Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Bài 2 Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry I Mục đích, ứng dụng thí nghiệm + Xác định hàm lượng protein hòa tan có trong mẫu bằng phương pháp Lowry + P.

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH Bài 2: Xác định hàm lượng protein hòa tan phương pháp Lowry I Mục đích, ứng dụng thí nghiệm: + Xác định hàm lượng protein hịa tan có mẫu phương pháp Lowry + Phương pháp dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:  2.1 Dụng cụ, hóa chất: + Dụng cụ: * Bình định mức 100ml * Cân * Cối, chày * Giấy lọc * Đũa thủy tinh * Giấy thị * Micropipet  * Máy đo quang * Ống đong * Ống nghiệm + Hóa chất:  * Nước cất * Albumin huyết bò * Dung dịch NaOH 0,1N * Dung dịch HCl 0,1N * Mẫu xúc xích cần phân tích * Dung dịch C * Dung dịch Folin 2.2 Quy trình thí nghiệm: 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch gốc protein chuẩn: + Phịng thí nghiệm pha sẵn albumin huyết bò (BSA) nồng độ 1mg/ml 2.2.2 Tiến hành: Bước 1: Nghiền mẫu xúc xích để chiết protein (1) Dùng ống đong chuẩn bị 20ml NaOH 0,1N vào cốc dung tích 100ml (2) Cân khoảng 0,3g mẫu Ghi lại lượng cân (3) Chuyển mẫu vào cối, cho dung dịch NaOH 0,1N từ cốc vào để làm ẩm (4) Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml (5) Tráng cối chày dung dịch NaOH 0,1N lại (6) Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein 15 phút (7) Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) HCl 0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm dịch lên miếng giấy thử pH so với dải màu chuẩn) (8) Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức nước cất tới vạch Trộn (9) Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích Bước 2: Chuẩn bị ống thủy tinh thấp, Đánh số thứ tự từ đến Bước 3: Bổ sung hóa chất với lượng tương ứng bảng sau, tạo hệ nồng độ BSA (Ci) Ống falcon Dung dịch BSA gốc (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 Nước cất (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 Nồng độ dung dịch BSA 0,2 0,4 0,6 0,8 làm việc Ci (mg/ml) Bước 4: Trộn vortex thu dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci Bước 5: Chuẩn bị ống thủy tính cao, Đánh số thứ tự từ đến 12 Cho dung dịch từ ống đến vào ống đến 12 Lấy dung dịch từ ống Cho vào ống nghiệm Thể tích dung dịch BSA làm việc Ci mg/ml (ml) Dung dịch C (ml) 0,3 0,3 0,3 10 0,3 11 0,3 12 0,3 3 3 3 Bước 6: Lấy ống thủy tinh dài, đánh dấu Mẫu, cho vào 0,3ml mẫu chiết, 3ml dung dịch C Để bên phải ống số 12 thành hàng Bước 7: Trộn vortex, sau để yên 10 phút Bước 8: Trộn dung dịch Folin, lắc tạm sau cho dung dịch folin vào ống Ống thí nghiệm Dung dịch Folin (ml) 0,3 0,3 0,3 10 0,3 11 0,3 12 0,3 Mẫu 0,3 Bước 9: Trộn vortex, để yên 20 phút Bước 10: Đo độ hấp thụ bước sóng 750nm (OD 750nm) Đọc kỹ Hướng dẫn sử dụng máy đo quang PTN Ở đây, mẫu trắng mẫu ống nghiệm (mẫu blank) III.Kếtquả: Bảng số liệu thu từ máy đo quang: Ống thí nghiệm Nồng độ protein Ci (mg/ml) OD750nm 0,2 0,4 10 0,6 11 0,8 12 Mẫu Chưa biết 0,128 0,213 0,297 0,372 0,485 0,176 Đồ thị đường chuẩn protein 0.6 0.5 f(x) = 0.463 x + 0.0176666666666666 R² = 0.99332392616513 OD750nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 Nồng độ BSA (mg/ml) 0.8 1.2 + Thu đồ thị có hàm số: y=0,463 x +0,0177 Với: x nồng độ BSA (mg/ml) y mật độ quang OD với ánh sáng có bước song 750nm + Giá trị R2 thu là: R2 = 0,9933 + Ở mẫu nghiên cứu, có giá trị OD 0,176 ( nằm khoảng tuyến tính đồ thị) Suy ra, ta có: 0,176=0,463 x+ 0,0177 ¿> x=0,3419 Vậy nồng độ protein chứa mẫu xúc xích 0,3419 (mg/ml) + Vì mẫu xúc xích pha lỗng nước cất tới thể tích 100ml Suy hàm lượng protein 100ml mẫu là: 0,3419.100=34,19 ( mg ) ¿ 0,03419( g) + Vì khối lượng mẫu xúc xích 0,3 (g) Suy hàm lượng protein mẫu tính theo phần trăm là: 0,03419 100 % ≈ 11,4 % 0,3 IV Nhận xét kết quả: + Từ đồ thị ta có giá trị R2¿ 0,9933 ≈ 1, tức số liệu đo có độ tuyến tính tương đối cao + Để thu kết xác nhất, cần ý số điểm q trình thí nghiệm:  Các dụng cụ cần phải làm trước tiến hành thí nghiệm  Trong q trình chiết protein từ mẫu xúc xích, cần đun ổn định 7080oC Khơng đun cao nhiệt độ cao gây biến tính protein Cũng khơng nên đun nhiệt độ thấp hiệu suất chiết không cao  Trong trình tạo hệ nồng độ BSA, sử dụng micropipet để bổ sung hóa chất vào ống nghiệm, cần phải thay đầu côn liên tục, nhằm đảm bảo nồng độ ống nghiệm xác  Sau lần pha hóa chất, cần phải đem ống chứa albumin lắc vortex, giúp albumin tan dung dịch  Mẫu kiểm chứng mẫu thí nghiệm cần phải tiến hành đo điều kiện: thiết bị đo, sử dụng cuvet