Khảo sát quá trình lên men acid lactic bởi lactobacillus drebrueckii

xylinum Acetobacter xylinum MRS Môi trường cho vi khuẩn Lactobacillus phát triển mạnh nhất được viết tắt theo tên của nhà phát minh de Man, Rogosa và µ/100gam...21Bảng 2.3 Phân loại rỉ

MỤC LỤC Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về lên men acid lactic 2

2.1.1 Đặc điểm của acid lactic 2

2.1.2 Lên men lactic 2

2.1.3 Vi khuẩn lên men lactic 4

2.1.3.1 Đặc điểm chung 4

2.1.3.2 Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men lactic 6

2.1.4 Đặc điểm chung của Lactobacillus delbrueckii 12

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic 13

2.1.5.1 Ảnh hưởng của pH 13

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 13

2.1.5.3 Ảnh hưởng của oxy 14

2.1.6 Công nghệ sản xuất acid lactic 15

2.1.6.1 Phương pháp sản xuất truyền thống 15

2.1.6.2 Phương pháp sản xuất hiện đại 16

2.1.6.3.1 phương pháp thu nhận acid lactic 17

2.2 Giới thiệu về rỉ đường mía 18

2.2.1 Thành phần cấu tạo 18

2.2.2 Thành phần các chất sinh trưởng 20

2.2.3 Vi sinh vật trong rỉ đường 21

2.2.4 Lực đệm của rỉ đường mía 22

2.3.1 Định nghĩa 22

2.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của tế bào vi sinh vật cố định: 22

2.3.3 Các yêu cầu đòi tế bào vi sinh vật cố định 23

2.3.4 Giới thiệu về chất mang Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose – BC) 23

2.3.5 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 26

2.3.5.1 phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang 26

2.3.5.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang 27

2.3.5.3 Cố định vi khuẩn L.delbrueckii bằng BC 27

2.4 Hệ thống lên men 28

2.4.1 Các khái niệm chung 28

2.4.2 Phân loại fermenter 29

2.4.3 Các kiểu nuôi cấy trong fermenter 29

2.4.3.1 Nuôi cấy gián đoạn 29

2.4.3.2 Nuôi cấy liên tục 30

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 Vật liệu 33

3.1.1 Rỉ đường 33

3.1.2 Giống vi sinh vật 33

3.1.3 Chế phẩm L.Delbrueckii được cố định trên BC 33

3.2 Hoá chất, trang thiết bị và dụng cụ 33

3.2.1 Môi trường nuôi cấy 33

3.2.2 Hóa chất 34

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 34

3.2 Phương pháp nghiên cứu 35

3.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 35

3.2.2 khảo sát Lactobacillus delbrueckii 35

3.2.2.1 Quan sát đại thể 36

3.2.2.2 Quan sát vi thể 36

3.2.2.3 Khảo sát khả năng tạo thành acid lactic 36

3.2.2.4 Lập đồ thị chuẩn 37

3.2.2.5 Khảo sát đường cong sinh trưởng trên môi trường MRS và rỉ đường 37

3.2.3 Khảo sát một số điều kiện lên men acid lactic trên môi trường rỉ đường 38

3.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô biểu kiến 38

3.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự lên men acid lactic 39

3.2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men 39

3.2.4 Tiến hành lên men acid lactic trong hệ thống lên men liên tục bởi L delbrueckii cố định trong phức chất mang BC 39

3.2.4.1 Xác định tốc độ pha loãng tối ưu cho quá trình lên men 39

3.2.4.2 Kiểm tra tính ổn định của hệ thống 40

3.2.5 Các phương pháp phân tích 41

3.2.5.1 Đo pH 41

3.2.5.2.Đo độ Brix 41

3.2.5.3 Xác định hàm lượng acid lactic 41

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43

4.1 Một số khảo sát và đặc điểm của Lactobacillus delbrueckii 43

4.1.1 Quan sát đại thể, vi thể 43

4.1.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo thành acid lactic 44

4.1.3 Kết quả khảo sát đường cong sinh trường của Lactobacillus delbrueckii trên môi trường MRS và rỉ đường 44

4.1.4 Kết quả xác định đường chuẩn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào 46

4.2.Kết quả khảo sát một số điều kiện lên men acid lactic trong lên men theo mẽ trên môi trường rỉ đường 46

4.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khô biểu kiến theo trọng lượng 46

4.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men trong quá trình lên men 48

4.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men trong quá trình lên men … .49

4.3 Kết quả tiến hành lên men thu nhận acid lactic trong hệ thống lên men liên tục bởi Lb delbrueckii cố định trong phức chất mang BC 50

4.3.1 Xác định tốc độ pha loãng tối ưu cho quá trình lên men 51

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BC-S Bacterial cellulose trong nuôi cấy tĩnh

BC-A Bacterial cellulose trong nuôi cấy lắc

L.delbrueckii Lactobacillus delbrueckii

TMA Trimethylamin

A xylinum Acetobacter xylinum

MRS Môi trường cho vi khuẩn Lactobacillus phát triển mạnh nhất

( được viết tắt theo tên của nhà phát minh de Man, Rogosa và

(µ/100gam) 21Bảng 2.3 Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm 21Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật tạo màng cellulose 25Bảng 3.1 xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào 38Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô biểu kiến đến mật độ tế bào, pH, Hàm

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của pH lên mật độ tế bào, Hàm lượng acid lactic(%) 48

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên mật độ tế bào,pH, Hàm lượng acid lactic(%) 49

Bảng 4.4 Lượng chế phẩm ở mỗi bình lên men trong hệ thống lên men liên tục 50

Bảng 4.5 Biến động pH trong quá trình lên men liên tục 51

Bảng 4.6 Biến động acid lactic (%) trong quá trình lên men liên tục 52

Bảng 4.7 Bảng theo dõi pH, hàm lượng acid lactic (%) của hệ thống 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 : Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus 7

Hình 2.2 : Vi khuẩn Lactobacillus casei 7

Hình 2.3 Vi khuẩn Latobacillus brevis 8

Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 9

Hình 2.5 Vi sinh vật thuộc nhóm Leuconostoc 10

Hình 2.6 Vi khuẩn Streptococcus lactis 11

Hình 2.7 Vi khuẩn Streptococcus thermophilus 11

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí nội dung nghiên cứu 35

Hình 3.2 Mô hình hệ thống lên men liên tục tại phòng thí nghiệm Bộ môn sinh học trường ĐH Bách Khoa tp.HCM 40

Hình 4.1 Hình ảnh đại thể Lactobacillus delbrueckii 43

Hình 4.2 Hình ảnh của một khuẩn lạc Lactobacillus delbrueckii 43

Đồ thị 4.3 Biểu diễn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào của vi khuẩn

Lactobacillus delbrueckii trên môi trường rỉ đường 46

Đồ thị 4.4 Tương quan giữa hàm lượng chất khô biểu kiến theo trọng lượng và acid lactic tạo thành 47

Đồ thị 4.5 Tương quan giữa pH môi trường lên men và acid lactic tạo thành… 48

Đồ thị 4.5 Tương quan giữa thời gian lên men và hàm lượng acid lactic tạo thành49

Đồ thị 4.6 Biến động của pH theo thời gian lên men liên tục ở các cấp độ pha loãng

150, 100, 75ml/h 51

Đồ thị 4.7 Biến động của hàm lượng acid lactic (%), theo thời gian lên men liên tục ở

Đồ thị 4.8 Biến động của hàm lượng acid lactic (%),pH theo thời gian trong hệ thốnglên men liên tục 53

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm nhiều đặc biệttrong các lĩnh vực lên men sản xuất các sản phẩm trao đổi chất Tế bào cố đọnh cónhiều ưu điểm hơn tế bào tự do như: Enzyme của tế bào ổn định hơn enzyme ở dạng

tự do khi tế bào được gắn trên chất mang polymer tự nhiên, cố định tế bào vi sinh vậtkhông đồi hỏi khâu tách chiết và tinh sạch sản phẩm Tế bào vi sinh vật cố địnhkhông bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn Có thểđược sử dụng nhiều lần theo chu kỳ hoặc liên tục

Acid lactic là sản phẩm của quá trình lên men lactic bởi vi khuẩn lactic Cóứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, thực phẩm, y dược Trong công nghiệp nhẹ,acid lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da…,trong công nghệ thực phẩm ứng dụng để làm chua quả, sản xuất dưa chua, các sảnphẩm lên men từ sữa,sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi … Trong y học, người ta

sử dụng vật liệu có tên là purasorb ( là một hợp chất cao phân tử được sản xuất từacid lactic) Purasorb được sử dụng như những đinh gim, gắn phần xương lại vớinhau Ngoài ra các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh họcdùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic, chất dẻo mới thay thế cho chấtdẻo cũ khó phân hủy… Tuy acid lactic được ứng dụng rất nhiều nhưng chưa cónhiều phương nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác vào quá trình lên mennhằm làm tăng hiệu suất lên men thu nhận acid lactic

Trên cơ sở vấn đề đặt ra, việc áp dụng phương pháp cố định tế bào trong sảnxuất lên men acid lactic là một hướng nghiên cứu trong việc tìm kiếm các phươngpháp lên men nhằm làm tăng hiệu suất lên men acid lactic

1.2 Mục tiêu đề tài

Với mục tiêu đề tài là sử dụng chế phẩm Lactobacillus delbrueckii cố định đểlên men liên tục thu nhận acid lactic Đề tài được tiến hành với các thí nhiệm sau:

_Khảo sát các quá trình ảnh hưởng đến lên men acid lactic ( lên men theomẻ): Độ Brix, pH, thời gian lên men.

_ Xác định tốc độ pha loãng tối ưu của hệ thống lên men liên tục

_Kiểm tra tính ổn định của hệ thống lên men liên tục

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về lên men acid lactic

2.1.1 Đặc điểm của acid lactic

Acid lactic là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ, tan trong nước và cồn Côngthức hóa học của acid lactic là CH3CHOHCOOH Khối lượng phân tử của acid lactic

là 98,08 Nhiệt độ sôi là 122oC, điểm tan 17oC

Acid lactic còn có tên gọi khác là 1-hydroxyethanol cacboxylic hay acid hydroxypropanoic Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng nênchúng có 2 đồng phân quang học: D-acid lactic và L-acid lactic Hai đồng phânquang học này có tính chất hoá lý giống nhau, nhưng chỉ khác là khả năng làm quaymặt phẳng phân cực của ánh sáng Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toànkhác nhau

2-Loại L-acid lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn etylic, eter, không tantrong CHCl3 Nhiệt độ nóng chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67 o

Loại D-acid lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn Nhiệt độ nóng chảy là

28 oC, nhiệt độ sôi 103 oC, góc quay cực ở 15 oC là -2,26 o

Nếu D-acid lactic và L-acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỷ lệ 50/50người ta gọi là hỗn hợp Raxemic Hỗn hợp này được ký hiệu là D1 acid lactic Trongquá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỷ lệ lý tưởng này mà chỉ cóđược hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ DL-acid lactic là dịch lỏng dạngsiro, có khả năng tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3 Nhiệt độ nóngchảy của chúng là 16,7 oC, nhiệt độ sôi là 122 oC [6]

2.1.2 Lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hoá đường thành acid lactic nhờ vi sinhvật, điển hình là vi khuẩn lactic Lên men lactic là một trong những loại hình lên menphát triển nhất trong thiên nhiên

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP đượchình thành trong quá trình chuyển hoá cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lạitrong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật Ngượclại các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lênmen Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càngtăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi lý hoá khác.

Trong quá trình lên men lactic, ngoài sản phẩm là acid lactic, acid acetic,ethanol, CO2 trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hoá học mới khác.Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men Hàm lượngcủa chúng trong dịch lên men thường rất thấp ( vài ppm hoặc ít hơn ) Một số hợpchất trong nhóm trên rất dễ bay hơi Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc gópphần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic

Khi nồng độ của acid lactic đạt 2 – 3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh vật

khác, kể cả E.coli Chính vì thế nên lên men lactic được ứng dụng để sản xuất nhiều

sản phẩm khác nhau như: sữa chua, bơ, dưa chua…

Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic:

C6H12O6→2C3H6O3 + 136Kj (32,4 Kcal)Lên men lactic gồm có lên men đồng hình và lên men dị hình

Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ mộtlượng nhỏ pyruvat bị khử carbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2, và acetoin.Lượng sản phẩm phụ tạo ra phụ thuộc sự có mặt của oxy

Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như:

Lactobacterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii…

Phương trình tổng quát trong quá trình lên men đồng hình:

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2CH3CHOHCOOH + 2ATPTrong một số trường hợp, Lên men đồng hình có thể được chuyển sang dạng

dị hình khi điều kiện lên men thay đổi

Lên men dị hình: Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn

có các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm

Phương trình tổng quát trong quá trình lên men dị hình:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OHLượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh Acid lactic thường chiếm 40%lượng đường đã được phân huỷ, acid suecinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic10%, và các loại khí gần 20% [6]

2.1.3 Vi khuẩn lên men lactic

2.1.3.1 Đặc điểm chung

Vi khuẩn lactic thuộc Lactobacilliaceae Acid lactic được phát hiện vào năm

1780 nhờ nhà hoá học Sheele người Thụy Điển, ở sữa chua, acid lactic được thừanhận là sản phẩm của quá trình lên men vào năm 1847

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năngtạo bào tử ( tuy nhiên hiện nay người ta đã tìm thấy một số giống thuộc họ vi khuẩnlactic có khả năng tạo bào tử)

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, không chứa cytochrom vàenzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh Chúngphân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển

Theo khóa phân loại của Bergay, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae

Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc.

Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là

cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột Một số loài trong họ vi

khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh Nhóm vi khuẩn lactic rất đa

dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hìnhque Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình Khả năng tổnghợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu.[7]

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau tạo thành acid lactic trong môi trường vànhư vậy sức chịu acid cũng khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạothành acid cao hơn ( khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩnnày có thể phát triển ở pH: 3.8 – 4, cầu khuẩn không thể phát triển ở môi trường này

Đa số vi khuẩn lactic, đặc biệt là trực khuẩn đồng hình rất kén chọn thànhphần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tươngđối đầy đủ các acid amin hoặc các hợp chất nitơ phức tạp Ngoài ta chúng còn nhucầu về vitamin (B1, B2, B6, PP), các acid pantotenic và folic Bởi vậy, môi trườngnuôi vi khuẩn lactic có thành phần khá phức tạp [1]

Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic,nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một sốtrực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%)

Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặcthấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưanhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bịchết sau 10 – 30 phút Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của peptone, acid aminhay muối amôn Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acidamin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại

Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành cácpeptid và acid amin Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn caohơn Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit

Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột, chỉ có loài L.delbrueckii là

đồng hoá được tinh bột Một số vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng đượcpentoza và acid citric

Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy Một số khác có khả năng đốikháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm

Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn có khả năngsinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ( người ta gọi các hợp chất này làbacteriocin) Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùngtrong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạothành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay hơi )

như Streptococcus diacetylactic

Vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột Các

vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hoá hết ởruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon

và các chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S

2.1.3.2 Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men lactic

sự cân bằng vi khuẩn trong đường ruột Vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm hội

chứng nhạy cảm đường ruột.[6]

Các vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêuhoá hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin,men, hocmon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác Nó cũng sinh ra các khí như

NH3, CO2, H2S Quá trình biến đổi đó gọi chung là quá trình lên men, mà nhờ nó,thức ăn được tiêu hoá hoàn toàn

Trong môi trường hoạt động của đại tràng, các vi khuẩn có ích có khả năng lấn áp, đèbẹp và tiêu diệt rất nhiều loại vi trùng gây bệnh

Lactobacillus cũng giúp tiêu hoá đường lactose trong sữa một cách dễ dàng

hơn Loại vi khuẩn có ích này cũng đem lại hiệu quả cao cho những người bị đaubụng tiêu chảy vì loạn khuẩn đường ruột do hậu quả của việc dùng quá nhiều khángsinh khiến các vi khuẩn có ích bị tiêu diệt

Một nghiên cứu gần đây cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus còn có tác dụng

chữa bệnh chàm ở trẻ em

Một số chủng Lactobacillus thường dùng trong lên men lactic như:

Lactobacillus bulgaricus: Lên men đồng hình, là trực khuẩn tròn, đôi khi ở

dạng hạt, thường kết thành chuỗi dài, Gram (+), không có khả năng di động.Chúng

có khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose, không lên menđược sacaroza, xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin Chúng

không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate Đây là giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối thíchcho phát triển là 40 – 45 oC, tối thiểu là 15 – 20 oC.

Hình 2.1 : Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [10]

Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+),

thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid Chúng không có khảnăng chuyển động Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose,mannose, galactose, maltose, lactose, salicin Trong quá trình lên men chúng tạo raD-acid lactic Nhiệt độ tối thích cho phát triển là 38 – 40 oC, nhờ có hoạt tínhproteaza nên có thể phân hủy protein trong sữa thành acid amin

Hình 2.2 : Vi khuẩn Lactobacillus casei [10]

Lactobacillus lycopersici: lên men lactic dị hình, là trực khuẩn Gram (+), sinh

hơi, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng đôi một, có khả năng tạo bào tử.Trong quá trình lên men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2

Ngày nay chúng được coi như các biến chủng của Lactobacillus brevis.[6]

Lactobacillus pasteurianus: là trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng: 0.5 –

1.0µm, dài: 7.0 - 35µm Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, không di động.Chúng có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose,tạo ra một loạt các sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic.Nhiệt độ thích hợp từ 29 – 33 oC

Lactobacillus bifidus: trực khuẩn rất nhỏ, thuộc loại Gram (+) Chúng không

có khả năng di động, có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose,galactose, saccharose, inulin, dextrin Nhiệt độ phát triển tốt nhất của vi khuẩn này là

37 oC

Lactobacillus causaciccus: Trực khuẩn Gram (+) ngắn, không có khả năng

chuyển động, có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, mannose,galactose, maltose, lactose, mannitol Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 – 50 oC

Latobacillus brevis: lên men lactic dị hình, là loại trực khuẩn Gram (+), không

có khả năng di động, có kích thước rộng: 0.7 – 1.0µm, dài: 2.0 – 4.0µm, tìm thấy chủyếu trong muối chua bắp cải Trong thiên nhiên chúng thường lêi kết với nhau thànhchuỗi Trong quá trình phát triển chúng có thể sử dụng lactate canxi như nguồn cungcấp carbon Chúng có khả năng lên men các loại đường arbinose, xylose, gluxose,fructose, galactose, maltose Trong lên men ngoài acid lactic (1,2%), nó còn tạothành acid acetic, rượu etylic (2,4%), CO2, nó còn tạo hương làm cho sản phẩm cóhương vị dễ chịu Nhiệt độ phát triển tối đa là 30 oC, vi khuẩn này có nhiều trong sữa,kefia, dưa chua…

Hình 2.3 Vi khuẩn Latobacillus brevis [10]

Lactobacillus leichmannii: trực khuẩn Gram (+) Trong tự nhiên chúng có khả

năng tạo thành chuỗi ngắn, kích thước tế bào từ 0.6 – 2.0µm Chúng có khả năng lênmen glucose, fructose, maltose, saccharose, trehalose và không có khả năng lên menlactose, galactose, raffinose, arabinose, rhamnose, dextrin, inulin Trong quá trình lênmen, chúng tạo ra L-acid lactic, không có khả năng tạo nitrit từ nitrat Nhiệt độ pháttriển tối ưu là 36 oC

Lactobacillus helveticcus: trực khuẩn, có kích thước rộng: 0.7 – 0.9µm, dài:

2.0 – 6.0µm Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng lẻ từng tế bào, cũng có thểtạo thành chuỗi tế bào Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose,galactose, mannose, maltose, lactose Nhiệt độ phát triển từ 40 – 42 oC Vi khuẩn nàyđược sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và phomai cứng

Lactobacillus thermophilus: là trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào 0.5 –

3.0µm, không có khả năng di động Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 oC, có thể chịuđược nhiệt độ 65 – 75 oC Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua

và phomai

Lactobacillus plantarum: trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào rộng: 0.7 – 1µm,

dài 3 – 8µm Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 oC, có khả năng chịu được nồng độ NaCl5,5% Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa.[6]

Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum [9]

Leuconostoc

Leuconostoc gồm những liên cầu khuẩn lên men lactic đồng dạng, lên men

đường sinh acid lactic và 1 lượng lớn acid acetic, cồn etylic, và khí CO2 Khả năng

của 2 loài Leuconostoc dextranicium và Leuconostoc citrovorum lên men acid citric

của sữa với sự sản sinh chất có mùi thơm diacetyl và khả năng kích thích liên cầu

khuẩn lactic làm cho chúng được đem dùng vào giai đoạn đầu của chế biến bơ vàphomai.

Một số đặc trưng của giống Leuconostoc cho nó vị trí quan trọng trong thực

phẩm như: Sản sinh diacetyl, sự chịu đựng của những nồng độ muối cao làm cho

Leuconostoc mesenteriodes được đem dùng ở giai đoạn đầu của sự lên men lactic Sự chịu đựng được ở những nồng độ đường cao đến 55 – 60% (đối với Leuconostoc mesenteriodes) làm cho vi khuẩn có thể phát triển trong xiro bán lỏng và kem đá…

sản sinh ra nhiều thán khí từ đường làm hư hỏng 1 số loại phomai, xiro

Hình 2.5 Vi sinh vật thuộc nhóm Leuconostoc [9]

Streptococcus

Streptococcus là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn, chủ yếu lên men lactic

đồng hình, kết song đôi hoặc thành chuỗi ngắn Giống ưa ấm, nhiệt độ phát triển tốithiểu là 10 oC, tối đa là 40 – 45 oC và phát triển tốt ở 30 – 35 oC Trong môi trường nótích tụ được 0.8 – 1% acid Một số chủng tạo thành bacteriocin

Một số dạng Streptococcus thường dùng để lên men lactic như:

Streptococcus lactis: là liên cầu khuẩn Gram (+) Nhiệt độ phát triển từ 10 –

45 oC, có thể chịu được nồng độ NaCl 4% Khi lên men đường glucose, maltose,lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, monnitol, tạo ra acid lactic, CO2,acid acetic, diacetyl Chúng có khả năng lên men được raffinose, inulin, glycerol,sorbitol Chúng được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm như sữa chua,

cream – bơ chua, phomai Streptococcus lactic có khả năng lên men 30 oC đối vớisữa, đường glucose, mantose, lactose, galactose

Hình 2.6 Vi khuẩn Streptococcus lactis [10]

Streptococcus cremoris : là tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và

tạo ít acid trong môi trường Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 25 oC, tối thiểu là 10

oC, và tối đa là 36 – 38 oC

Streptococcus thermophilus : có dạng hình cầu, kết thành chuỗi dài, phát triển

tốt nhất ở nhiệt độ 40 – 45 oC, tích tụ khoảng 1% acid Thường dùng phối hợp vớitrực khuẩn lactic để chế biến sữa chua và các loại đặc biệt, sữa chua nấu chín vàphomai

Hình 2.7 Vi khuẩn Streptococcus thermophilus [10]

Streptococcus falcalis : là tế bào Gram (+), chúng thường tạo thành chuỗi tế

bào hình cầu, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5%, có khả năng lên men đườngglucose, maltose, lactose, trehalose, silicin, sorbitol.[6]

Gần đây, người ta nghiên cứu sản xuất phomai từ sữa dừa dưới tác dụng của vi

khuẩn Streptococcus diacetylactis Giống được bảo quản trong môi trường sữa và

giữ trong tủ đông Nhiệt độ nuôi cấy sinh trưởng và lên men mạnh nhất khi nuôi cấy

ở 28 oC, phát triển khá ở 35 oC và thấp nhất ở 20 oC Sau nhiều thử nghiệm cho thấymôi trường tốt nhất là môi trường sữa bột gầy bổ sung glucose và nước chiết nấmmen.

Streptococcus diacetylactis còn được gọi là Pneumococci, là cầu khuẩn Gram (+), xếp từng đôi hay thành chuỗi, có vỏ bằng polysaccharide Pneumococci dễ bị ly

giải bởi những chất hoạt động bề mặt như muối mật Thường trú ở đường hô hấp trêncủa người và có thể gây viêm phổi, viêm xoang, viêm phế quản, nhiễm khuẩn máu,viêm màng não Ở bệnh phẩm đàm hay mủ, vi khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thànhchuỗi Khi trở nên già thì biến thành Gram (-) và dễ tự ly giải

2.1.4 Đặc điểm chung của Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus delbrueckii thuộc:

Loài: Lactobacillus delbrueckii

Trực khuẩn dài, kích thước 0,5- 0,8µm,2,0- 9,0 mm,không di động, Gram (+)

Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose,maltose và dexrin.Không có khả năng lên men xylose, arabinose, mannitol, inulin,rhamnose, lactose, raffinose, trehalose Ngoài ra chúng có thể đồng hóa được tinhbột

Thường gặp trên hạt đại mạch, trên bề mặt của thực vật và xác cây đang phângiải, đây là trực khuẩn lớn Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năngtạo thành sợi Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 50oC,pH là 4.5 – 6.8,khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúngkhông được dùng trong chế biến sữa

Thông thường có khả năng lên men đường thành acid lactic trong điều kiện kỵkhí

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic.

2.1.5.1 Ảnh hưởng của pH

pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong môi trường Thang pH thay đổi

từ 0-14, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Mỗisinh vật điều có một phạm vi pH nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất Vi sinh vật ưaacid có pH phát triển tốt nhất khoảng 0-5.5, vi sinh vật trung tính từ 5.5-8, vi sinh vật

ưa kiềm từ 8.5-11.5, vi sinh vật ưa kiềm cực đoan sinh truởng tối ưu ở pH 10 và lớnhơn Mặc dù mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng củachúng có giới hạn nhất định Khi pH của tế bào có sự biến đổi đột ngột sẽ phá vỡmàng sinh chất, ức chế hoạt tính của enzyme hay protein chuyển màng.[ 11]

Khi pH môi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn có phương phápthích nghi ở một giới hạn cho phép Phần lớn pH nội bào của vi sinh vật vẫn giữtrung tính, nguyên nhân là do tính thấm H+ qua màng sinh chất tương đối thấp Visinh vật trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+ thay cho H+ Visinh vật ưa kiềm cực đoan dung Na+ thay cho H+ từ môi trường bên ngoài Ngoài ra

hệ thống chất đệm nội bào cũng có tác dụng ổn định pH nội bào Trong quá trình traođổi chất của vi sinh vật sinh ra các chất có tính acid hoặc bazơ giúp trung hòa pH

môi trường Chẳng hạn, Thiobacillus có thể oxy hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh

tạo acid sulfuric, một số vi khuẩn phân giải acid amin tạo NH3 làm kiềm hóa môitrường.[11]

Vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus delbrueckii nói riêng có thể phát

triển được trong môi trường acid, khoảng pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5 Trongquá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ

ứu chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng ức chế sự phát triển của

Lactobacillus delbrueckii, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, dùng bazơ

để điều chỉnh pH về thích hợp

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rấtlớn đối với vi sinh vật Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các vi sinh vật đơn bàocho nên chúng rất mẫn cảm với sự biến hóa của nhiệt đô, và thường bị biến hóa cùng

với sự biến hóa về nhiệt độ của môi trường xung quanh Chính vì vậy, nhiệt độ của tếbào vi sinh vật cũng phản ánh trực tiếp nhiệt độ của môi trường xung quanh Mộtnhân tố quyết định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật đó

là tính mẫn cảm với nhiệt độ của các phản ứng xúc tác nhờ enzyme Trong phạm vinhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vìphản ứng xúc tác nhờ enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khinhiệt độ tăng lên 10 oC tốc độ phản ứng sẽ tăng gấp đôi Vì các phản ứng trong tế bàođều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và

vi sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn Lúc nhiệt độ tăng lên đến một lúc nhất định thìnhiệt độ càng tăng, tốc d 9ộ sinh trưởng càng giảm Khi nhiệt độ tăng quá cao, visinh vật sẽ chết Khi nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzyme, của cá cthểvận chuyển ( transport carryers) và các protein khác Màng sinh chất sẽ bị tổn thương

vì 2 lớp lippit sẽ bị hòa tan Do đó mặc dầu ở nhiệt độ cao các phản ứng xúc tác tiếnhành càng nhanh, nhưng do các nguyên nhân nói trên mà tế bào bị tổn thương đếnmức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng Tại điều kiện nhiệt độ rất thấpmàng sinh chất bị kết đông lại, enzyme cũng ngừng hoạt động Nói chung, nếu vựtquá nhiệt độ tốt nhất đối với vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào điều bị ảnhhưởng Nếu nhiệt độ rất thấp, tuy chức năng chịu ảnh hưởng nhưng thành phần hóahọc và kết cấu không nhất thiết bị ảnh hưởng.[11] Vi khuẩn lactic trong cơ thể pháttriển tốt nhất ở nhiệt độ từ 36 – 38 oC, ngược lại trong cơ thể động vật thì cao hơn từ

41 – 43 oC và có thể đạt đến 46.5 oC Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của

Lactobacillus từ 30 – 40 oC Lactobacillus delbrueckii phát triển trong khoảng nhiệt

độ 10 – 50 oC (Buchta, 1983)

2.1.5.3 Ảnh hưởng của oxy

Các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện có oxygen được gọi là vi sinh vậthiếu khí (aerobe), còn các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện không có oxygenđược gọi là các vi sinh vật kỵ khí (anaerobe) Hầu hết các cơ thể đa bào đều phải cầnsinh trưởng trong điều kiện có oxygen, chúng là các hiếu khí bắt buộc (obligateaerobes) Oxygen là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử khi

hô hấp hiếu khí Ngoài ra các vi sinh vật nhân thực (eucaryotes) hiếu khí còn dùng

không bắt buộc ( facultative anaerobes ) không cần oxygen để sinh trưởng nhưng khi

có oxygen thì sinh trưởng tốt hơn Khi có oxygen chúng sử dụng phương thức hô hấphiếu khí Các vi sinh vật kỵ khí tùy nghi (aerotolerant anaerobes ) như vi khuẩn

Enterrococcus faecalis có thể sinh trưởng như nhau trong điều kiện có hay không có oxygen Ngược lại vi khuẩn Bacteroides, Fusobacterrium, Clostridiun pasteurianum, Methanococcus… Sẽ bị chết khi có oxygen.[11]

L delbrueckii là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện.Trong điều kiện hiếu khí sinh khốicủa vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí Trong điều kiện hiếukhí, từ 1 phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp cácenzyme, từ 1 phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP, trong điều kiện kỵ khí từ 1phân tử glucose tạo ra 2ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợpmột số chất kháng khuẩn

2.1.6 Công nghệ sản xuất acid lactic:

2.1.6.1 Phương pháp sản xuất truyền thống:

Theo phương pháp truyền thống, công nghệ sản xuất acid lactic phải trải qua 3giai đoạn chính:

Chuẩn bị môi trường lên men

Người ta thường sử dụng nguồn mật rỉ vì rẻ và dễ kiếm Trước tiên mật rỉ cầnđược xử lý để tẩy màu và tách các chất keo có trong mật rỉ Để xử lý màu, người tathường dùng than hoạt tính Trước tiên mật rỉ cần phải được làm loãng theo tỉ lệ 1:3,sau đó cho chảy qua cột than hoạt tính.Than hoạt tính sẽ hấp phụ các chất màu

Sau đó làm loãng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% và dùng H2SO4 5% theokhối lượng dịch để acid hóa môi trường.H2SO4 có ý nghĩa rất quan trọng trong quátrình xử lý mật rỉ: H2SO4 như một chất chuyển hóa đường saccharose thành đườngnghịch đảo giúp quá trình lên men sau này tốt hơn Trong giai đọan này người ta đundung dịch 90 – 95 oC trong 6 giờ

Tiếp tục pha loãng dung dịch đường xuống còn 5 – 10% đường và điều chỉnh

pH ngược lại đến 6,3 – 6,5 Làm nguội dung dịch đường xuống 50 oC và bơm chúngvào thùng lên men để tiến hành quá trình lên men [5]

Giai đoạn lên men

Vi khuẩn lactic được nuôi cấy riêng ở phân xưởng nhân giống,khi lượnggiống đảm bảo về số lượng tế bào (khỏang.106 tế bào/ml) người ta chuyển giống vàothùng lên men với tỉ lệ giống là 2,5 – 3% Trong quá trình lên men, người ta sử dụngvôi mịn để trung hòa lượng acid tạo thành nhằm tránh hiện tượng acid hóa dung dịchlên men và tạo ra lactate canxi.Số lượng CaCO3 cho vào tùy thuộc vào lượng acidlactic tạo thành.Duy trì pH trong dịch lên men ở mức 5 – 6.

Trong quá trình lên men, người ta tiến hành khuấy trộn liên tục môi trường

Giai đoạn tạo lactate canxi và thu nhận acid lactic

Sau khi lên men xong,dung dịch lên men được đun nóng đến 80 – 90 oC.Người

ta dùng CaCO3 để điều chỉnh dịch đến pH 10 – 11 để yên từ 3 – 5 giờ.Sau đó loại bỏchất lắng,lọc dịch bằng máy lọc khung bản ở nhiệt độ 70 – 80 oC

Sau khi lọc xong, toàn bộ dịch lên men được chuyển sang thiết bị kết tủalactate canxi Quá trình tạo kết tủa lactate canxi phải mất 10 – 16 giờ.Kết thúc quátrình, người ta đem lọc bằng máy lọc khung bản

Để riêng kết tủa và dịch lọc.Dịch lọc được đem đi cô đặc lại và tiến hành kếttủa lại 1 lần nữa để thu hồi toàn bộ lượng acid lactic có trong dịch lên men Phần kếttủa này được trộn chung với phần trước và đem sang thiết bị thu nhận acid lactic.Đểthu nhận acid lactic người ta cho H2SO4 vào phần tủa.Phản ứng sẽ xảy ra và tạo thànhCaSO4 kết tủa và dung dịch chứa acid lactic ( C3H6O3)

Dung dịch acid lactic được đem đi khử màu bằng than hoạt tính và đem côđặc chân không để thu nhận acid lactic tinh khiết [5]

2.1.6.2 Phương pháp sản xuất hiện đại:

Phương pháp thẩm tích điện và trao đổi ion

Phương pháp này khác với phương pháp truyền thống ở 2 nội dung:

 Thay đổi giống và môi trường lên men

 Thay đổi phương pháp thu nhận acid lactic

Giống và môi trường lên men:

Giống dùng trong quá trình lên men là Lactobacillus acidophilus Lượng

giống cho vào để lên men là 5% so với dung dịch lên men

Dung dịch chứa đường: 40 – 100 đường trong 1000ml

1 – 4% nước chiết bắp

Người ta bổ sung khá nhiều khoáng vi lượng vào môi trường lên men

Nhiệt độ lên men 40 – 50 oC

Điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men là 4,8 – 5,7 bằng NaOH [5]

Phương pháp thu nhận acid lactic

Sau khi lên men người ta dùng CaCO3 đưa pH dung dịch lên men đến pH 6,5

và thực hiện các điều kiện cho việc tạo thành lactic canxi như phương pháp truyềnthống

Toàn bộ dung dịch, cả phần lactate và sinh khối được đưa vào thiết bị thẩmtích điện (eletro dialysis) để thu nhận lactate canxi ở dạng lỏng và sinh khối vi sinhvật Sinh khối vi sinh vật có khả năng lên men sẽ được chuyển ngược lại để lên men

mẻ kế tiếp Lactat canxi được cô đặc chân không và chuyển sang máy thẩm tích điệntrích ly (water spiltting eletrodialysis ) để thu nhận acid lactic Dung dịch acid lactic

sẽ được đưa qua cột trao đổi ion để tách các ion Ca+ và các cation khác Acid lacticsau khi thu được sẽ có độ tinh thiết 99% [5]

2.1.6.3.Phương pháp thu nhận acid lactic

Phương pháp thu nhận acid lactic ở pH > pKa

Đầu tiên người ta cho dung dịch lên men tiếp xúc với chất hấp thụ alamin 336(tricaprylylamin hòa tan trong methyl iso butylketone)

Tiếp đến, chất hấp phụ sẽ tiếp xúc với ammoniac và trialkylamin phân tử thấp

là trimethylamin (TMA) TMA sẽ được tạo thành trimethylamonium (TMAm), sau

đó TMA và hơi nước sẽ được tái sử dụng, còn acid lactic sẽ được thu nhận

Phương pháp tách pha

Acid lactic được chuyển thành lactat canxi ở dung dịch lên men Dung dịchnày được chuyển qua thiết bị lọc Phần sinh khối được tái sử dụng Phần lactat hòatan được cô đặc đến khoảng 40 – 70% khối lượng ban đầu ( Người ta điều chỉnh pHbằng NaCO3 đến pH 6,0 – 6,5 để tạo ra lactate natri)

Lactat natri được đưa vào thiết bị chứa trialkylamin và khí CO2 ở áp suất75pSi Lúc này dung dịch sẽ tạo thành hai pha:

* Pha hữu cơ gồm chất hấp phụ acid lactic

* Pha hòa tan gồm muối carbonate natri và acid carbonic

Người ta thu hồi acid lactic từ pha hữu cơ bằng phương pháp chưng cất chân khôngvới áp suất 2 – 10mmHg, ở nhiệt độ 80 – 240 oC [5]

2.2 Giới thiệu về rỉ đường mía.

2.2.1 Thành phần cấu tạo

Rỉ đường mía là phần còn lại của dung dịch đường sau khi đã tách phầnđường kính kết tinh Số lượng và chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào giống mía,điều kiện trồng trọt, hoàn cảnh địa lý và trình độ kỹ thuật chế biến của nhà máyđường Thông thường rỉ đường mía thu được bằng 3 ÷ 4% trọng lượng mía đưa vàochế biến Thành phần chính của rỉ đường là đường, các chất phi đường và nước Rỉđường mía có khoảng 20% nước, 62% đường và 10% chất phi đường hoặc cao hơnmột chút

Đường trong rỉ đường bao gồm 25 – 40% saccaroza 15 – 25% đường khử( glucoza và fructoza ) và 3 – 5% đường không lên men được tạo nên trong quá trìnhchế biến đường Ở đây do nhiều lần pha loãng và cô đặc một lượng nhất địnhsaccaroza bị biến thành hợp chất tương tự dextrin do tác dụng của nhiệt Chất này cótính khử nhưng không lên men được và không có khả năng kết tinh [2]

Ngoài saccaroza, glucoza và fructoza rỉ đường mía còn có một lượng nhỏ cácloại đường khác như rafinoza, lactoza, mantoza và xyloza [3]

Các chất phi đường gồm phi đường hữu cơ và phi đường vô cơ Phi đườnghữu cơ chứa nitơ của rỉ đường mía chủ yếu là các acid amin cùng với một lượng rấtnhỏ protein và sản phẩm phân giải của nó Các acid amin từ nước mía dễ dàng đi vào

rỉ đường vì phần lớn chúng rất dễ hòa tan trong nước trừ tiroxin và xixtin Nitơ tổng

số trong rỉ đường mía của Mỹ xê dịch trong khoảng 0.4 ÷ 1.5% trung bình là 0.7%trọng lượng của rỉ đường Hợp chất phi đường không chứa nitơ bao gồm pectin,araban, galactan hoặc các sản phẩm thủy phân của chúng là arabinoza và galatoza,chất nhầy, chất màu và chất thơm Pectin bị kết tủa trong quá trình chế biến đườngnhưng các chất vừa nói không kết tủa và gần như toàn vẹn đi vào rỉ đường (1.22 –1.56%)

Matubara K và Kinoshita, S đã phân tích định tính các loại acid hữu cơ vàcho biết các acid sau đây có trong rỉ đường mía của các nước Đông Nam Á : acid

gluconic Riêng acod aconitric có nồng độ khá cao, xấp xỉ 1.0 – 1.5% Sự có mặt củaacid này càng nhiều thì sản lượng đường càng thấp Đặc biệt các loại mía có vị chuakhông thể đưa vào sản xuất được Mía trồng ở những vùng quá nóng như Louisiana

và Florida phát triển rất nhanh nên nồng độ aconitic trong mía là 0.1 – 0.2% và trong

rỉ đường là 3 – 7% Do vậy người ta đã tiến hành thu hồi loại acid này làm phụ phẩmcủa nhà máy đường trước khi đem rỉ đường đi chế biến

Các chất màu của rỉ đường bao gồm các chất caramen, melanoit, melanin vàphức phenol-Fe+2 Cường độ màu tăng ba lần khi nhiệt độ tăng thêm 10 oC Có thểchia các hợp chất màu thành nhiều nhóm:

_ Chất caramen: Xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân sacharoza kèm theo lọaitrừ nước và không chứa một chút nitơ nào Khi pH không đổi, tốc độ tạo chấtcaramen tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng

_ Phức chất polyphenol -Fe+2: là Fe+2- brenzcatechin có màu vàng xanh khôngthể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường

_ Melanoidin: Đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và acid amin mà chủyếu là acid aspactic Sản phẩm ngưng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vaitrò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đường

_ Melanin: Được hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acid amin thơmnhờ xúc tác của enzyme polyphenol-oxydaza khi có mặt của O2 và Cu+2 Các acidamin thơm thường bị oxy hóa là tiroxin và brenzocatechin Các melanin thường bịloại hết ở giai đoạn làm sạch nước đường nên chỉ tìm thấy lượng rất nhỏ trong rỉđường

_ Humin: Được trùng hợp từ 66 – 68 các đơn vị cấu tạo của acid amin Từ đóphân tích ra khoảng 52 – 53 gốc acid aspactic, 5 gốc acid amino-β-butyric, 2 gốc acidglutamic, 2 gốc β- amino propionic và 1 gốc acid p- butyric, 2 gốc acid -p- amino-izovaleric

_ Ngoài ra rỉ đường còn chứa hợp chất màu nâu có công thức cấu tạo C17

-18H26-27O10N [3]

_ Chất keo: Có trong rỉ đường chủ yếu là pectin, chất sáp và chất nhầy Cácchất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng baobọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản

phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài môi trường Ngoài ra các chất keo là nguyênnhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sửdụng thiết bị

_ Các chất phi đường vô cơ chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thànhphần tro của rỉ đường Độ tro của rỉ đường mía thấp hơn độ tro của rỉ đường củ cảiđường Muối Kali có khá nhiều trong rỉ đường tiếp đến là canxi và dư lượng SO2.Điều này dễ hiểu vì muối Kali được dùng để bón cho mía còn muối canxi và gốcsunfat được thêm vào ở giai đoạn xử lý nước mía và tinh luyện đường

Bảng 2.1 Thành phần tro trong chất khô của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải

mg

Rỉ đường mía rất giàu các chất sinh trưởng như acid pantotenic, nicotinic,folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin Rỉ đường mía Mĩ không thua kém cao ngô là loạivẫn thường dùng làm nguồn cung cấp chất sinh trưởng cho một số loại môi trườngnuôi cấy vi sinh vật

Bảng 2.2 Thành phần một số chất sinh trưởng của rỉ đường mía và cao ngô

2.2.3 Vi sinh vật trong rỉ đường mía:

Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía Đa số chúng từ nguyên liệu, một

số nhỏ từ không khí, và đất vào dịch đường Loại nào chịu được tác dụng nhiệt haytác dụng của hóa chất thì tồn tại Có thể phân chúng thành 3 loại: Vi khuẩn, nấm men

và nấm mốc Trong đó lọai đầu là nguy hiểm hơn cả vì nó gồm nhiều giống có khảnăng sinh bào tử Người ta chia rỉ đường làm 3 loại tùy theo số lượng vi sinh vật tạpnhiễm ( Bảng 2.3):

Bảng 2.3 Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm[3]

Loại rỉ đường Số lượng vi sinh vật

trong 1 gram rỉ đường

Đánh giá và xử lý

II 100,000 – 1,000,000 Trung bình, cần thanh trùng.III 1,000,000 – 5,000,000 Nhiễm nặng, cần xử lý nghiêm

ngặt bằng hóa chất và tác dụngnhiệt

2.2.4 Lực đệm của rỉ đường mía

Lực đệm là loại lực có sức tự cản sự biến đổi phản ứng của rỉ đường khi bổsung kiềm hoặc axít Rỉ đường mía có tính đệm đặc trưng Bình thường pH của rỉđường mía nằm trong khỏang 5.3 – 6.0 Trong quá trình bảo quản pH có thể bị giảm

do hoạt động của vi sinh vật tạp nhiễm tạo ra các acid hữu cơ Khi thêm HCl hay

H2SO4 vào rỉ đường, acid sẽ tác dụng với các muối kiềm của các acid hữu cơ tự do,qua đó pH của rỉ đường bị thay đổi rất ít khi tiếp tục thêm acid HCl hay H2SO4 Lực

đệm của rỉ đường biểu hiện mạnh nhất ờ pH 3.0 – 5.0, trung bình ở pH5.0 – 6.0 vàrất ít ở pH 6.0 – 7.07.

Mía đường là thế mạnh của Việt Nam, vào năm 2000 đạt năng suấttriệu tấn/năm Do đó khả năng tận dụng nguồn rỉ đường là rất lớn Hiện nay rỉ đườngchủ yếu được ứng dụng sản xuất acid lactic và ethanol Nghiên cứu của ArtiDumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and DigambarGokhale tại Ấn Độ, sử dụng nguồn rỉ đường để lên men sản xuất acid lactic, tác giả

đã sử dụng nguồn đường trong rỉ đường cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn

Lactobacillus delbrueckii subsp, do trong rỉ đường hàm lượng protein rất thấp do đó

cần bổ sung cao nấm men cung cấp nitơ cho vi khuẩn Kết quả khảo sát hàm lượngcao nấm men 0.5g/l cho hàm lượng acid lactic đạt nồng độ tối ưu là 166g/l.[8]

2.3 Cố định tế bào vi sinh vật:

2.3.1 Định nghĩa:

Sự cố định tế bào vi sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào vi sinhvật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch nhưng vẫn có khả năngtrao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên Phase chứa tếbào thong thường không tan trong nước và là polymer cao phân tử có tính ưa nước

Tế bào sau khi cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thểchủ động ngừng phản ứng nếu mong muốn

2.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của tế bào vi sinh vật cố định:

đối với quá trình vận chuyển cơ chất và sự cản trở này rất khó đánh giá về mặt địnhlượng, enzyme đặc hiệu của tế bào vi sinh vật cố định có thể giảm hoạt độ riêng.[5]

2.3.3 Các yêu cầu đòi tế bào vi sinh vật cố định:

Sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp,các tế bào phải có khả năng chiếm thể tích riêng của thiết bị phản ứng nhiều nhấtnhằm làm tăng năng suất thể tích

Cơ chất và sản phẩm tạo ra phải có khả năng khắc phục được hàng rào cản trởkhuếch tán, chất xúc tác (tế bào gắn vào chất mang ) phải dễ dàng khuấy trộn được

và bền về mặt cơ học

Chất xúc tác phải ổn định trong khoảng nhiệt độ họat động của quy trình côngnghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình công nghệ,phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào họat động của quá trình traođổi chất đặc thù với từng cơ thể vi sinh vật [5]

2.3.4 Giới thiệu về chất mang Cellulose vi khuẩn ( Bacterial Cellulose –

BC )

Cellulose là một lọai polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất, khôngnhững được xem như thành phần chính của sinh khối thực vật, mà còn là đại diệnpolymer ngọai bào của vi sinh vật BC phụ thuộc vào những sản phẩm đặc trưng củaquá trình trao đổi chất nguyên thủy và chủ yếu là màng bảo vệ, trong khi cellulosethực vật đóng vai trò cấu trúc tế bào

Cellulose được tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, và Sarcina (Jonas và Farah, 1998) Các sinh vật tổng hợp Cellulose hiệu quả nhất là vi khuẩn sinh acid acetic, Gram (-) Acetobacter xylinum (phân loại như Gluconacetobacter xylinus, Yamada và cộng sự, 1997; Yamada,2000), loại vi

khuẩn được sử dụng làm vi sinh vật mẫu dùng trong những nghiên cứu ứng dụng vànghiên cứu cơ bản trên cellulose

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của BC là độ tinh sạch hóa học.Đây là đặc điểm phân biệt cellulose vi khuẩn với cellulose thực vật, loại cellulosethường liên kết với hemicellulose và lignin

Do những đặc tính duy nhất được tạo ra từ cấu trúc hạt cực mịn, BC có nhiềuứng dụng trong ngành giấy, dệt sợi và công nghệ thực phẩm; được xem như vật liệu

sinh học trong nghành mỹ phẩm và y khoa (Ring và cộng sự, 1986) Ứng dụng rộnghơn của loại polysaccharide này phụ thuộc vào quy mô sản xuất và chi phí của nó.Vìvậy,các nghiên cứu cơ bản được tiến hành cùng những nghiên cứu chuyên sâu vềlĩnh vực cải tiến giống và phát triển quá trình sản xuất.

Hình thái đại thể của BC phụ thuộc nghiêm ngặt vào những điều kiện nuôi cấy( Watanabe và cộng sự,1998,a; Yamanaka và cộng sự,2000) Trong các điều kiệntĩnh, vi khuẩn tích lũy các mãng (BC-S) cellulose trên bề mặt môi trường nước luộcthịch chứa dinh dưỡng ở mặt phân giới ( phân cắt phase) khí-lỏng giàu oxy Các sợiphụ cellulose nhô ra từ các lỗ sắp theo thứ tự đường thẳng ở bề mặt của tế bào vikhuẩn, kết tinh thành các vi sợi và ép sâu hơn vào môi trường tăng trưởng.Vì thế,

màng mỏng giống như da, nâng đỡ quần thể tế bào A.xylinum bao gồm các dãi

cellulose chồng lên nhau và xoắn vào nhau tạo thành các mặt phẳng song song và vô

tổ chức (Jonas và Farah,1998) Các sợi BC-S liền kề nhau thường ích phân nhánh vànối liền nhau hơn các sợi của BC được tạo trong môi trường cấy lắc (BC-A), ở dạngnhững thể hạt không đều nhau, những dãi hình sao và hình sợi, phân tán đều trongnuôi cấy lỏng ( Vandamme và cộng sự, 1998)

Tính chất

BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao hơn so với các dạng cellulose khác,không chứa lignin và hemicellulose BC có thể bị phân hủy hoàn toàn

Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao

Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt Trong điều kiện ngậpnước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose

Khả năng kết sợi tạo tinh thể tốt

Tính bền cơ học tốt, khả năng chịu nhiệt tốt

Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sảnphẩm mong muốn không cần qua bước trung gian Chẳng hạn như sản xuất giấykhông cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ Đặc biệt là vikhuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ Trong cấu trúc BCthu được trong điều kiện là nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màngtạo nên chặc chẽ hơn [5]