ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L ) Wall ) KHÓA LUẬN TỐT[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRẦN NGỌC ÁNH BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU ALCALOID TỪ VỎ CÂY THỪNG MỰC LÁ TO (Holarrhena antidysenterica (L.) Wall.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN VĂN TÀI ThS LÊ ANH TUẤN HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp hồn thành khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu Trung Ương Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trường Đại Học Y Dược - Đại Học Quốc Gia Hà Nội Viện Dược liệu tạo điều kiện thuận lợi cho em thực khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Văn Tài ThS Lê Anh Tuấn định hướng, quan tâm giúp đỡ em hoàn thành đề tài Đồng thời em chân thành cảm ơn TS Lê Thành Nghị, CN Phùng Như Hoa tất thầy cô, anh chị bạn Khoa Hóa Thực Vật Viện Dược liệu tận tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt kinh nghiệm quý báu trình xây dựng, triển khai bước phân tích kết suốt trình em thực đề tài đơn vị Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu suốt năm theo học trường Những kiến thức khơng giúp em có kiến thức hồn thành khóa luận mà cịn hành trang cho em vững bước chặng đường tương lai Cuối em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên khích lệ em học tập sống Em xin chân thành cảm cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2021 Sinh viên Trần Ngọc Ánh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải ACN Acetonitril Acetonitril C Độ Celcius Dung môi : dược liệu o DM/DL EtOAc Ethyl Acetat Ethyl Acetat EtOH Ethanol Ethanol MeOH Methanol Methanol HPLC High Perfomance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography SKĐ Sắc kí đồ tt:tt Thể tích : thể tích kl:tt TLC TLTK Thin layer chromatography Khối lượng : thể tích Sắc ky lơp mong ́ ́ ̉ Tài liệu tham khảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Thừng mực to 1.1.1 Tổng quan thực vật học 1.1.1.1 Vị trí phân loại .2 1.1.1.2 Phân bố .2 1.1.2 Thành phần hóa học Thừng mực to 1.1.2.1 Alcaloid .4 1.1.2.2 Chất nhựa 1.1.2.3 Chất gôm 1.1.2.4 Các chất vô 1.1.3 Tác dụng dược lý Thừng mực to .6 1.1.3.1 Tác dụng chống tiêu chảy 1.1.3.2 Tác dụng kháng khuẩn .6 1.1.3.3 Tác dụng điều trị tiểu đường .6 1.1.3.4 Tác dụng khác .7 1.1.4 Một số sản phẩm Thừng mực to .7 1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế, định tính, định lượng Conessin từ dược liệu 1.2.1 Chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân Thừng mực to 1.2.2 Phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần 1.2.3 Một số phương pháp định tính, định lượng Conessin 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 12 2.1.1 Đối tượng 12 2.1.2 Nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị .12 2.1.3 Hóa chất, dung môi .12 2.2 Phương pháp nghiên cứu .13 2.2.1 Khảo sát quy trình chiết xuất, làm giàu alcaloid từ vỏ Thừng mực to .13 2.2.1.1 Khảo sát quy trình chiết xuất cao tổng 13 2.2.1.2 Khảo sát quy trình làm giàu alcaloid từ cao tổng .15 2.2.2 Định lượng alcaloid phương pháp HPLC 15 2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng alcaloid xác định tạp chất phương pháp HPLC .15 2.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích .16 2.2.2.3 Xây dựng đường chuẩn công thức 16 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu .17 3.2 Khảo sát phương pháp chiết số lần chiết 20 3.3 Khảo sát loại dung môi chiết 23 3.4 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ DM/DL .28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to với dược liệu không làm ẩm NH3 19 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to với dược liệu có làm ẩm NH3 .19 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to (PP1) 21 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to (PP2) 22 Bảng Phần trăm khối lượng cao tổng 23 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to với phương pháp chiết PPA .25 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to với phương pháp chiết PPB .26 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to với phương pháp chiết PPC .26 Bảng Hiệu suất chiết cao tổng từ vỏ thân Thừng mực to với phương pháp chiết PPD 27 Bảng 10 So sánh hiệu suất trung bình chiết xuất cao tổng phương pháp 27 Bảng 11 Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 30/1; 24/1; 24/1 30 Bảng 12 Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 10/1; 8/1; 8/1 .31 Bảng 13 Hiệu suất chiết với tỷ lệ MD/DL: 7/; 5/1; 5/1 .31 Bảng 14 So sánh hiệu suất chiết tỷ lệ MD/DL 31 DANH MỤC HÌNH Hình Ảnh Thừng mực to lúc hoa Hình Ảnh cành mang hoa Thừng mực to Hình Conessin Hình Isoconessimin Hình Holadysenterin .5 Hình Kurchessin .5 Hình Sản phẩm chứa cao vỏ thân Thừng mực to Hình Ảnh TLC so sánh alcaloid từ dịch chiết MeOH chất chuẩn Conessin 17 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Sơ đồ chiết xuất cao tổng 33 MỞ ĐẦU Với vị trí địa lý gần vành đai nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái thực vật phong phú Theo số tài liệu nghiên cứu: nước ta có 12.000 lồi thực vật bậc cao thuộc 2.500 chi 300 họ Trong có 4.000 lồi thực vật sử dụng làm thuốc chữa bệnh [1] Trải qua hàng ngàn năm tồn phát triển loài người Nhân dân Việt Nam nhân dân nhiều nước khác giới tích lũy, lưu truyền kinh nghiệm phòng, chữa bệnh cỏ Tuy nhiên thuốc phần lớn phụ thuộc vào kinh nghiệm dân gian mà chưa nghiên cứu kỹ để có sở khoa học việc sử dụng chúng Xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày tăng Việt Nam nước khác giới Hướng nghiên cứu tìm hợp chất, làm giàu hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu nhiều nhà khoa học quan tâm Cây Thừng mực to mọc hoang ven triền núi nhiều nơi nước ta số nước khu vực Đông Nam Á Từ lâu nhân dân sử dụng vỏ để chữa lỵ amip Tuy nhiên, sản phẩm từ dược liệu thường có chất lượng khơng ổn định Vì nên việc điều chế cao chiết có chất lượng đảm bảo đánh giá hàm lượng hoạt chất cao cần thiết để bào chế thuốc có hiệu Với mong muốn góp phần xác định hàm lượng thành phần hợp chất alcaloid vỏ thân Thừng mực to kiểm soát chất lượng sản phẩm thực đề tài: “Bước đầu khảo sát nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ Thừng mực to’’ với mục tiêu: mực to Xây dựng quy trình chiết xuất cao giàu alcaloid từ vỏ Thừng - Xác định hàm lượng alcaloid cao CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Thừng mực to 1.1.1 Tổng quan thực vật học 1.1.1.1 Vị trí phân loại Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica (L.) Wall., thuộc họ Trúc đào - Apocynaceae Tên thông thường: Thừng mực to Tên khác: Mức hoa trắng, Mộc hoa trắng, Sừng trâu, Mộc vài (Tày), Xi chào (K’ Ho), Hồ liên Tên nước ngoài: Coneru (Anh), Vatsaka (Sanskrit) [21] 1.1.1.2 Phân bố Thừng mực to phân bố rải vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Châu Á Châu Phi Cây tìm thấy Myanmar, Malaysia, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Srilanka, Pakistan, Nepal Ở nước ta Thừng mực to mọc hoang tỉnh miền núi trung du Cao Bằng, Bắc Giang, n Bái, Lạng Sơn, Hịa Bình, Gia Lai, Kon Tum, tập trung nhiều Đắk Lắk Nghệ An [3,4,7,8,10] 1.1.1.3 Đặc điểm thực vật Thừng mực to thân gỗ, có chiều cao lên đến 13m chu vi thân lên đến 1,1m Cành non dẹt, nhẵn bóng Cành già trịn nhẵn, màu nâu nhạt, có nốt sần nhỏ màu trắng Lá mọc đối xứng, có cuống ngắn, khơng có mọc kèm, hình bầu dục đầu tù hay nhọn, đáy trịn nhọn, dài 12 - 15 cm, rộng - cm, mặt bóng, màu xanh lục nhạt, mặt có lơng nhỏ mịn gân rõ Hoa màu trắng, thơm, mọc kẽ hay đầu cành, dài -10 cm; đài răng, có lơng lưng; tràng cánh trịn đầu, ống tràng dài cm, thắt họng, nhị đính gần phía gốc ống tràng, nhị có lơng, bao phấn hẹp, vòi nhụy dày