Hiện nay sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi và đã trở thành lĩnh vực quan trọng để khám phá hệ gen của sinh vật. Khi phân biệt tính thuần chủng và tổ hợp lai các loài nếu dựa hoàn toàn vào đặc tính ngoại hình sẽ không đảm bảo cơ sở vững vàng về di truyền học. Đặc biệt trong công tác tạo giống, lưu giữ nguồn gen quý hiếm và các giá trị kinh tế nhằm nâng cao chất lượng các nghiên cứu cơ bản về vấn đề tư liệu hóa các chỉ tiêu di truyền học của các loài động vật đang được lưu trữ, nuôi trồng, nhất là những loài dòng có quan hệ họ hàng gần nhau, nhưng lại có sai khác về cấu trúc gen. Tuy nhiên, sự phân loại các đặc điểm hình thái không thể xác định được sự sai khác giữa chúng. Sử dụng các chỉ thị di truyền phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các giống và trong các giống vật nuôi ở mức độ phân tử cũng như tái tạo lại lịch sử của các giống sẽ giúp định hướng cho việc quản lý, bảo tồn và sử dụng nguồn gen vật nuôi một cách hữu ích. ADN ty thể là dấu hiệu được sử dụng rộng rãi để thực hiện các nghiên cứu phát sinh chủng loài theo dòng mẹ ở các loài động vật khác nhau. Vùng điểu khiển (vùng Dloop) của hệ gen ty thể có tỷ lệ đột biến cao hơn so với phần còn lại của hệ gen ty thể, thiếu sự tái tổ hợp và sự thừa kế của mẹ nên được sử dụng như một dấu ấn di truyền tốt hơn để đánh giá sự đa dạng (Gupta et al., 2015). Trong thời gian gần đây, nhiều thông tin đa dạng di truyền đã được thu thập từ việc sử dụng vùng DLoop như một chỉ thị phân tử để điều tra sự sai khác di truyền ở các loài động vật khác nhau bao gồm cả gà nhà. Hầu hết các nghiên cứu đã đánh giá các mối quan hệ phát sinh loài, đa dạng di truyền và nguồn gốc theo dòng mẹ của gà nhà dựa vào một phần trình tự vùng DLoop (Liu et al., 2006; Muchadeyi et al., 2008; Adebambo et al., 2010; Englund et al., 2014). Tuy nhiên gần đây, một số nghiên cứu đã thực hiện đánh giá trên toàn bộ trình tự vùng Dloop (Osman et al., 2016; Gao et al., 2017; Teinlek et al., 2018; Islam et al., 2019), việc đánh giá trên trình tự hoàn chỉnh của mtADN Dloop được cho là cung cấp nhiều thông tin chi tiết hơn so với phân tích một phần trình trình tự (Gao et al., 2017). Trong những năm gần đây, các giống gà bản địa Việt Nam đang phải cạnh tranh khốc liệt với các giống gà ngoại có năng suất cao do hệ quả từ nền kinh tế thị trường và các hệ thống chăn nuôi thâm canh. Mặc dù có năng suất thấp nhưng các giống gà bản địa lại có những đặc điểm vượt trội so với gà ngoại như thích nghi với điều kiện sinh thái khắc nghiệt, sức chống chịu bệnh tốt và đặc biệt là chất lượng thịt ngon, hợp khẩu vị của người Việt Nam. Việt Nam có nguồn gen gà bản địa phong phú với nhiều tên gọi theo sự phân bố địa lý và theo đặc điểm ngoại hình. Theo một nghiên cứu của Phương (Phuong et al., 2015), Việt Nam sở hữu khoảng 30 giống gà bản địa. Trong quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, các giống đã bị lai tạp, thoái hóa nhiều hoặc giảm tính đa dạng và làm cho nguồn gen quý ngày càng bị mất đi. Vì vậy việc nghiên cứu đa dạng di truyền trong và giữa các giống gà bản địa cũng như các sự kiện thuần hóa, phát sinh chủng loài là rất cần thiết để định hướng cho việc quản lý, bảo tồn và sử dụng nguồn gen gà bản địa một cách hữu ích. Trong nghiên cứu này, 10 giống gà bao gồm gà Cáy Củm, gà Tò, gà Tè, gà Lùn Cao Sơn, gà Ri, gà H’Mông, gà Kiến, gà Lạc Sơn, gà Lông xù và gà Mã Đà được lựa chọn để nghiên cứu, ngoài gà Ri được nuôi phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước các giống gà này là các giống gà đặc hữu của các địa phương, vùng miền của Việt Nam và đang được quan tâm đưa vào các chương trình bảo tổn để lưu trữ các nguồn gen quý.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG - LÂM BẮC GIANG NGUYỄN ĐỨC HẢO LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÙNG ADN D-LOOP TY THỂ Ở MỘT SỐ GIỐNG GÀ BẢN ĐỊA Ngành: Chăn nuôi Mã ngành: 8620105 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Dỗn Lân TS Đồn Phương Thuý Bắc Giang, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 06 tháng năm 2022 Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hảo i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Dỗn Lân – Phó Viện trưởng Viện Chăn ni, TS Đồn Phương Thúy – Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang – Người thầy, người tận tình hướng dẫn, sát dìu dắt, bảo tạo điều kiện giúp đỡ q trình hồn thành luận văn Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Chăn ni, Lãnh đạo tập thể Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Động vật, Phịng Phân tích Thức ăn Sản phẩm chăn ni – Viện Chăn nuôi tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ công việc học tập tham gia nghiên cứu để hoàn thành luận án Tôi trân trọng cám ơn tập thể thầy, cô giáo khoa Chăn nuôi – Thú y Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cám ơn thân tới gia đình, người thân bạn bè ln bên cạnh, u thương, khích lệ ủng hộ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 06 tháng năm 2022 Tác giả Nguyễn Đức Hảo ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN viii THESIS ABSTRACT x MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU CỦA NGHIÊN CỨU PHẠM VI NGHIÊN CỨU NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC 4.1 Những đóng góp 4.2 Ý nghĩa khoa học CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ SỞ KHOA HỌC .4 1.1.1 Nguồn gốc q trình hóa gà nhà 1.1.2 Đặc điểm hình thái, khả sinh trưởng, sinh sản phân bố giống gà địa Việt Nam nghiên cứu 1.1.3 Đặc điểm cấu trúc hệ gen ty thể gà 12 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN GÀ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 21 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 24 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .26 2.1.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 26 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu .26 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.3.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu 27 2.3.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 27 2.3.3 Phương pháp khuyếch đại vùng D-loop PCR 27 iii 2.3.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 28 2.3.5 Phương pháp giải trình tự vùng D-loop 28 2.3.6 Phương pháp phân tích đa dạng nucleotide 30 2.3.7 Phương pháp phân tích mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ giống gà đại Việt Nam số giống gà giới 30 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 31 3.2 KHUẾCH ĐẠI CÁC PHÂN ĐOẠN VÙNG D-LOOP BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 32 3.4 PHÂN TÍCH CÂY PHÁT SINH CHỦNG LỒI DỰA TRÊN TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÙNG D-LOOP 36 3.5 PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN THEO DÒNG MẸ GIỮA GÀ BẢN ĐỊA VIỆT NAM VỚI MỘT SỐ GÀ NHÀ TRÊN THẾ GIỚI 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 KẾT LUẬN 47 ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC .55 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) CJF Gà rừng Cyelon ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate dNTP Deoxynucleoside triphosphate cs Cộng EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide GJF Gà rừng màu xám GrJF Gà rừng màu xanh mtADN Hệ gen ty thể NCBI National Center for Biotechnology Information Nxb Nhà xuất PCR Polymerase Chain Reaction RJF Gà rừng đỏ RNA Ribonucleic acid Ta Nhiệt độ gắn mồi TBE Tris-Borate-EDTA v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tên giống gà, địa điểm thu mẫu số lượng mẫu 26 Bảng 2.2 Thông tin cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng D-loop kỹ thuật PCR 28 Bảng 3.1 Kích thước vùng D-loop 10 giống gà địa Việt Nam 36 Bảng 3.2 Các số đa dạng di truyền trình tự nucleotide vùng D-loop ty thể giống gà địa Việt Nam 36 Bảng 3.3 Phân bố haplotype vùng D-loop giống gà địa 41 Bảng 3.4 Các vị trí đa hình trình tự vùng D-loop 29 kiểu đa hình (haplotype) .42 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc ty thể .12 Hình 1.2 Sơ đồ mtADN gà 14 Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự Sanger 20 Hình 3.1 Điện di đồ ADN tổng số giống gà Cáy Củm, Tè, Lùn Cao Sơn Tò (M): thang chuẩn ADN 100bp, 1-2: gà Cáy Củm, 3-4: gà Tè, 5-6: gà Lùn Cao Sơn, 7-8 gà Tò 31 Hình 3.2 Điện di đồ ADN tổng số giống gà Kiến, Lạc Sơn, Lông Xù, Mã Đà, H’Mông Ri vàng rơm (M): thang chuẩn ADN 1kp plus, 1-2: gà Kiến, 3-4: gà Lạc Sơn, 5-7: gà Lông Xù, 8-9 gà Mã Đà, 10-11: gà H’Mông, 12-14: gà Ri Vàng Rơm 32 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại từ cặp mồi P1 có kích thước 925bp Marker 100bp plus .33 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại từ cặp mồi P2 có kích thước 721bp Marker 50bp 34 Hình 3.5 Kết giải trình tự phân đoạn nhân lên từ cặp mồi P1 .35 Hình 3.6 Kết giải trình tự phân đoạn nhân lên từ cặp mồi P2 .35 Hình 3.7 Biểu đồ so sánh số đa dạng Haplotype (Hd) 10 giống gà địa Việt Nam 37 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh số đa dạng Nucleotide (Pi) 10 giống gà địa Việt Nam .38 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng lồi dựa vào trình tự vùng D-loop haplotype gà địa Việt Nam số giống gà giới .45 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Đức Hảo Tên Luận văn: Đa dạng di truyền vùng ADN D-loop ty thể số giống gà địa Ngành: Chăn nuôi Mã số: 8620105 Tên sở đào tạo: Đại học Nông – Lâm Bắc Giang Mục đích nghiên cứu Đánh giá đa dạng di truyền số giống gà địa Việt Nam thơng qua phân tích trình tự vùng điều khiển (Control region hay D-loop) thuộc hệ gen ty thể đồng thời xem xét mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ gà địa Việt Nam với số giống gà giới Phương pháp nghiên cứu Thu thập 150 mẫu máu 10 giống gà địa (mỗi giống 15 mẫu); Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu kit tách chiết ADN tổng số thương mại; Nhân đặc hiệu phân đoạn vùng D-loop hệ gen ty thể phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR); Tinh sản phẩm nhân đặc hiệu theo kit tinh thương mại; Giải trình tự phân đoạn vùng D-loop theo phương pháp Sanger; Đánh giá xử lý liệu thô phần mềm BioEdit; Lắp ráp trình tự vùng D-loop phần mềm Unipro UGENE; Phân tích đa dạng di truyền phần mềm DnaSP; Truy suất trình tự vùng D-loop ty thể số giống gà giới công bố ngân hàng gen; Xây dựng phát sinh chủng loại theo phương pháp maximum likelihood phần mềm MEGA X Kết kết luận Đã xác định 39 điểm đa hình nucleotide tồn trình tự vùng Dloop ty thể 29 haplotype vùng D-loop tổng số 150 mẫu gà 10 giống gà địa Việt Nam (Cáy Củm, Tè, Lùn Cao Sơn, Tị, Kiến, Lạc Sơn, Mã Đà, Lơng xù, Ri Vàng Rơm H’Mơng) Trong gà Ri vàng rơm có độ đa dạng haplotype đa dạng nucleotide cao nhất, gà Mã Đà có đa dạng thấp với kiểu haplotype Mức độ đa dạng haplotype vùng D-loop 10 giống gà địa Việt Nam viii tương đối cao với Hd = 0,918 ± 0,010 Xác định mối quan hệ gần gũi phần lớn haplotype gà địa Việt Nam với số giống gà nhà Trung Quốc Xác định haplotype 10 giống gà địa Việt Nam có nguồn gốc đa dòng mẹ: (1) từ Trung Quốc; (2) từ khu vực Đông Nam Á; (3) từ Ấn Độ ix ... đại vùng D- loop kỹ thuật PCR 28 Bảng 3.1 Kích thước vùng D- loop 10 giống gà địa Việt Nam 36 Bảng 3.2 Các số đa d? ??ng di truyền trình tự nucleotide vùng D- loop ty thể giống gà địa. .. vùng D- loop haplotype gà địa Việt Nam số giống gà giới .45 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Đức Hảo Tên Luận văn: Đa d? ??ng di truyền vùng ADN D- loop ty thể số giống gà địa Ngành:... rơm có độ đa d? ??ng haplotype đa d? ??ng nucleotide cao nhất, gà Mã Đà có đa d? ??ng thấp với kiểu haplotype Mức độ đa d? ??ng haplotype vùng D- loop 10 giống gà địa Việt Nam viii tương đối cao với Hd = 0,918