2 CHUYÊN ĐỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DỤNG CỤ TRONG KIỂM NGHIỆM Phương pháp định tính, định lượng vitamin A (Nguyên liệu và chế phẩm viên nang mềm) GVHD HVTH 1 2 3 4 2023 Mục lục Chương 1 Tổng quan 1 Ch.Vitamin A giữ vai trò quan trọng trong hoạt động của võng mạc, cần thiết cho sự tăng trưởng và biệt hóa các biểu mô, giúp tăng trưởng xương, thúc đẩy sự sinh sản và phát triển của phôi thai. Cùng với vài carotenoid, , vitamin A giúp tăng cường chức năng của hệ miễn dịch, giảm nhẹ hậu quả và bảo vệ chống biến chứng của một số bệnh nhiễm trùng. Vitamin D làm tăng sự hấp thu Calci ở ruột, tác dụng lên sự chuyển hóa và hấp thu phosphor calci của xương, giúp phòng chống còi xương, xốp xương, nhuyễn xương hoặc thiểu năng cận giáp. Vitamin D2 có trong các loại thực phẩm nguồn gốc từ thực vật như cà chua, gấc,…trong khi vitamin D3 có nhiều trong gan động vật. Trong chuyên đề này chúng tôi sẽ giới thiệu về phần định tính, định lượng chế phẩm vitamin A+D3, theo dược điển Việt Nam 5, dược điển Anh, dược điển châu Âu
CHUYÊN ĐỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DỤNG CỤ TRONG KIỂM NGHIỆM Phương pháp định tính, định lượng vitamin A (Nguyên liệu chế phẩm viên nang mềm) GVHD: HVTH: 2023 Mục lục Chương 1: Tổng quan Chương 2: Định tính 1.Định tính sắc ký lớp mỏng ( Dược điển Việt Nam V ) 1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) 2/ Phản ứng hóa học( Dược Điển Việt Nam V) .3 3/ Phương pháp sắc ký lỏng( Dược Điển Châu Âu) 4/ Góc quay cực( Dược Điển Anh) Chương 2: Định lượng 1/ Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (Tiêu chuẩn Ph Eur 8.0) .5 1.1 Định lượng Vitamin A 1.2 Vitamin D3 2/ Phép đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ( BP2022) .9 Bàn luận 11 Chương 1: Tổng quan Vitamin A giữ vai trò quan trọng hoạt động của võng mạc, cần thiết cho sự tăng trưởng và biệt hóa các biểu mô, giúp tăng trưởng xương, thúc đẩy sự sinh sản và phát triển của phôi thai Cùng với vài carotenoid, , vitamin A giúp tăng cường chức của hệ miễn dịch, giảm nhẹ hậu quả và bảo vệ chống biến chứng của một số bệnh nhiễm trùng Vitamin D làm tăng sự hấp thu Calci ở ruột, tác dụng lên sự chuyển hóa và hấp thu phosphor calci của xương, giúp phòng chống còi xương, xốp xương, nhuyễn xương hoặc thiểu cận giáp Công thức cấu tạo Vitamin A Hình RETINOL Hình VITAMIN D2, D3 Vitamin D2 có loại thực phẩm nguồn gốc từ thực vật cà chua, gấc,…trong vitamin D3 có nhiều gan động vật 2 Trong chuyên đề giới thiệu phần định tính, định lượng chế phẩm vitamin A+D3, theo dược điển Việt Nam 5, dược điển Anh, dược điển châu Âu Chương 2: Định tính 1.Định tính sắc ký lớp mỏng ( Dược điển Việt Nam V ) 1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Hoạt lực vitamin A tính theo đơn vị quốc tế (ký hiệu IU) IU vitamin A tương đương với 0,300 μg retinol; 0,344 μg retinyl aceuit; 0.359 μg retinyl propionat 0,550 μg retinyl palmitat Tùy vào thành phần viên nang mềm dạng mà lấy theo lượng tương ứng Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng ( Thin Layer Chromatography : TLC ) kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh dã chấm hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phản tích trải thành lớp mỏng đồng cố định phiển kinh phiền kim loại Pha đông hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ qui định , di chuyển mỏng tác động lực mao quân Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ , cấu từ hỗn hợp mẫu thủ di chuyển lớp mỏng , theo hướng pha động , với tốc độ khác Kết thu sắc ký đỗ lớp mỏng Cơ chế tách chế hấp phụ , phần bố , trao đổi ion , sàng lọc phân tử hay phối hợp đồng thời nhiều chế tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi pha động Thiết bị hóa chất Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: Ether - cycỉohexan (20 : 80) Dung dịch thử: Chuẩn bị dung dịch chế phẩm có nồng độ khoảng 3,3 IU vitamin A µl cyclohexan (77) có chứa 0,1 % butylhydroxytoỉuen (77) Dung dịch đối chiếu: Chuẩn bị dung dịch các chất chuẩn ester của retinol 0,1 % (tương đương khoảng 3,3 ru mỗi ester pl) cycỉohexan (77) có chứa 0,1 % butyỉhydroxytoỉuen (77) Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng µl môi dung dịch trên Triển khai bình sắc ký đển dung môi được 15 cm Đê khô bản mòng không và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ờ bước sóng 254 nm Phép thử chi có giá trị sắc ký đồ thu được cùa dung dịch đối chiếu có các vết riêng biệt tương ứng với các ester Thứ tự rửa giải từ dưới lên trên là: Retinol acetat, retinol propionat và retinol palmitat Thành phần của dung dịch thừ được xác định bằng cách so sánh vết chính hoặc các vết trên sắc kỷ đồ cùa dung dịch thử với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đổi chiểu 2/ Phản ứng hóa học( Dược Điển Việt Nam V) Nguyên Tắc: phản ứng halogen vào nối đôi vitamin A Tiến hành: Pha loãng lượng dầu chứa nang với clorofrom (TT) để thu dung dịch có nồng độ vitamin A khoảng 10 IU/ml đến 20 IU/ml Lấy ml dung dịch, thêm ml dung dịch thêm ml dung dịch stibi triclorid (TT) , xuất màu xanh không bền 4 3/ Phương pháp sắc ký lỏng( Dược Điển Châu Âu) Nguyên Tắc: HPLC kỹ thuật sắc kỹ sử dụng để tách hợp chất hỗn hợp với mục đích định tính , định lượng tinh chế thành phần hỗn hợp Trong , chất phân tích di chuyển qua cột chứa hạt pha tĩnh tác động pha động lòng Các chất phân tích tách khỏi hỗn hợp chất có cấu trúc khác , tinh chất khác lực với pha tĩnh tác động pha động khác Với chất nhóm có cấu trúc tương đồng đồng phân đổi quang cần tác động vào hệ tách gồm pha tĩnh pha động để thu kết tách đáp ứng yêu cầu Tiến Hành: Tiến hành lúc làm định lượng sắc ký lỏng hiệu cao( HPLC) - Ở phần định lượng vitamin A, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu với pic vitamin A sắc ký đồ dung dịch đối chiếu - Ở phần định lượng vitamin D3, sắc ký đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu với pic vitamin D3 sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 4/ Góc quay cực( Dược Điển Anh) Nguyên tắc: Mỗi chất lỏng rắn có góc quay cực riêng, tiến hành dùng phân cực kế đo góc quay cực , từ định tính 5 Tiến Hành: Xác định góc quay cực chất thử nhiệt độ 19,5 OC đến 20,5OC sử dụng tia D(589,3 nm) ánh sáng đèn Natri phân cực có bề dày 1dm Tiền hành đo lần lấy giá trị trung bình Xác định điểm phân cực kế với ống đo rỗng đo chất lỏng Tính góc quay cực cho chất lỏng theo công thức: Cho chất lỏng : 20 [α ]D = α 1Xd Cho chất rắn : 20 [α ] D = α X 1000 1Xc Trong : α góc quay đo cực chiều dài ống đo phân cực kế, tính dm d tỷ trọng tương đối chất lỏng c nồng độ chất thử (rắn) dung dịch (g/l) Căn vào góc quay cực đo tính nồng độ (g/l) chất thử dung dịch theo biểu thức : c (g/l) = α X 1000 20 l X [α]d Hoặc nồng độ % (kl/kl) chất thử dung dịch theo biểu thức C (% kl/kl) = α X 100 X ρ20 X [α ]20 D Trong : ρ20là khối lượng riêng (g/cm3) dung dịch 20℃ Chương 2: Định lượng Đạt hàm lượng từ 90,0 % đến 120,0 % so với lượng ghi trên nhãn 1/ Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (Tiêu chuẩn Ph Eur 8.0) 1.1 Định lượng Vitamin A Hóa chất thuốc thử : - Methanol (tinh khiết sắc kí ) - Acid acetic băng (TT) - Acid ascorbic (TT) - Ethanol (TT) - Ether ethylic (TT) - Dung dịch Kali hydroxyd 50 %(TT) - Dung dịch phenolphtalein (TT) Điều kiện sắc kí - Cột sắc kí: C18, 250mm x 4,6mm, 5µm - Nhiệt độ cột : 25 độ C - Detector: PDA, đặt bước sóng 326 nm - Tốc độ dịng: 1,2 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Pha động: Methanok - nước (95 : 5) Tiến hành: Phải làm nhanh mẫu cần tránh ánh sáng -Dung dịch đối chiếu: Cân xác lượng vitamin A(Retinyl palmitat) (ĐC), hịa tan pha lỗng ethanol (TT) để dung dịch có nồng độ vitamin A khống 200 IU/ml Hút xác 5,0 ml dung dịch cho vào bình nón bút mài 100 ml, thêm 30 ml ethanol (TT), ml dung dịch kali hydroxyd 50 % (TT), g acid ascorbic (TT), lắc nhẹ Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, tính từ lúc hỗn hợp bắt đầu sơi Làm nguội bình nhanh vòi nước, thêm vào 2-3 giọt dung dịch phenolphalein (TT) trung hịa hỗn hợp xà phịng hóa acid acetic băng (TT) Lọc hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, tráng rửa bình nón, giấy lọc bổ sung đến vạch ethanol (TT), lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử: Cân xác định khối lượng 20 viên nang lấy ngẫu nhiên Cắt mở nang, gộp chung dung dịch thuốc nang, trộn đều, mẫu thử đồng Dùng ether ethylic (TT) rửa vỏ nang, để khô tự nhiên, cân xác định khối lượng 20 vỏ nang, tính khối lượng trung bình dịch thuốc nang Từ mẫu thử đồng nhất, cân xác lượng dịch thuốc tương đương với 1000 IU vitamin A, cho vào bình nón nút mài 100 ml Tiến hành phần chuẩn bị dung dịch đối chiếu , thêm 30 ml ethanol (TT)… lọc qua màng lọc 0.45 µm - Tiêm riêng biệt dung dịch đối chiếu dung dịch thử vào hệ thống sắc kí, tiến hành theo điều kiện mô tả, ghi nhận thời gian lưu diện tích lưu diện tích pic retinol - Hàm lượng(X%) vitamin A, tính khối lượng trung bình dịch thuốc nang, so với hàm lượng nhãn tính theo cơng thức sau : X(%) = S T X m c X C c D T X m V X 100 S C X D C X m T X 1000 X 5000 -Trong : ST ,SC : Lần lượt diện tích pic retinol sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch đối chiếu MC : Khối lượng cân vitamin A đối chiếu (mg) CC : Hàm lượng vitamin A đối chiếu (IU/g) DC DT : Độ pha loãng dung dịch đối chiếu dung dịch thử mT : Khối lượng cân mẫu thử (g) mV : Khối lượng trung bình dịch thuốc nang (g) 1.2 Vitamin D3 Hóa chất thuốc thử -n-hexan (tinh khiết sắc ký) -Isopropanol (tinh khiết sắc ký) -Pentanol ( tinh khiết sắc ký) -Ehther ethylic (TT) Điều kiện sắc ký - Cột sắc kí :Silica gel, 250 mm x 4,6 mm, 5um - Nhiệt độ cột : 25 độ C - Detector: PDA, đặt bước sóng 265nm -Tốc độ dịng : 1,0 ml/phút -Thế tích tiêm: 20 ul -Pha động: theo chuơng trình dung mơi + Dung môi A: n-hexan-pentanol(997:3) + Dung môi B : Isopropanol Thời gian ( phút) Dung môi A (%,tt/tt) Dung môi B (%,tt/tt) 98 10 98 13 70 30 20 70 30 23 98 30 98 Tiến hành : Nhanh, tránh ánh sáng -Dung dịch đối chiếu : Cân xác lượng vitamin D3(Colecalciferol) (ĐC), hịa tan pha lỗng dung mơi A để dung dịch có nồng độ vitamin D3 khoảng 100 IU/ml, lắc lọc qua màng 0,45 um -Dung dịch thử : Từ mẫu thử đồng chuẩn bị phần định lượng vitamin A, cân xác lượng dung dịch thuốc tương đương với 1000 IU vitamin D3, cho vào bình định mức 10 ml Hịa tan bổ sung đến vạch với dung dịch A, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 um - Tiêm riêng biệt dung dịch thử dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký, tiến hành theo điều kiện mô tả , ghi nhận thời gian lưu diện tích pic colecalciferol -Hàm lượng (Y%) vitamin D3, tính khối lượng trung bình dịch thuốc nang so với hàm lượng nhãn tính theo cơng thức sau : Y(%) = S T X m c X C c D T X m V X 100 S C X D C X m T X 1000 X 400 -Trong : ST ,SC : Lần lượt diện tích pic colecalciferol sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch đối chiếu mC : Khối lượng cân vitamin D3 đối chiếu (mg) CC : Hàm lượng vitamin D3 đối chiếu (IU/g) DC DT : Độ pha loãng dung dịch đối chiếu dung dịch thử mT : Khối lượng cân mẫu thử (g) mV : Khối lượng trung bình dịch thuốc nang (g) 2/ Phép đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ( BP2022) Có thể áp dụng cho nguyên liệu vitamin A có nguồn gốc tự nhiên đa số dạng thuốc chứa vitamin A: Thuốc nang, viên nén, thuốc bột, thuốc mỡ, dầu gan cá… Nguyên Tắc: Mỗi chất có độ hấp thu khác tiếp xúc với nguồn sáng xạ ứng với công thức cấu tạo, cấu hình electron, từ dùng máy đo quang phổ đo độ hấp thu chất phân tích để định tính hay định lượng 10 Tiến Hành: Lấy lượng chế phẩm chứa khoảng 50 000 IU vitamin A vào bình nút mài, thêm ml dung dịch kali hydroxyd (TT) 50 % pha, 30 ml ethanol (TT), đun sôi 30 cách thủy có lắp ống sinh hàn hồi lưu, dịng khí nitrogen khơng có oxygen Làm nguội nhanh dùng 30 ml nước cất chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn Chiết lần lần với 50 ml ether (TT) bỏ lớp tách lớp hoàn toàn Tập trung dịch chiết lại rửa dịch chiết lần, lần 50 ml nước cất, (chú ý lắc nhẹ nhàng lần đầu để tránh tạo thành nhũ tương) Làm hay dịch chiết ether cách thủy dịng khí nitrogen khơng có oxygen cất quay chân không nhiệt độ không 30 °C đến hết dung mơi Hịa tan cắn lượng 2-propanol (TT) vừa đủ để thu dung dịch chứa 10 IU đến 15 IU vitamin A ml Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 300 nm, 310 nm, 325 nm, 334 nm cốc dày cm với mẫu trắng 2-propanol (TT), sau xác định bước sóng có hấp thụ cực đại 11 Bàn luận Vitamin A, D3 cơng thức cấu tạo có nhiều nối đơi nên dễ bị oxi hóa ánh sáng, điều làm cho thao tác định tính, định lượng Quang Phổ nhiều bị ảnh hưởng khơng che chắn tốt độ hấp thu tăng cao mức bình thường Cũng ngun nhân phần định lượng Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (Tiêu chuẩn Ph Eur 8.0) có thêm acid ascorbic để tránh tình trạng vitamin A bị oxi hóa Hoạt lực vitamin A tính theo đơn vị quốc tế (ký hiệu IU) IU vitamin A tương đương với 0,300 μg retinol; 0,344 μg retinyl aceuit; 0.359 μg retinyl propionat 0,550 μg retinyl palmitat Tùy vào thành phần viên nang mềm dạng mà lấy theo lượng tương ứng điều có nghĩa hàm lượng ứng với dạng tồn chế phẩm vitamin A lại có góc quay cực khác nhau, từ chúng tơi đem phương pháp định tính góc quay cực dược điển Anh vào ... tính, định lượng chế phẩm vitamin A+D3, theo dược điển Việt Nam 5, dược điển Anh, dược điển châu Âu Chương 2: Định tính 1.Định tính sắc ký lớp mỏng ( Dược điển Việt Nam V ) 1.1 Phương pháp... lớp mỏng ( Dược điển Việt Nam V ) 1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) 2/ Phản ứng hóa học( Dược Điển Việt Nam V) .3 3/ Phương pháp sắc ký lỏng( Dược Điển Châu... Phản ứng hóa học( Dược Điển Việt Nam V) Nguyên Tắc: phản ứng halogen vào nối đơi vitamin A Tiến hành: Pha lỗng lượng dầu chứa nang với clorofrom (TT) để thu dung dịch có nồng độ vitamin A khoảng