệu suất cao, giá thành hạ, tạo công ăn, việc làm cho người lao động

Nghiên cứu quy trình tinh chế Cisplatin

Cisplatin đạt tiêu chuẩn dược dụng dùng để làm thuốc

Nghiên cứu quy trình thu hồi platin

Từ platin thu hồi sẽ thực hiện dãy chuyển hoá:

Phát triển (thu hồi) → H2PtCl6 6H2O → K2 [PtCl6] → K2 [PtCl4]

2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu và thành phẩm

Cisplatin

Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm

Công ty CP Dược TW Mediplantex kết hợp với Viện kiểm nghiệm TW xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Cisplatin đạt tiêu chuẩn tương đương tiêu chuẩn BP 2001

Nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu và thành phẩm Cisplatin

Theo phương pháp theo dõi định kỳ ở điều kiện thường

2.2.3 Thử Dược lý thực nghiệm

- Thử độc tính cấp LD 50

- Thử độc tính bán trường diễn

- Nghiên cứu tác động của thuốc lên chức năng gan, thận, niêm mạc ruột

- Thử tác động của thuốc lên quá trình sinh hoá máu, nước tiểu, men gan, và các dịch thể khác

2.2.4 Thử hoạt tính chống ung thư trên mô hình tế bào ung thư thực

nghiệm

- Thử tác động của thuốc lên súc vật chuột, thỏ trên mô hình gây ung thư thực nghiệm in vivo

- Gây ung thư: Dùng tế bào Sarcoma180 tiêm vào súc vật

- Phương pháp tác động thuốc: Để nghiên cứu hiệu ứng phòng bệnh của thuốc, chúng tôi đã đưa thuốc vào cơ thể động vật thí nghiệm qua đường thực quản (peros) trước khi cấy truyền ung thư ít nhất một tuần Còn để nghiên cứu tác dụng điều trị, thuốc được đưa vào cơ thể theo hai cách peros và tiêm trực tiếp vào xoang bụng chuột (i.p)

- Phương pháp xác định GR (%) và ILS (%): Phương pháp xác định tỷ số phát triển u và thời gian sống thêm của động vật thí nghiệm đã trình bày chi tiết trong các công trình truớc đây của chúng tôi

- So sánh hiệu ứng kháng u của Cisplatin Mediplantex với Cisplatin nước

ngoài trên mô hình nuôi cấy tế bào ung thư in vitro

Chứng minh được tác dụng của Cisplatin sản xuất tại Việt Nam

2.2.5 Pha chế dung dịch thuốc tiêm truyền Cisplatin lọ 50mg/100ml

Xây dựng dây chuyền công nghệ sản xuất thuốc tiêm Cisplatin

Sản xuất 1000 lọ thuốc chống ung thư Cisplatin theo yêu cầu của đề tài Lập dự án xây dựng dây chuyền công nghệ hiện đại sản xuất thuốc chống ung thư

Cơ sở pha chế, đóng gói thuốc tiêm phải đạt GMP, có hệ thống lọc khí, cấp khí sạch cho dây chuyền sản xuất, có hệ thống điều hoà khí nội bộ cho

phòng pha chế, đóng gói thuốc tiêm Phòng pha chế, đóng gói phải đảm bảo vô khuẩn, có đủ diện tích cho cơ sở pha chế

Hình 2.1: Sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất thuốc tiêm Cisplatin

- Kỹ thuật pha chế đặc biệt, với tỷ lệ, nồng độ các chất phụ tối ưu nhất

để phát huy tối đa hiệu lực của thuốc tiêm Cisplatin Từ đó hoàn thiện dây chuyền công nghệ sản xuất thuốc tiêm Cisplatin tại Việt Nam

2.2.6 Thử nghiệm lâm sàng

- Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc Cisplatin điều chế trong nước

đối với bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vòm họng giai đoạn muộn

- Đánh giá độc tính của thuốc Cisplatin trên bệnh nhân ung thư vòm họng giai đoạn muộn

- Bước đầu đánh giá tác dụng điều trị bệnh ung thư vòm họng giai đoạn muộn bằng thuốc Cisplatin sản xuất trong nước

Tiền vô

khuẩn

Dung môi, hoá

chất

Phòng vô khuẩn để pha chế và đóng

Phòng tiệt khuẩn vỏ đựng thuốc

Phòng rửa chai, lọ, ống,

tiệt khuẩn thuốc tiêm Phòng kiểm tra

Ghi nhãn và đóng

gói Chai, ống, lọ,

nút chưa rửa

2.3. Nguyên liệu và thiết bị

1) Hóa chất

Tên hóa chất Nhà sản xuất

Platin kim loại Merk - Đức

Bạc nitrat Prolabo

Cis-diammine-dicloroplatinum(II) Merk

Kaliclorua Merk

Hydrazinium dichloride Trung Quốc

Hexachloro platinic (IV) acid

hexahydrate

Trung Quốc

Cisplatin chuẩn để kiểm nghiệm USP

2) Dung môi

Dimethylformamide for GC Merk

Diethyl ether Merk

Acetone Merk Methanol Merk Amoniac, dung dịch 20% Merk

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1100

- Máy quang phổ tử ngoại UV 160A

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm, nghiêm cứu độ ổn định nguyên liệu và thành phẩm thuốc tiêm truyền Cisplatin

Chúng tôi tham khảo các tài liệu tiêu chuẩn nước ngoài chủ yếu là tiêu chuẩn Dược điển Anh kết hợp với các điều kiện thích hợp cho sản phẩm sản xuất tại Việt Nam để xây dựng phương pháp kiểm tra chất lượng cơ sở Tiêu chuẩn đã được Viện kiểm nghiệm TW thẩm định và phê duyệt (xem phụ lục)

Nghiên cứu độ ổn định: Theo phương pháp theo dõi định kỳ, dài hạn ở

điều kiện thường

3.3 Thử Dược lý thực nghiệm

Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, độc tính tế bào, ảnh hưởng của thuốc lên các cơ quan, tổ chức, mô phôi, lên sự thay đổi thể dịch cơ thể, tác động lên tổ chức ung thư đảm bảo theo các nguyên tắc của dược lý thực nghiệm

- Theo phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc - Đỗ Trung Đàm NXB Y học Hà Nội 1996

- Theo kỹ thuật cơ quan cô lập của Schuzldale tại trường Đại học Y khoa

Hà Nội và Khoa Sinh - ĐH KHTN - ĐHQG

3.4 Thử hoạt tính chống ung thư của Cisplatin trên mô hình tế bào ung thư thực nghiệm

Theo phương pháp thường qui

3.5 Pha chế dung dịch thuốc tiêm truyền Cisplatin

- Kiểm nghiệm nguyên liệu sản xuất theo tiêu chuẩn BP 2001

- Tiệt trùng các dụng cụ và phòng pha chế

- Sau khi pha chế hấp tiệt trùng thành phẩm bằng nồi hấp

- Kiểm tra thành phẩm theo tiêu chuẩn BP 2001

3.6 Thử lâm sàng

Nghiên cứu dược lý lâm sàng theo quy chế thử nghiệm lâm sàng của Bộ

Y tế tại viện K

3.6.1 Nghiên cứu pha I theo các bước tiến hành sau:

Bước 1: Chọn 3 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn, điều trị Cisplatin liều 30mg/m2

da cơ thể, pha trong 250ml HTM 0,9%, truyền tĩnh mạch 60giọt/phút Chu kỳ 21 ngày, mỗi bệnh nhân được điều trị 3 chu kỳ Vậy tổng cộng bước 1 có 9 chu kỳ

- Sau điều trị bước 1 nếu nếu dưới 3/9 chu kỳ có độc tính trên độ 2 thì vẫn chuyển sang điều trị bước 2

- Sau đợt điều trị nếu nếu trên 3/9 chu kỳ có biểu hiện ngộ độc trên độ 2,

sẽ chọn lại 3 BN khác và làm lại như trên Nếu sau lần chọn thứ 2, kết quả vẫn như lần chọn thứ nhất thì ngừng nghiên cứu Nếu không có độc tính trên 3 chu kỳ thì chuyển sang điều trị bước 2

Bước 2: Chọn 3 bệnh nhân khác đủ tiêu chuẩn, nâng liều 50mg/ m2

da cơ thể, pha 250ml HTM 0,9% truyền tĩnh mạch 60giọt/phút, chu kỳ 21 ngày, điều trị 3 chu kỳ, tổng cộng có 9 chu kỳ, sau đợt điều trị bước 2 nếu có độc tính trên

độ 2 thì vẫn chuyển sang điều trị bước 3

- Sau ba chu kỳ nếu có trên 33,3% số chu kỳ (trên 3 chu kỳ) có biểu hiện ngộ độc trên độ 2, sẽ chọn lại 3 BN khác và làm lại như trên Nếu sau lần chọn thứ 2, kết quả vẫn như lần chọn thứ nhất thì ngừng nghiên cứu Nếu không có

độc tính trên 3 chu kỳ thì chuyển sang điều trị bước 3

Bước 3: Chọn 3 bệnh nhân khác đủ tiêu chuẩn nâng liều 75mg/m2 da cơ thể, pha 250ml HTM 0,9% truyền tĩnh mạch 60giọt/phút, chu kỳ 21ngày, mỗi

bệnh nhân điều trị 3 chu kỳ, tổng cộng có 9 chu kỳ

- Sau ba chu kỳ nếu có trên 33,3% số chu kỳ (trên 3 chu kỳ) có biểu hiện ngộ độc trên độ 2, sẽ chọn lại 3 BN khác và làm lại như trên Nếu sau lần chọn thứ 2 , kết quả vẫn như lần chọn thứ nhất thì ngừng nghiên cứu

- Ghi nhận độc tính cấp xảy ra ngay sau mỗi lần tiêm truyền cho cả 9 chu

kỳ của 3 bệnh nhân

- Đánh giá và ghi nhận các tác dụng phụ trên hệ tạo huyết (chỉ số HC, BC

và TC), hệ tiêu hoá (nôn, buồn nôn, tiêu chảy ) và các chỉ số men gan, chức năng thận, cấp độ theo WHO Việc ghi nhận được thực hiện trước mỗi đợt

điều trị và trong thời gian giữa 2 chu kỳ

Đối với bệnh nhân có biểu hiện tác dụng phụ, sau khi ghi nhận đều được

xử trí đầy đủ

- Thu thập dữ liệu: Theo mẫu bệnh án in sẵn, đánh số BN từ 1 đến 9

- Các chỉ số được ghi cụ thể của từng BN

3.6.2 Nghiên cứu pha II

Bệnh nhân được chẩn đoán là UTVH giai đoạn III, IV chưa từng được điều trị hóa chất, không mắc bệnh lý cấp tính hoặc tiền sử mắc các bệnh lý mạn, các chức năng gan thận, tủy xương trong giới hạn bình thường chia làm hai nhóm I và II theo phương pháp bốc thăm chẵn lẻ (hai nhóm có sự tương đồng

về tuổi, giới, giai đoạn bệnh)

Nhóm I được điều trị bằng Cis Ebewe của áo và 5-FU

Nhóm II được điều trị bằng Cis Mediplantex và 5-FU

5-FU của cả hai nhóm của hãng Ebewe Sử dụng các thuốc hỗ trợ cũng như truyền thuốc cho bệnh nhân của cả hai nhóm là hoàn toàn như nhau

Coi Cis của áo là chuẩn để so sánh với Cis của Mediplatex

* Đánh giá đáp ứng sau mỗi đợt điều trị hóa chất và sau ba đợt điều trị theo WHO

+ Đáp ứng hoàn toàn: Khối u và hạch tan hoàn toàn ít nhất kéo dài trong bốn tuần và không xuất hiện tổn thương mới

+ Đáp ứng một phần: Giảm ≥ 50% kích thước lớn nhất của các tổn thương

và không xuất hiện thêm các tổn thương mới trong ít nhất 4 tuần

+ Bệnh không thay đổi: Khi kích thước của các tổn thương giảm đi dưới 50% hoặc tăng lên không quá 25%

+ Bệnh tiên strieenr: Tăng kích thước của các tổn thương trên 25% hoặc xuất hiện bất kỳ tổn thương mới

* Đánh giá độc tính của hoá chất sau mỗi đợt điều trị theo 5 mức độ của WHO

Bao gồm độc tính huyết học (dòng bạch cầu, mức độ giảm BCH, Hb, tỷ lệ hạ TC ), độc tính trên thận (ure, creatinin), độc tính trên gan (SGOT, SGPT)

và các độc tính khác (nôn, buồn nôn, ỉa chảy, viêm miệng, rụng tóc, dị ứng…)

4 Kết quả nghiên cứu

4.1 tổng hợp và tinh chế Cisplatin

Qua 7 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Bắt đầu từ H2[PtCl6].6H2O là một hoá chất thông dụng nhất, dễ kiếm nhất Các kim loại họ platin: Ru, Rh, Pd, Os, Ir, Pt thường đi cặp kè với nhau trong quặng và cả trong các hợp chất hoá học, để phát hiện sự

có mặt của các kim loại này chúng tôi đã dựa vào biến đổi màu sắc của phức chất K2 [PtCl6] ở trạng thái tinh khiết phức chất này có màu vàng sáng, khi lẫn vết các kim loại Ru, Pd, Os, Ir chuyển sang màu đỏ gạch, khi lẫn vết Rh chuyển sang màu vàng – xanh lá cây Chúng tôi đã điều chế các mẫu

K2[PtCl6] với sự có mặt các vết kim loại họ platin và tìm được các phương pháp thích hợp để loại các vết kim loại họ platin nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm Cisplatin

Giai đoạn 2: Platin là một nguyên tố đa hoá trị, thường gặp nhất là hoá

trị 0, II và IV Trong các phản ứng Pt (IV) dễ bị khử đến Pt (II) và Pt (II) bị khử đến Pt (0) Muốn có được một hợp chất tinh khiết cần phải thực hiện phản ứng trong những điều kiện chặt chẽ: phải thử nhiều chất khử khác nhau, thí dụ khí SO2, hydrazin hydrat, hydrazin dihydrochloride v.v để chọn được một chất khử thích hợp Nhiệt độ được khống chế trong khoảng 30 - 600C, tìm

được tốc độ khuấy, tốc độ thêm chất khử vào Cần chọn bình phản ứng có chất liệu thích hợp, để ngăn cản sự tạo thành những trung tâm xúc tác cho sự khử

Pt (II) đến Pt (0)

Giai đoạn 3: Phản ứng xảy ra toàn lượng và không cần tách sản phẩm,

để yên trong bình làm phản ứng tiếp

Giai đoạn 4: Trong giai đoạn này có những điều cần chú ý:

- Khuấy mạnh

- Có máy đo pH thật chính xác và phải tìm được giá trị pH thích hợp

trong khoảng 6 - 8

Giai đoạn 5: Hàm lượng bạc trong sản phẩm Cisplatin được quy định

rất chặt chẽ, qua nhiều lần thí nghiệm, tính toán chúng tôi đã tìm được lượng AgNO3 cần thiết để thêm vào hỗn hợp phản ứng, đảm bảo kết tủa hết Iư dưới dạng AgI Dung dịch được lọc, rồi thêm vào một lượng như KCl, những vết

Ag+ còn lại được kết tủa dưới dạng AgCl Lọc những vết AgCl ngay trên phễu lọc AgI Nước lọc được giữ lại để làm phản ứng tiếp, còn AgI giữ lại để thu hồi bạc

Hàm lượng bạc trong sản phẩm Cisplatin được kiểm tra bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử, luôn luôn ở dưới mức cho phép

Giai đoạn 6: Lượng KCl được dùng dư từ 10 – 15%, thuận lợi cho sự

tạo thành Cisplatin, góp phần nâng cao hiệu suất

Giai đoạn 7: Cisplatin được kết tinh lại 2 lần bằng dung dịch axit HCl

loãng Khi kết tinh không nên làm lạnh dung dịch đến 00C, mà giữ ở nhiệt độ phòng để tránh các vết tạp chất kết tinh theo

Chúng tôi cũng đã thử kết tinh lại Cisplatin bằng hỗn hợp dung môi dimethyl formamide – H2O theo các tỷ lệ khác nhau, nhưng hiệu quả không bằng cách kết tinh lại trong dung dịch HCl loãng, có nồng độ thích hợp

Cisplatin có độ tan nhỏ (0,253g trong 100 ml nước ở 250C và 3g trong

100 ml nước sôi) do đó khi kết tinh lại thường kết tủa ngay trên giấy lọc, nên phải dùng phễu lọc nóng

Kết luận : Qua 7 giai đoạn tổng hợp và kết tinh lại Cisplatin chúng tôi

đã thu được 2000g Cisplatin dược dụng với hiệu suất 90% tính từ K2[PtCl4] Hiệu suất này còn có khả năng nâng cao hơn Sản phẩm đã được Viện Kiểm nghiệm Bộ Y tế kiểm nghiệm kết luận đạt tiêu chuẩn dược điển Anh 2001, có

độ tinh khiết 99,96% (xem phần phụ lục)

Sơ đồ qui trình tổng hợp và tinh chế Cisplatin như sau:

Hình 4.1: Sơ đồ qui trình tổng hợp và tinh chế Cisplatin

H2 [PtCl6] 6 H2O Hexachloroplatinic (IV) acid

hexahydrate Giai đoạn 1 98% 2KCl

K2 [PtCl6] Potassium hexachloroplatinate(IV) Giai đoạn 2 97% N2H4 2HCl Hydrazinium dihydrochloride

K2[PtCl4] Potassium tetrachloroplatinate(II) Giai đoạn 3 100% 4KI

K2[PtI4] Potassium tetraiodoplatinate(II) Giai đoạn 4 98% 2NH3

cis - [Pt(NH3)2I2] cis-diamminediiodo platinum(II) Giai đoạn 5 Không tách ra 2AgNO3, 2H2O

cis - [Pt(NH3)2(H2O)2](NO3)2 cis-diammine-diaquo platinum(II)

4.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm, theo dõi độ ổn

định nguyên liệu và thành phẩm thuốc tiêm truyền

Cisplatin

4.2.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu

4.2.1.1 Yêu cầu kỹ thuật

1) Tính chất

Bột màu vàng hay bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam

b) pH: Dung dịch 0,1%9 (kl/tt) trong nước cất đã loại CO2 (Xác định ngay sau khi chuẩn bị) có pH từ 4,5 đến 6,0

c) Tạp chất liên quan (TLC) : Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử không được xuất hiện vết phụ nào có giá trị Rf nhỏ hơn giá trị Rf của vết chính, và bất kỳ vết phụ nào có giá trị Rf lớn hơn giá trị Rf của vết chính cũng không được đậm hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn (b)

Thử bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu ở mục 1.1

2) Độ hoà tan: Chế phẩm phải thoả mãn các yêu cầu của mục 1.2

3) Định tính:

a) Phổ hồng ngoại: Phổ hồng ngoại phải tương ứng với phổ hồng ngoại của Cisplatin chuẩn

b) Sắc ký lớp mỏng: ở phần xác định tạp chất liên quan, vết chính trên sắc

ký đồ thu được từ dung dịch thử (a) phải giống với vết chính thu được trên sắc

ký đồ thu của dung dịch chuẩn (a) về vị trí, màu sắc và kích thước

4) Độ tinh khiết:

a) Độ trong và màu sắc của dung dịch:

Hoà tan 25mg trong 25ml dung dịch natri clorid 9g/l Dung dịch này phải trong và có màu không được đậm hơn màu của dung dịch chuẩn GY5 (Tiến hành theo Dược điển Anh 2001, phụ lục 2.2.1 và 2.2.2)

Dung môi khai triển: Aceton-Dimethylformamid = 10-90

Dung dịch thử (a): Pha loãng 1,0ml dung dịch thử (b) với dimethylformamid vừa đủ 10,0ml

Dung dịch thử (b): Hoà tan 0,20g trong vừa đủ 10,0ml dimethylformamid Dung dịch chuẩn (a): Hoà tan 10mg Cisplatin chuẩn trong 5ml

có giá trị Rf nhỏ hơn giá trị Rf của vết chính, và bất kỳ vết phụ nào có giá trị

Rf lớn hơn giá trị Rf của vết chính không được đậm hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (b)

d) Bạc: Xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

- Dung dịch thử: Hoà tan 0,100g chất thử trong 15ml acid nitric, đun nóng đến

800C Để nguội và pha loãng với nước vừa đủ 25,0ml

- Dung dịch chuẩn: Lấy một thể tích thích hợp (10-30ml) của dung dịch bạc chuẩn (5 phần triệu bạc), thêm 50ml acid nitric và pha loãng với nước vừa đủ 100,0ml

Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 328nm, dùng đèn catot rỗng bằng bạc làm nguồn bức xạ, đốt bằng khí acetylen, độ rộng khe phổ khoảng 0,5nm Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện

5) Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Pha động: Chuẩn bị hỗn hợp đã lọc và loại khí gồm 10 thể tích dung dịch natri clorid 9g/l và 90 thể tích methanol Điều chỉnh lại tỉ lệ các thành phần trong pha động nếu cần

- Dung dịch thử: Hoà tan 50,0mg chất thử trong vừa đủ 100,0ml dung dịch natri clorid 9g/l

- Dung dịch chuẩn: Hoà tan 50,0mg Cisplatin chuẩn trong vừa đủ 100,0ml dung natri clorid 9g/l

- Tiến hành: Cân bằng cột với pha động ít nhất 45 phút trước khi tiến hành

định lượng Tiêm xen kẽ dung dịch chuẩn và dung dịch thử Tính hàm lượng phần trăm (kl/tt) của Cl2H6N2Pt theo hàm lượng của Cisplatin chuẩn dựa trên diện tích pic thu được từ sắc ký đồ định lượng của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

4.2.2 Tiêu chuẩn thành phẩm thuốc tiêm truyền Cisplatin

A Yêu cầu kỹ thuật

4.2.2.1 Công thức điều chế cho chai 100ml :

Cisplatin Năm mươi phẩy không miligam 50,0mg

NaCl Chín trăm phẩy không miligam 900,0mg

Đệm acetat pH 3,4 Hai mililít 2ml

Nước cất pha tiêm vừa đủ 100ml

4.2.2.2 Yêu cầu nguyên phụ liệu:

Cisplatin Đạt tiêu chuẩn BP 2001 Natri chlorid Đạt tiêu chuẩn DĐVN III

Nước cất pha tiêm Đạt tiêu chuẩn DĐVN III

Đệm acetat pH 3,4 Đạt tiêu chuẩn BP 2001

Chai thuỷ tinh 100ml Đạt tiêu chuẩn DĐVN III

4.2.2.3 Chất lượng thành phẩm:

1) Tính chất: Chất lỏng màu vàng sáng nhạt, không mùi, không vị, được

đóng trong chai thuỷ tinh trung tính màu nâm sẫm, dung tích 100ml

Phải thể hiện các phép thử định tính của Cisplatin, Na+ và Cl-

6) Tạp chất liên quan:

Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch (1) không được xuất hiện vết thứ hai nào có giá trị Rf nhỏ hơn giá trị Rf của vết chính, và bất kỳ vết thứ hai nào

có giá trị Rf lớn hơn giá trị Rf của vết chính cũng không được đậm hơn vết

chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch (3) (2%)

7) Độ vô khuẩn: Chế phẩm phải vô khuẩn

8) Nội độc tố vi khuẩn: Không được quá 2,0 EU/mg

1) Tính chất: Thử bằng cảm quan chế phẩm phải đạt yêu cầu đã nêu

2) Thể tích: Thử theo DĐVN III (Phụ lục 1.14)

3) Độ trong: Thử theo DĐVN III

- Dung dịch để tiêm truyền khi kiểm tra bằng mắt thường ở điều kiện thích hợp phải trong và không có các tạp chất cơ học (phụ lục 8.9, mục B)

- Giới hạn kích thước và số lượng các tiểu phân (Phụ lục 8.9, mục A)

4) pH: Thử theo DĐVN III (Phụ lục 5.9)

5) Định tính:

- Phổ tử ngoại của dung dịch thử 0,5% khi đo ở bước sóng từ 230nm đến 350nm có một cực đại hấp thụ tại bước sóng 300nm

- Trong phần định lượng, thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ thu được

từ dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch chuẩn

- Trong phần tiến hành thử tạp chất liên quan, vết chính trên sắc ký đồ thu

được từ dung dịch (2) phải tương ứng với vết chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch (4)

- Ion Cl-: Dùng 2ml dung dịch chế phẩm Acid hoá bằng dung dịch acid nitric 2M (TT), thêm 0,4ml dung dịch bạc nitrat 2%(TT) Lắc và để yên sẽ tạo tủa trắng lổn nhổn Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần với 1ml nước, hoà tủa trong 2ml nước và thêm 1,5ml dung dịch amoniac 10M, tủa tan ra dễ dàng

- Ion Na+ : Dùng một dây bạch kim hay đũa thuỷ tinh, lấy một giọt dung dịch chế phẩm, đưa vào ngọn lửa không màu, ngọn lửa sẽ nhuộm thành màu vàng

6) Tạp chất liên quan : Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Theo Dược điển BP 98 - phương pháp sắc ký lớp mỏng:

* Bản mỏng: Cellulose vi tinh thể hoạt hoá ở 1500C trong 1 giờ

* Dung môi triển khai: Dimethylformamid – Acetone = 90 - 10

* Dung dịch (1): Lắc một lượng dung dịch chế phẩm với Dimethylformamide

để thu được dung dịch có chứa 0,5% (kl/tt) của Cisplatin, lắc siêu âm trong 10 phút

* Dung dịch (2): Pha loãng 1,0ml dung dịch (1) với Dimethylformamide vừa

đủ 10,0ml

* Dung dịch (3): Pha loãng 1,0ml dung dịch (1) với Dimethylformamide vừa

đủ 50,0ml

* Dung dịch (4): Dung dịch 0,05% (kl/tt) của Cisplatin chuẩn trong Dimethylformamide

Cách tiến hành:

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20àl mỗi dung dịch trên Triển khai sắc

ký đến khi dung môi đi được khoảng 15cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt

độ phòng và phun dung dịch thiếc (II) clorid 5% (kl/tt) trong dung dịch acid hydrocloric 1M Sau 1 giờ, trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch (1) không

được xuất hiện vết thứ hai nào có giá trị Rf nhỏ hơn giá trị Rf của vết chính, và bất kỳ vết thứ hai nào có giá trị Rf lớn hơn giá trị Rf của vết chính cũng không

được đậm hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch (3) (2%)

7) Độ vô khuẩn: Thử theo DĐVN III (Phụ lục 10.8)

8) Nội độc tố vi khuẩn: Thử theo DĐVN III (Phụ lục 10.3)

9) Định lượng:

Cisplatin: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Pha động: Chuẩn bị hỗn hợp đã lọc và loại khí gồm 10 thể tích nước và 90 thể tích acetonitril Điều chỉnh lại tỉ lệ các thành phần trong pha động nếu cần

Clorid: Hút chính xác 5,00ml dung dịch thử, thêm 35ml nước Chuẩn độ bằng dung dịch bạc nitrat 0,1N Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp

chuẩn độ đo điện thế Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều

kiện (1ml bạc nitrat 0,1N tương đương với 3,545mg clorid)

C đóng gói, ghi nh∙n, Bảo quản

- Thuốc tiêm truyền Cisplatin được đóng trong chai thuỷ tinh 100ml màu nâu

- Hộp một chai, nhãn đúng qui chế

- Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát, nhiệt độ không quá 250C

- Hạn dùng : 24 tháng kể từ ngày sản xuất

4.2.3 Theo dõi độ ổn định

1) Độ ổn định của nguyên liệu Cisplatin

Tiến hành nghiên cứu trên 3 mẫu nguyên liệu, các số liệu nghiên cứu được

ghi ở bảng 4.1, bảng 4.2, bảng 4.3 dưới đây

Bảng 4.1: Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mẫu số 010102

Tên mẫu:

Cisplatin

Nơi lấy mẫu:

Xưởng Mỹ Đình Ngày: 6/01/2002

Số kiểm soát:

010102

Ngày sản xuất: 2/01/2002

Qui cách đóng gói:

50g/lọ

Điều kiện bảo quản:

T0: 150C- 300C RH: ≤ 90%

Thời gian theo dõi:

6 Kết luận: Theo dõi trong điều kiện thử nghiệm, hàm lượng của chế phẩm giảm dần nhưng

vẫn đạt tiêu chuẩn, không nhận thấy có sự biến đổi đáng kể nào về độ ổn định vật lý và hóa

học

Bảng 4.2: Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mẫu số 020102

Thời gian theo dõi:

6 Kết luận: Theo dõi trong điều kiện thử nghiệm, hàm l−ợng của chế phẩm giảm dần nh−ng

vẫn đạt tiêu chuẩn, không nhận thấy có sự biến đổi đáng kể nào về độ ổn định vật lý và hóa

học

Bảng 4.3: Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mẫu số 030202

2) Độ ổn định của dung dịch tiêm truyền Cisplatin 50mg/ chai 100ml

Điều kiện bảo quản

Sản phẩm được đóng trong chai thuỷ tinh trung tính màu nâu, dung tích 100ml, đậy kín bằng nút cao su và nắp nhôm Bảo quản ở 250C, độ ẩm tương

Số kiểm soát:

030202

Ngày sản xuất: 10/02/2002

Qui cách đóng gói:

50g/lọ

Điều kiện bảo quản:

T0: 150C- 300C RH: ≤ 90%

Thời gian theo dõi:

Phương pháp phân tích

Yêu cầu về mẫu lấy thử nghiệm

- Ba mẻ sản xuất liên tiếp, được đóng gói theo cơ số nhỏ nhất đúng mẫu lưu hành

- Được tiến hành đưa vào thử nghiệm chậm nhất là 10 ngày sau ngày sản xuất, với điều kiện đã có kết quả kiểm nghiệm của phòng Đảm bảo chất lượng đạt yêu cầu về chất lượng

- Số lượng mẫu thử được lấy phải đủ cho các đợt định kỳ kiểm tra qui định, mỗi đợt đủ kiểm nghiệm 3 lần đầy đủ các chỉ tiêu

Điều kiện thử nghiệm

- Lưu mẫu tại phòng ĐBCL - Công ty CP Dược TW Mediplantex

- Điều kiện thử nghiệm giống điều kiện bảo quản ghi trên nhãn Thông thường:

* Nhiệt độ: 250C ± 2

* Độ ẩm: 75% ± 5

* Tránh ánh sáng trực tiếp

Phương tiện thử nghiệm

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Máy đo năng suất quay cực

Độ trong pH

Tạp chất liên quan

Độ vô

khuẩn

Nội độc

tố vi khuẩn

Định l−ợng (%)

Độ trong

Định l−ợng

Độ trong pH

Tạp chất liên quan

Độ vô

khuẩn

Nội độc

tố vi khuẩn

Định l−ợng (%)

* ảnh hưởng của Cisplatin tới trọng lượng thỏ: Tiến hành cân thỏ, trong và

sau thí nghiệm Kết quả cho thấy thỏ ở cả hai lô dùng Cisplatin và lô chứng

đều tăng trọng lượng cơ thể nhưng không có sự khác biệt giữa các lô với nhau

và so với trước dùng thuốc (p > 0,05)

* Chức phận tạo máu: Kết quả nghiên cứu cho thấy với liều

0,2mg/kg/24giờ Cisplatin làm tăng nhẹ số lượng hồng cầu của thỏ trong khi thể tích hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu thay đổi không đáng kể so với trước khi dùng thuốc (p>0,05) ở lô tiêm Cisplatin liều cao (0,3mg/kg/24 giờ) số lượng bạch cầu thỏ tăng rõ rệt sau 35 ngày tiêm thuốc

* Chức năng gan: Để đánh giá ảnh hưởng của Cisplatin tới nhu mô gan,

chúng tôi định lượng enzym transaminase (AST, ALT) trong máu Kết quả cho thấy sau 35 ngày dùng thuốc, hoạt độ enzym AST ở hai lô thỏ tiêm Cisplatin có xu hướng giảm so với trước dùng thuốc nhưng sự khác biệt không

có ý nghĩa thống kê (với lô Cisplatin 0,3mg/kg cân nặng, trước dùng thuốc AST là 40,13 ± 4,02 UI/L; sau 35 ngày dùng thuốc là 34,91± 6,21UI/L, p>0,05)

* Chức năng thận: Qua nghiên cứu, chúng tôi thấy nồng độ urê và creatinin

trong máu thỏ ở cả hai lô tiêm Cisplatin đều tăng so với trước khi dùng thuốc Với lô Cisplatin 0,3 mg/kg cân nặng, trước dùng thuốc urê là 2,75 ± 0,29 g/L; sau 35 ngày dùng thuốc là 4,26 ± 0,37g/L, p < 0,05 Với lô Cisplatin 0,2 mg/kg cân nặng, trước dùng thuốc creatinin là 1,02 ± 0,05 mg/dL; sau 35 ngày dùng thuốc là 1,08 ± 0,06 mg/dL, p < 0,05

* Thay đổi về hình thái: Sau 15 - 35 ngày tiêm thuốc, tất cả các thỏ thực

nghiệm đều được mổ, khám nghiệm đại thể và vi thể các phủ tạng, kết quả cho thấy:

- Về đại thể: Trên tất cả các thực nghiệm, không thấy có các thay đổi bệnh

lý nào về mặt hình thái đại thể của các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận

và hệ thống tiêu hoá

- Về vi thể:

+ Với liều 0,2 mg/kg tiêm tĩnh mạch 4 đợt, mỗi đợt 5 ngày: ở 50% thỏ, các tế bào gan có thoái hoá loạn dưỡng nhẹ, thoái hoá hốc mỡ nhỏ và thoái hoá hạt nhẹ; ruột thoái hoá loạn dưỡng nhẹ, thoái hoá ung trợt Tuỷ xương có nhiều hốc mỡ, các dòng tế bào tiểu cầu, bạch cầu giảm nhẹ

+ Với liều 0,3 mg/kg/24 giờ tiêm tĩnh mạch 5 ngày, dùng 2 đợt cách nhau 10 ngày, Cisplatin gây thoái hoá thũng đục, thoái hoá hạt mức độ vừa ở 60% số thỏ thí nghiệm, làm biểu mô ruột thỏ thoái hoá loạn dưỡng vừa, tuỷ xương có hốc mỡ nhỏ

Sau 15 ngày ngừng tiêm thuốc các tổn thương dần hồi phục

4.4 thử hoạt tính chống ung thư của Cisplatin trên mô hình tế bào ung thư thực nghiệm

4.4.1 Liều dùng thích hợp của Cisplatin do Công ty CP Dược TW

Mediplantex sản xuất

- Liều có hoạt tính ức chế TB UT Sarcoma 180 nuôi cấy in vitro thích

hợp nhất của Cisplatin là 8àg/ml môi trường nuôi cấy Parker 199

- Chúng tôi chọn liều 8àg/ml môi trường là thích hợp cho việc khảo sát

hiệu ứng kháng u in vitro của Cisplatin vì theo các nghiên cứu của Viện