BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH BÀI 1 XÁC ĐINH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I Nguyên tắc của phương pháp phân tích a Nguyên tắc Phân hủy phần mẫu thử bằng H2SO4 đậm đặc với sự có mặt c.
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH BÀI : XÁC ĐINH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I Nguyên tắc phương pháp phân tích a Nguyên tắc Phân hủy phần mẫu thử H2SO4 đậm đặc với có mặt chất xúc tác để chuyển hóa nitơ hữu thành (NH4)2SO4 NaOH dư thêm vào dịch phân hủy nguội để giải phóng NH3 NH3 giải phóng chưng cất vào dung dịch Boric H3BO3 dư, Định phân lượng Tetraborat amôn tạo thành dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn Từ tính lượng nitơ có mẫu ngun liệu thí nghiệm từ lượng amoniac tạo thành b Giải thích nguyên tắc - Giai đoạn 1: Đốt đạm Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, hợp chất hữu bị oxi hóa Cacbon hidro tạo thành CO2 H2O cịn nito sau giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch: R – CH - COOH + H2SO4 = NH3 + CO2 + SO2 + H2O | NH2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 - Giai đoạn 2: Cất đạm Đuổi ammoniac khỏi dung dịch NaOH đồng thời cất thu lượng dư axit boric H3BO3: (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 Lúc dung dịch bình hứng có màu tím (Do mơi trường acid yếu H3BO3 nên thuốc thử Taxiro có màu tím) hấp thụ NH3 chuyển sang màu xanh (Do môi trường kiềm xảy phản ứng trung hịa nên thuốc thử Taxiro có màu xanh lá) (Để kiểm tra xem NH3 hấp thụ hoàn toàn hay chưa ta sử dụng giấy quỳ tím) 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2SO4 (xanh) + 7H2O - Giai đoạn 3: Định lượng NH3 tạo thành H2SO4 0,1N Định phân lượng tetraborat amon tạo thành dung dịch H2SO4 chuẩn, qua dễ dàng tính lượng nito có mẫu vật (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 4H3BO3 (xanh) (tím) (tím hồng) Thời điểm dừng định phân thời điểm mà dung dịch bình hấp thụ NH3 vừa chuyển từ màu xanh sang màu tím (Do mơi trường lúc lại có tính acid H2SO4 phản ứng với Tetraborac amon tạo acid Boric nên chất thị Taxiro có màu tím) Cũng hấp thụ NH3 lượng dư axit sunfuric hay clohidric chuẩn Sau đem định phân axit sunfuric dư không phản ứng với NH3 để tạo thành amon sunfat dung dịch NaOH chuẩn, suy lượng H2SO4 tham gia phản ứng với NH3: 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 H2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O Từ lượng H2SO4 tiêu tốn ta nhân với hệ số chuyển lượng Nitơ tổng số mẫu Một số ý làm thí nghiệm: - Loại bỏ hết Nito protein - Ở bước vơ hóa Protein thực đốt nóng mẫu nhiệt độ 350 – 380oC Thời gian đốt nóng mẫu thường dài khoảng – 4h phụ thuộc lượng mẫu vật, vào nguồn nhiệt, vào chất xúc tác Nếu dùng muối đồng sunfat với lượng lớn (1-2g) thời gian đốt mẫu khoảng – 3,5h Nếu dùng H2O2 thời gian đốt khoảng 40 -50 phút Nếu dùng selen thời gian đốt mẫu khoảng 30 -40 phút Nếu dùng hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100 : 10 : 1) 50 – 60 phút Phải thực q trình vơ hóa mẫu vật tủ đốt để tránh khí SO2 bay gây nguy hiểm - Rửa cất đạm, phễu nước cất trước làm thí nghiệm để tránh lượng đạm cịn sót lại thí nghiệm trước - Phải cho hóa chất theo thứ tự: NaOH 40% H2O dịch vơ hóa mẫu phải đóng phễu bầu cất sau cho vào để tránh thất thoát NH3 - Phải thực với mẫu đối chứng để làm vơ hiệu hóa tác động yếu tố môi trường đến kết thí nghiệm II Số liệu thí nghiệm a Loại mẫu Mẫu phẩm đem vơ hóa mẫu giàu protein b Thể tích *Mẫu thí nghiệm: - Bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác + 20ml H3BO3 3% + 2-3 giọt thị Taxiro - Cho vào bình cất: + 5ml NaOH 40% + 2ml H2O + 5ml dịch vơ hóa mẫu *Mẫu kiểm chứng: - Bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác +20ml H3BO3 3% +2-3 giọt thị Taxiro - Cho vào bình cất: + 5ml NaOH 40% + 7ml H2O (5ml thay cho dịch vơ hóa) c Kết Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng Lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn(ml) 3,5 ml 0,1 ml III Tính tốn kết a Thiết lập công thức - Xác định hàm lượng protein Thơng thường thực phẩm có khoảng 16% Nito 100g protein có 16g Nito Hàm lượng protein = Lượng nito × 100/16 = Lượng nito x 6.25 - Vì ml H2SO4 0.1N tiêu tốn cho định phân tương ứng với 1.4 mg Nitơ có mẫu cất nên ta có cơng thức tính số miligam Nitơ có ml mẫu là: N = 1.4 x (a – b) (mg) (1) đó: N lượng Nitơ tổng số 5ml mẫu thí nghiệm (ml) a số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu thí nghiệm (ml) b số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu đối chứng (ml) 1.4 hệ số chuyển đổi lượng H2SO4 tiêu tốn định phân sang lượng Nitơ tương ứng - Cơng thức tính tổng hàm lượng Nitơ dịch cất đạm (%): %(w/v) = x 100% (2) đó: %(w/v) hàm lượng nitơ dịch cất đạm tính % a số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu thí nghiệm (ml) b số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu đối chứng (ml) 1.4 hệ số chuyển đổi lượng H2SO4 tiêu tốn định phân sang lượng Nitơ tương ứng V lượng dung dịch vơ hóa đem cất (ml) hệ số chuyển đổi lượng Nitơ từ miligam sang gam b Tính tốn Có: VH2SO4(mẫu thí nghiệm) = 3.5 ml = a VH2SO4(mẫu kiểm chứng) = 0,1 ml = b - Từ kết chuẩn độ, thay số vào công thức (1) ta được: N = 1.4 x (a – b) = 1.4 x (3.5 – 0.1) = 3.4 (mg) - Áp dụng cơng thức (2) ta tính hàm lượng Nitơ dịch cất đạm (%): %(w/v) = x 100% = x 100% = 0.0952% IV-Nhận xét - Kết thí nghiệm có sai số do: Sai số quy trình đến bước: sử dụng pipet lấy mẫu chưa xác, cho dung dịch vào phễu phản ứng với tạo NH3 bay khơng khí chưa đóng phễu làm thất thoát NH3, chưa hấp thụ hết NH3 vào bình ngưng tụ, kĩ thuật chuẩn độ chưa xác Để giảm thiểu sai số cần ý bước - Dùng CCT Tashiro : Axit boric H3BO3 có pH = + Dải đổi màu Tashiro pH : 4,4 – 6,2 + Thành phần : methylen xanh 0.2% methyl đỏ 0.2% ethanol methanol Chức xanh methylen làm thay đổi chuyển dịch màu đỏ vàng cảu đỏ metyl thành chuyển dịch xanh tím rõ ràng Có thể thay CTT tashiro alirazin natri sunfonate muối natri hòa tan nước axit Alizarin sulfonic với cơng thức hóa học C ₁₄H ₇NaO ₇S CCT metyl đỏ 1% pha cồn - Vai trị chất xúc tác q trình vơ hóa mẫu : + CuSO4 : K2SO4 = 1:10 : Làm cho lượng hoạt hóa nito giảm xuống, giai đoạn vơ hóa mẫu có mặt xúc tác CuSO4 , K2SO4 thích hợp để chuyển tồn hỗn hợp chứa N2 có mẫu thành NH4+ Có tác dụng làm tăng nhiệt độ sơi H2SO4 làm tăng cường vận tốc q trình phản ứng - Ngồi việc giúp xác định hàm lượng Nitơ tổng số mẫu thực phẩm hàm lượng Nitơ Protein phương pháp Kjelhahl giúp xác định hàm lượng Nitơ phi protein hàm lượng Protein mẫu thực phẩm Nếu biết lượng Nitơ Protein ta lấy nhân với hệ số N tùy theo loại mẫu thực phẩm (VD: với sữa nhân hệ số 6.38) lượng Protein mẫu thực phẩm Và lấy lượng Nitơ tổng số trừ lượng Nitơ protein ta lượng Nitơ phi Protein xác định hàm lượng Nitơ Protein cách trực tiếp cách đem vơ hóa nước lọc sau kết tủa protein - Phương pháp tiêu hóa Kjeldahl có số nhược điểm Phương pháp đo lượng Nitơ hợp chất hữu (protein, axit amin, axit nucleic) NH4+ mẫu Các dạng Nitơ khác, chẳng hạn Nitrat Nitrit, đo thông qua phương pháp ... việc giúp xác định hàm lượng Nitơ tổng số mẫu thực phẩm hàm lượng Nitơ Protein phương pháp Kjelhahl giúp xác định hàm lượng Nitơ phi protein hàm lượng Protein mẫu thực phẩm Nếu biết lượng Nitơ... với hệ số N tùy theo loại mẫu thực phẩm (VD: với sữa nhân hệ số 6.38) lượng Protein mẫu thực phẩm Và lấy lượng Nitơ tổng số trừ lượng Nitơ protein ta lượng Nitơ phi Protein xác định hàm lượng. .. chứng Lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn(ml) 3,5 ml 0,1 ml III Tính tốn kết a Thiết lập cơng thức - Xác định hàm lượng protein Thơng thường thực phẩm có khoảng 16% Nito 100g protein có 16g Nito Hàm lượng