Con trâu là một đối tượng đặc biệt trong hệ thống nông nghiệp ở nhiều nước Châu Á, đặc biệt là ở Việt Nam. Chúng cung cấp thực phẩm (thịt, sữa), sức kéo, phân bón, da và việc làm cho người nông dân. Ở Việt Nam, con trâu đóng một vai trò đặc biệt quan trọng. Trước đây, con trâu không những là chỗ dựa cho kế sinh nhai của gia đình nông dân nhỏ mà còn là niềm vui, sự an ủi về tinh thần của người miền quê. Tuy nhiên hiện nay do tiến trình công nghiệp hóa hiện đại hóa nông nghiệp và nông thôn dẫn đến số lượng đàn trâu ngày một giảm sút, hiện cả nước có khoảng 2.292.945 triệu con. Chính bởi vậy Chính Phủ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã có chủ chương phát triển và cải tạo đàn trâu của Việt Nam thông qua các dự án trọng điểm và các đề tài nghiên cứu về trâu. Tuy nhiên những nghiên cứu về di truyền phân tử ở trâu còn chưa được thực hiện nay ở Việt Nam. Vì vậy việc đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen vật nuôi bản địa nói chung và ở trâu nói riêng ở Việt Nam bằng các chỉ thị phân tử là một việc làm cần thiết. Đặc biệt chưa có một nghiên cứu nào về di truyền phân tử cũng như đánh giá đa dạng di truyền hệ gen ty thể được thực hiện trên các quần thể trâu của Việt Nam.
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN viii ABSTRACT x MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI PHẠM VI NGHIÊN CỨU NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC 4.1 Những đóng góp 4.2 Ý nghĩa khoa học CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 CỞ SỞ KHOA HỌC 1.1.1 Một số hiểu biết giống trâu nội Việt Nam .4 1.1.2 Đặc điểm phân bố giống trâu nội nước ta 1.1.3 Đặc điểm hình thái khả sinh trưởng phát triển giống trâu nội Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm cấu trúc ADN 1.1.5 Công tác giống trâu 1.1.6 Sự đa dạng di truyền 1.1.7 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền 10 1.1.8 Một số kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền .12 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 16 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 16 1.2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGỒI NƯỚC 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .26 2.1.1 Đối tượng nghiến cứu 26 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu .26 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 i 2.3.1 Phương pháp tách triết ADN 27 2.3.2 Phương pháp điện di gel Agarose .32 2.3.3 Phương pháp PCR .33 2.3.4 Phương pháp giải trình tự 34 2.3.5 Phân tích trình tự 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN 37 3.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR GEN D-LOOP VÀ GEN CYT B 38 3.2.1 Phản ứng PCR gen D-loop 38 3.2.2 Phản ứng PCR gen Cytochrome B 39 3.3 ĐA DẠNG DI TRUYỀN GEN CYTOCHOROME B 39 3.4 Mối quan hệ di truyền quần thể trâu dự trình tự gen D-loop Cytochrome B 47 3.5 MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TRÂU VIỆT NAM VÀ TRÂU Ở MỘT SỐ NƯỚC KHÁC 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT cs Cộng Cyt B Cytochrome B D-loop Displacement loop HCPC Health and Care Professions Council Hd haplotype NGS Next Generation Sequencing PCR Polemerase Chain Reaction RFLP SSCP Restriction Fragment Length Polymorphism Single-stranded conformation polymorphism iii DANH MỤC BẢNG BẢNG 1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TỬ ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐÁNH GIÁ SAI KHÁC DI TRUYỀN 11 BẢNG 2.1 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG PCR GEN CYTOCHROME B 34 BẢNG 2.2 THÀNH PHẦN VÀ THỂ TÍCH PHẢN ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ ADN35 BẢNG 3.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN HAPLOTYPE CỦA TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN CYTOCHROME B .40 BẢNG 3.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN NUCLEOTIDE CỦA TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN CYTOCHROME B .42 Bảng 3.3 Đa dạng di truyền haplotype quần thể trâu Việt Nam dựa phân tích trình tự vùng D-loop .43 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH HÌNH 1.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN TY THỂ .6 HÌNH 1.2 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ SANGER 15 HÌNH 2.1 MẪU MƠ TAI ĐƯỢC BẢO QUẢN TRONG ỐNG 2,5 ML CHỨA CỒN 900 27 HÌNH 2.2 ỐNG EPPENDOF 1.5ML 28 HÌNH 2.3 PROTEINASE K VÀ ĐỆM DIGESTION SOLUTION .29 HÌNH 2.4 Ủ MẪU Ở NHIỆT ĐỘ 560 C 29 HÌNH 2.5 LY TÂM MẪU 3000 VÒNG TRONG PHÚT .30 HÌNH 2.6 ỐNG CỘT LỌC 2ML .30 HÌNH 2.7 DUNG DỊCH ĐỆM RỬA AW1 .31 HÌNH 2.8 DUNG DỊCH ĐỆM RỬA AW2 31 HÌNH 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN BẰNG ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 1% (M LÀ MARKER 100 BP) 37 HÌNH 3.2 KIỂM TRA NỒNG ĐỘ DNA TRÊN MÁY NANODROP 38 HÌNH 3.3 ẢNH ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR GEN D-LOOP 38 HÌNH 3.4 ẢNH ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR GEN CYTOCHROME B 39 HÌNH 3.5 SỐ HYPLOYPE CỦA TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN CYTOCHROME B .40 HÌNH 3.6 ĐA DẠNG DI TRUYỀN HAPLOTYPE CỦA QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN CYTOCHROME B 41 HÌNH 3.7 ĐA DẠNG DI TRUYỀN NUCLEOTIDE CỦA QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN CYTOCHROME B 42 HÌNH 3.8 SỐ HAPLOTYPE CỦA QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP 44 HÌNH 3.9 ĐA DẠNG DI TRUYỀN HAPLOTYPE CỦA QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP 45 BẢNG 3.3 ĐA DẠNG DI TRUYỀN NUCLEOTIDE CỦA QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP 46 HÌNH 3.10 ĐA DẠNG DI TRUYỀN NUCLEOTIDE CỦA QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP 46 HÌNH 3.11 CÂY PHÂN LOẠI DI TRUYỀN QUẦN THỂ TRÂU VIỆT NAM DỰA TRÊN TRÌNH TỰ D-LOOP 49 v Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền trâu Việt Nam, trâu Trung Quốc Brazin .51 vi MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Việc bảo tồn sử dụng có hiệu nguồn đa dạng sinh học nói chung nguồn gen động vật ni nói riêng vấn đề cấp thiết Do áp lực kinh tế thị trường địi hỏi giống có suất cao nên nhiều giống vật nuôi địa có nguy bị mà nguồn gen đặc trưng quý báu Từ năm 1990 tổ chức Nông lương thực giới (FAO) xây dựng chương trình phát triển bền vững nguồn gen động vật ni tồn cầu, mục tiêu chương trình nhằm trợ giúp việc trì đa dạng sinh học phát triển nơng nghiệp bền vững Đây chương trình tổng thể sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử microsatellite, phân tích trình tự ADN để đánh giá đa dạng di truyền giống thân giống vật nuôi mức độ phân tử nhằm định hướng cho việc quản lý, bảo tồn sử dụng nguồn gen động vật ni tồn lục địa Thơng qua chương trình có nhiều dự án đánh giá tính đa dạng nguồn gen động vật nuôi tiến hành nhiều nước giới nhằm phát khai thác tiềm ưu điểm di truyền giống địa Con trâu đối tượng đặc biệt hệ thống nông nghiệp nhiều nước Châu Á, đặc biệt Việt Nam Chúng cung cấp thực phẩm (thịt, sữa), sức kéo, phân bón, da việc làm cho người nơng dân Ở Việt Nam, trâu đóng vai trị đặc biệt quan trọng Trước đây, trâu khơng chỗ dựa cho kế sinh nhai gia đình nơng dân nhỏ mà cịn niềm vui, an ủi tinh thần người miền quê Tuy nhiên tiến trình cơng nghiệp hóa - đại hóa nơng nghiệp nơng thơn dẫn đến số lượng đàn trâu ngày giảm sút, nước có khoảng 2.292.945 triệu Chính Chính Phủ, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn có chủ chương phát triển cải tạo đàn trâu Việt Nam thông qua dự án trọng điểm đề tài nghiên cứu trâu Tuy nhiên nghiên cứu di truyền phân tử trâu chưa thực Việt Nam Vì việc đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen vật ni địa nói chung trâu nói riêng Việt Nam thị phân tử việc làm cần thiết Đặc biệt chưa có nghiên cứu di truyền phân tử đánh giá đa dạng di truyền hệ gen ty thể thực quần thể trâu Việt Nam MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định tính đa dạng di truyền gen D-loop Cytochrome B (ADN ty thể) quần thể trâu Viêt Nam - Xác định mối quan hệ di truyền trâu Việt Nam trâu số nước khác giới PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Phân tích đa dạng di truyền vùng ADN D-loop Cytochrome B quần thể trâu nghiên cứu - So sánh đoạn gen D-loop Cytochrome B quần thể trâu Việt Nam với trình tự gen ngân hàng gen giới để tìm sai khác mối liên quan di truyền theo dịng mẹ NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC 4.1 Những đóng góp - Đây báo cáo giải trình tự gen Dloop Cytochrome B quần thể trâu Việt Nam - Đã xây dựng phát sinh phân loại di truyền theo dòng mẹ haplotype quần thể trâu Việt nam số giống trâu giới 4.2 Ý nghĩa khoa học - Đây cơng trình cung cấp thơng tin tính đa dạng đặc điểm di truyền gen Cytochrome B D-loop giống trâu nội - Kết đề tài cung cấp thông tin khoa học cho chương trình bảo tồn sử dụng nguồn gen trâu nội CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CỞ SỞ KHOA HỌC 1.1.1 Một số hiểu biết giống trâu nội Việt Nam Trâu Việt Nam thuộc nhóm trâu đầm lầy Về trâu nội thuộc giống tùy theo điều kiện nuôi dưỡng nơi mà trâu phân hóa thành loại hình quen thuộc gọi theo tầm vóc trâu ngố (to) trâu gié (nhỏ hơn) Tuy nhiên phân biệt khơng có ranh giới cụ thể - Trâu việt nam có khả lao động tốt Sức kéo trung bình khoảng 600-800N, có khả làm việc tốt chân đất mặn hay lầy lụt - Trâu chịu đựng kham khổ tốt, khả chống bệnh tật cao, thích nghi tốt với khí hậu nóng ẩm 1.1.2 Đặc điểm phân bố giống trâu nội nước ta Trâu Việt Nam phân bố tất địa phương tập chung chủ yếu tỉnh Trung du miền núi phía Bắc (56,37%), tiếp đến tỉnh Bắc Trung Bộ Duyên hải miền Trung (32,36%), Đống sông Hồng (5,00%), Tây Nguyên (3,60%), Đông Nam Bộ (1,60%) Đồng sông Cửu Long thấp (1,08%) (Tổng cục thống kê, tháng năm 2021) Chăn nuôi trâu không đem lại hiệu kinh tế cho địa phương, mặt khác trâu có vai trị quan trọng vắng mặt lễ hội hoạt động văn hóa, xã hội nhiều địa phương nước Việt Nam nước khu vực Châu Á quan tâm đến trì phát triển đàn trâu thời đại cơng nghiệp hố, trâu ... Đa d? ??ng di truyền đa d? ??ng thành phần gen cá thể tồn loài loài khác (đa d? ??ng di truyền tạo nên khác biệt cá thể quần thể) Xét cho cùng, đa d? ??ng di truyền biến d? ?? tổ hợp trình tự b? ??n cặp bazơ b? ??n,... ADN ADN ty thể thị di truyền sử d? ??ng rộng rãi nghiên cứu cấu trúc đa d? ??ng di truyền quần thể có tính b? ??o thủ di truyền theo d? ?ng mẹ Cấu trúc ADN ty thể động vật có d? ??ng mạch vịng kín với độ d? ?i... tầm vóc khả sản xuất trâu địa phương 1.1.6 Sự đa d? ??ng di truyền Đánh giá đa d? ??ng di truyền phân mức đa d? ??ng sinh học Đa d? ??ng di truyền thể qua khác tất gen di truyền tất cá thể thực vật, động vật,