TIỂU LUẬN Đề tài ĐỊNH LƯỢNG MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Mục lục I Tổng quan về Melamine 2 1 Melamine là gì 2 2 Điều chế 2 II Tổng quan về Melamine trong sữa 3 1 Độc tính của melamine 3 2.III. Xác định hàm lượng melamine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
TIỂU LUẬN Đề tài: ĐỊNH LƯỢNG MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Mục lục I - - - Tổng quan Melamine Melamine Melamine chất hữu cơ, màu trắng pha lê, khó hịa tan nước Tên khoa học melamine 1,3,5- triazine-2,4,6-triamine, có cịn gọi cyanuramide hay cyanurotriamine, với cấu trúc hóa học gồm nguyên tử carbone, nguyên tử hydrogen nguyên tử nitrogen Melamine trime cyanamid, giống cyanamid, phân tử chúng chứa 66% nitơ theo khối lượng chúng có đặc tính dễ cháy Trọng lượng phân tử melamine: 126.12 g/mol Công thức tổng quát C3H6N6 Công thức khai triển: - Nhiệt độ nóng chảy: 350 °C (623 K; 662 °F) - Nhiệt độ sôi: Sublimes - Độ hòa tan nước: 3.1g/l (20°C) - Melamine dẫn chất thuốc trừ sâu cyromazine hình thành bên thể động vật có vú từ cyromazine1 Có nghiên cứu cịn cho thấy melamine hình thành cyromazine có mặt mơ thực vật Điều chế Nhà hóa học người Đức Liebig người tổng hợp melamine vào năm 1834 Ban đầu, calcium cyanamide biến đổi thành dicyandiamide, sau đốt nóng nhiệt độ tan chảy thành melamine Tuy nhiên, nhà máy sản xuất sử dụng ure phản ứng sau để tạo melamine (NH2)2CO C3H6N6 + NH3 + CO2 Phản ứng diễn giải theo hai bước sau: - Đầu tiên urê phân hủy tạo thành axit cyanic ammoni, phản ứng thu nhiệt: (NH2)2CO → HCNO + NH3 - Sau axit cyanic polyme hóa tạo thành melamin khí carbon dioxide: HCNO → C3H6N6 + CO2 Phản ứng sau tỏa nhiệt, xét tồn q trình phản ứng thu nhiệt Ứng dụng Melanin a Công nghiệp - - Melamine (CAS No.108-78-1) sử dụng trình sản xuất loại nhựa dẻo melamine (phản ứng với formaldehyde), sản xuất hồ, nhựa ép, giấy dán, hợp chất gắn kết, vật liệu bọc chất chống cháy Melamine sử dụng sản xuất bêtông nhằm làm giảm hàm lượng nước, tăng khả chịu lực… Nông nghiệp Melamine hình thành (như dẫn chất) từ thuốc trừ sâu cyromazine Melamine sử dụng làm phân bón sở hữu hàm lượng nitơ cao Melamine có mặt thuốc có gốc asen dùng điều trị xoắn trùng Châu Phi b - Cơng nghiệp thực phẩm Vì hàm lượng nitơ cao nên melamine nhà sản xuất "gian dối" dựa vào thực phẩm : sữa Ngồi sữa melamine cịn xuất sản phẩm dùng sữa làm nguyên liệu cà rem, sữa chua, kẹo, bánh biscuit, … c - II Tổng quan Melamine sữa Độc tính melamine Những nghiên cứu trước cho melamine có độc tính thấp kết hợp : - Gây độc cấp tính Số liệu thí nghiệm chuột cho thấy liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) 3.000mg /kg khối lượng thể melamine đưa vào theo đường miệng LD50 thỏ làm thí nghiệm kích thích da lớn 100mg/kg Melamine gây kích thích da lớn 1000mg /kg Melamine gây kích thích cho da mắt Một nhóm nhà khoa học Liên Xơ cũ cho muối tạo thành từ Melamine acid cyanuric (muối sử dụng chống cháy) có độc tính mạnh hai chất riêng rẽ Nếu đưa muối melamine trực tiếp vào dày chuột, LD50 4,1g/kg cho chuột, LD50 3,5g/kg Các số liệu tương ứng chuột nhắt 7,7g /kg 3,4g/kg Mèo ăn thức ăn chứa melamine có biểu hư thận - Gây độc mãn tính Nếu ăn thực phẩm chứa melamine dẫn đến tổn thương đường tiêu hóa, sỏi bàng quang, sỏi thận ung thư bàng quang Melamine tìm thấy mơ thận mèo chó cho ăn thức ăn chứa melamine Sự lắng đọng tinh thể muối melamine có khả gây bệnh tích thận heo cá tương tự acid uric gây sỏi thận người Tinh thể melamine khó tan, di chuyển chậm đường tiết niệu (từ thận xuống nệu đạo) nên có khả gây triệu chứng độc cấp tính Tại melamine lại cho vào sữa tươi sữa bột trẻ em? Vì hàm lượng nitơ cao nên melamine nhà sản xuất "gian dối" đưa vào thực phẩm Cơ sở để họ thực điều phương pháp kiểm tra phương pháp Kjeldahl phương pháp Dumas đo hàm lượng đạm thực phẩm (một số dinh dưỡng) qua việc xác định hàm lượng nitơ Chính melamine dùng để "lừa" phương pháp kiểm tra, lừa quan kiểm tra tất nhiên lừa người tiêu dùng Vậy nhà sản xuất lại đưa melamine vào thực phẩm mà sữa sản phẩm dùng sữa làm nguyên liệu.? Câu trả lời ngắn gọn là: để tăng giá sản phẩm Đơn giản lượng protein sữa nhiều nhà sản xuất có lý để tăng giá sữa từ nâng giá sản phẩm lên - III - - Xác định hàm lượng melamine sữa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp HPLC HPLC phương pháp sắc ký phát triển dựa phương pháp ghi sắc ký cột (column chromatography) Thay để dung mơi nhỏ giọt qua cột ghi sắc ký tác dụng trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để dịch chuyển xảy nhanh Phương pháp cho phép sử dụng hạt có kích thước nhỏ cột hấp phụ (column packing material) làm tăng bề mặt tiếp xúc pha tĩnh (stationary phase) phân tử qua Điều tăng cường khả phân tích chất có hỗn hợp HPCL dựa vào pha động ( dạng lỏng ) để phân tách thành phần trộn lẫn vào Những thành phẩn hòa tan vào dung mơi sau tác dụng áp suất cao, chúng bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký Trong cột, hỗn hợp phân tách thành cấu tử chúng Phân loại Tùy theo tính chất phân cực cột ghi sắc ký dung môi, người ta phân hai loại HPLC : - - HPLC pha thuận (normal phase HPLC): cột hấp phụ chứa hạt silic dioxit (silica – hợp chất phân cực) nhỏ, dung mơi chất khơng phân cực, ví dụ hexan Thơng thường cột hấp phụ có đường kính 4,6 mm, chiều dài 150 – 250 mm Các hợp chất không phân cực di chuyển qua ống nhanh hợp chất phân cực Tuy nhiên phương pháp sử dụng HPLC đảo pha (reversed phase HPLC): kích thước cột phương pháp pha thường hạt silica biến trở thành không phân cực cách gắn chuỗi hydrocacbon lên hạt Thông thường, hat gắn khoảng 8-18 nguyên tử cacbon Dung dịch chất phân cực, ví dụ hỗn hợp nước + rượu Các hợp chất không phân cực hỗn hợp có xu hướng gắn kết với nhóm hydrocacbon nhờ lực Van de Waals Các hợp chất không phân cực khó hịa tan dung mơi phân cực Do đó, hợp chất khơng phân cực di chuyển qua ống chậm hợp chất phân cực Phương pháp thường sử dụng phổ biến phương pháp pha thường Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Điều kiện chạy sắc ký Phương pháp sử dụng hỗn hợp pha động axit trifluoroacetic (0.10%, pH 2,4) - methanol (90:10) Cột sắc ký : • Nhiệt độ cột : nhiệt độ phịng • Cột chứa pha tĩnh coi trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm - ng kớnh 1-10mm, ht nhi c 0.3-5àm, ã Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột kiểu sắc ký Áp suất cao khoảng 250-600bar Tốc độ dòng : 0.3 ml/phút Hiệu TFA tập trung vào thời gian lưu giữ melamine hình dạng pick đánh giá Tại 0,050% (pH 2,8) 0,10% TFA, thời gian lưu giữ (3.7 phút) hình dạng giống hệt cao điểm sắc nét, nhiên, nồng độ 1,0% (pH 1,4) TFA, thời gian lưu giữ lâu - (4,6 phút) pick rộng Đầu dò có bước sóng 240 nm , cột C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt µm) Q trình thực Nguyên lý : a - Quá trình tách thực cột C18 Pha động (0,1% Trifluoroacetic - TFA / methanol 90:10) bơm với tốc độ dòng 0.3 mL/ phút với bước sóng phát 240 nm Melamine tách 3,7 phút Một đáp ứng tuyến tính (r> 0,999) quan sát thấy mẫu khác từ 1,0-80 µgmL-1 Phương pháp cung cấp khả thu hồi từ 97,2101,2% khoảng nồng độ từ 5-40 µgmL-1 Các giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) có giá trị 0,1 µgmL-1 0,2 µgmL-1 Hóa chất thuốc thử Chất chuẩn: Melamine (99,0%) Dung môi: Methanol Dung môi rửa giải: Trifluoroacetic Methanol Mẫu thử :sữa dạng bột lỏng Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động pha loãng lọc hệ thống Q-pod Millipore b - Pha dung dịch - Dung môi Dung môi 50% methanol (về thể tích) chuẩn bị cách pha thể tích methanol nước - Dung dịch chuẩn Melamine: Cân xác 100 mg melamine vào bình định mức 100 mL, hòa tan với Methanol 50% cách rung bể rung siêu âm 30 phút Lên thể tích 100 mL thu dung dịch có nồng độ melamine 1000 µgmL-1 Pha lỗng 5mL melamine (1000 µgmL -1) 50 ml 50% methanol để nồng độ melamine 100 µgmL-1 Pha lỗng tiếp 5mL melamine 100 µgmL-1 50 ml methanol 50% để nồng độ melamine 10 µgmL-1 c Chuẩn bị mẫu Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) 1,0 g (mẫu khơ) vào bình định mức 100 ml Mẫu pha với 10 ml dung dịch melamine 1000 µgmL-1, pha lỗng với 50 ml dung dịch methanol 50% rung siêu âm 30 phút Sau làm lạnh nhiệt độ phòng, lên thể tích 100 ml dung dịch methanol 50% thu dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine 100 µgmL-1 Cho dung dịch mẫu thu vào ống li tâm ly tâm ( ≥ 3200 rpm) lấy phần dung dịch phía ống (5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, lên thể tích 50 ml dung dịch methanol 50% Mẫu lọc qua lọc 0.45 µm (Acrodisc, 25mm, màng Nylon) Nghiên cứu dịch lọc lọc hấp thụ melamine mức sau: 22% (cho 1ml ban đầu), 10% (2 mL),