(LUẬN văn THẠC sĩ) thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số giống lúa bản địa của việt nam

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề	Thiết Kế Và Ứng Dụng Các Chỉ Thị ADN Xác Định Các Gen Liên Quan Đến Tính Kháng Đạo Ôn Ở Một Số Giống Lúa Bản Địa Của Việt Nam
Tác giả	Phương Hữu Pha
Người hướng dẫn	PGS. TS. Trần Đăng Khánh, PGS. TS. Đồng Huy Giới
Trường học	Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	76
Dung lượng	19,45 MB

Cấu trúc

TRANG BÌA
MUC LUC
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
- 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
- 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- 1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- 2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA
  - 2.1.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới
  - 2.1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam
- 2.2. TÌNH HÌNH THIỆT HẠI GÂY RA BỞI BỆNH ĐẠO ÔN
  - 2.2.1. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn trên thế giới
  - 2.2.2. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn ở Việt Nam
- 2.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN CỦA LÚA
- 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC GEN KHÁNG ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA
- 2.5. CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI VÀ ỨNG DỤNG TINSINH HỌC
  - 2.5.1. Hệ thống giải trình tự gen Illumina
  - 2.5.2. Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả giải trình tự gen
- 2.6. CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP
- 2.7. CHỈ THỊ ADN TRONG XÁC ĐỊNH GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHÁNGĐẠO ÔN
  - 2.7.1. Chỉ thị ADN
  - 2.7.2. Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử
- 2.8. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚAKHÁNG ĐẠO ÔN
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
- 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
  - 3.2.1. Nguồn vật liệu
  - 3.2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
    - 3.2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm
    - 3.2.2.2. Hóa chất
- 3.3. Phương pháp nghiên cứu
  - 3.3.1. Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome
  - 3.3.2. Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21
    - 3.3.2.1. Thiết kế mồi
    - 3.3.2.2. Kiểm tra mồi đối chiếu trên cơ sở dữ liệu
    - 3.3.2.3. Kiểm tra mồi trong phòng thí nghiệm
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- 4.1. KẾT QUẢ TẦM SOÁT GEN PIT KHÁNG ĐẠO ÔN DỰA TRÊN DỮLIỆU TRÌNH TỰ GENOME CỦA CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA ĐÃĐƯỢC GIẢI MÃ
- 4.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHỈ THỊ XÁC ĐỊNH GEN PIT CÓ KHẢ NĂNGKHÁNG ĐẠO ÔN
- 4.3. KẾT QUẢ TẦM SOÁT GEN PI21 KHÁNG ĐẠO ÔN DỰA TRÊN DỮLIỆU TRÌNH TỰ GENOME CỦA CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA ĐÃĐƯỢC GIẢI MÃ
- 4.4. KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHỈ THỊ XÁC ĐỊNH GEN PI21 CÓ KHẢ NĂNGKHÁNG ĐẠO ÔN
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
- 5.1. KẾT LUẬN
- 5.2. KIẾN NGHỊ
- TÀI LIỆU THAM KHẢO

Nội dung

Vật liệu và phương pháp

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019 tại bộ môn

Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Vật liệu nghiên cứu

Cơ sở dữ liệu trình tự genome của 17 giống lúa kháng đạo ôn bản địa Việt Nam, được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật, đã được giải trình tự trong khuôn khổ đề tài "Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam" do Viện Di truyền Nông nghiệp thực hiện.

Bảng 3.1 Bảng vật liệu nghiên cứu

3.2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

Máy chủ sever, máy li tâm Eppendorf, máy đo pH HANNA, máy nhân bản gen (PCR), bộ máy điện di đứng và ngang CBS, bộ chụp ảnh gel, tủ sấy Memmert, cân phân tích, nồi hấp, tủ bảo quản mẫu 4°C, pipetman và ống Eppendorf là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, hỗ trợ cho các nghiên cứu và phân tích khoa học chính xác.

TT Tên giống TT Tên giống

1 Khấu điển lư 10 Lúa gốc đỏ

2 Thơm Lài 11 Tám xoan Hải Hậu

5 Tốc lùn 14 Tám xoan Bắc Ninh

6 Ble te lo 15 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2

7 Khấu mặc buộc 16 Nếp lùn

8 Nếp mèo nương 17 Nàng quớt biển

3.2.2.2 Hóa chất a Hoá chất tách chiết ADN

DNA extraction chemicals include Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, and ethanol, sourced from reputable brands such as Sigma, Merck, Prolabo, ICN, and Labscan.

-Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB):

EDTA 0,5M, pH 8,0 b Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR

-Đệm PCR 1x (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2, 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen

-dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen

-Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRuler TM ADN Ladder Ultra Low của hãng Fermentas, Invitrogen

-Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen c Hoá chất chạy điện di Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS, Temed, chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome

Lắp ráp và gọi SNP sử dụng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 (SoftGenetics LLC, State College, PA, USA) (Biswas et al., 2015) https://softgenetics.com

Phần mềm NextGENe.php và MEGA 6.0 cho hệ điều hành Windows được sử dụng để phân tích di truyền tiến hóa cho 17 giống lúa Các công cụ này hỗ trợ trong việc dóng hàng và cột, giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu di truyền Tham khảo thêm thông tin tại trang web MEGA (http://www.megasoftware.net/mega.php) và các nghiên cứu của Zheng, S et al (2017), Tamura et al (2013), Huu Trung Khuat và cộng sự (2017).

Phương pháp tầm soát các gen được thực hiện theo 8 bước sau:

Bước 1: Khởi động chương trình NextGENe ver 2.4.2.3 chọn phương pháp đọc trình tự Illumila với ứng dụng SNP/Indel Discovery

Bước 2: Đưa đữ liệu đầu vào bằng các file đọc trình tự ở dạng FastQ vào mục Sample files

Bước 3: Đưa dữ liệu tham chiếu vào mục Reference files dưới dạng Fasta

Bước 4: Lưu lại đầu ra cho file Output với thư mục khác và đuôi *pjt

Sau khi hoàn tất các bước từ 1 đến 4, tiến hành phân tích mẫu đọc trình tự với gene tham chiếu bằng cách nhấn nút Run NextGENe.

Bước 6: Kết quả thu được được thể hiện thông qua NextGENe Viewer

Sau khi sử dụng chương trình NextGENe phiên bản 2.4.2.3, chúng ta thu được các trình tự tương đồng của mẫu giống cần so sánh với gene tham chiếu Để xuất ra file fasta của mẫu cần so sánh, hãy sử dụng lệnh Export trong phần mềm.

Mega ver 6.06 (Tamura et al., 2013) để dóng hàng dóng cột các giống cần so sánh với gen tham chiếu

Bước 8: Kết quả dóng hàng, dóng cột các giống so sánh với gen tham chiếu, và xác định được các SNP và Indel

Hình 3.1 Phương pháp tầm soát các gen Pit và Pi21 của 17 giống lúa đã giải trình tự bằng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 và MEGA 6.0

3.3.2 Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit , Pi21

Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0, được phát hành vào ngày 15/12/2008 bởi hãng Invirogen, Carlsbad (Jia et al., 2002) Phần mềm này có khả năng phân tích trình tự đã chọn và thiết kế mồi PCR dựa trên các thông số như nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài đoạn khuếch đại Nó cũng có thể phân tích ADN/ARN, xác định khung đọc mở (ORFs), xác định các vị trí giới hạn trên phân tử, sắp xếp trình tự của nhiều phân tử ADN/ARN và lắp ghép các đoạn ADN thành trình tự dài hơn.

I don't know!

Bước 1: Khởi động chương trình Vector NTI Advance 11.0, tạo dữ liệu trình tự ADN cần thiết kế mồi

Bước 2: Dán đoạn trình tự cần thiết kế mồi vào mục Edit Sequence

Bước 3: Thiết kế cặp mồi trong phần Primer Design

Bước 4: Kết quả về cặp mồi được thể hiện ở mục PCR Analysis

Hình 1.2 Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11.0

3.3.2.2 Kiểm tra mồi đối chiếu trên cơ sở dữ liệu

Bước 1: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vertor Nti 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm MEGA 6.0

Bước 2: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

Bước 3: Kết quả tìm kiếm so sánh trình tự của đoạn mồi với cơ sở dữ liệu của thư viện trên NCBI

Hình 3.3 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm

3.3.2.3 Kiểm tra mồi trong phòng thí nghiệm

- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Obara et al., 1998) có cải tiến

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler với tổng thể tích phản ứng là 15 µl Thành phần bao gồm 5 µl ADN có nồng độ 10 ng, 0,15 µM mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X Buffer PCR, 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase.

- Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.

Ngày đăng: 05/04/2022, 21:22

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo

Loại

Chi tiết

19. Fleischmann RD. Adams MD. White O et al., (1995). Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269:496-512

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Fleischmann RD. Adams MD. White O et al
Năm:	1995

21. Goff SA. Ricke D. Lan T-H et al., (2002) A draft sequence of the rice genome (iOryza sativa L. ssp. japónica). Science 296:92-100

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al

33. Kawahara Y, de la Bastide M, Hamilton JP et al., (2013). Improvement of the Oryza saliva Nipponbare reference genome using next generation sequence and optical map data. Rice (N Y) 6:4

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Kawahara Y, de la Bastide M, Hamilton JP et al
Năm:	2013

51. Michael TP, Jupe F. Bemm F. et al., (2017). High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell. bioRxiv:l-18

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Michael TP, Jupe F. Bemm F. et al
Năm:	2017

68. Sakai H, Naito K, Ogiso-Tanaka E et al., (2015). The power of single molecule real-time sequencing technology in the de novo assembly of a eukaryotic genome.Sci Rep 5:16780. https://doi.org/ 10.1038/srcp 16780

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Sakai H, Naito K, Ogiso-Tanaka E et al
Năm:	2015

78. Singh VK, Singh A, Singh SP, Ellur RK, Choudhary V, et al., (2012). Incorporation of blast resistance into PRR78, an elite Basmati rice restorer line, through marker assisted backcross breeding. Field Crops Research 128: 8-16

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Singh VK, Singh A, Singh SP, Ellur RK, Choudhary V, et al
Năm:	2012

79. Su, J., Wang, W. J., Han, J. L., Chen, S., Wang, C. Y., Zeng, L. X., et al., (2015). Functional divergence of duplicated genes results in a novel blast resistance gene Pi50 at the Pi2/9 locus. Theor. Appl. Genet. 128, 2213–2225

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Su, J., Wang, W. J., Han, J. L., Chen, S., Wang, C. Y., Zeng, L. X., et al
Năm:	2015

80. Su, J., Wang, W. J., Han, J. L., Chen, S., Wang, C. Y., Zeng, L. X., et al., (2015). Functional divergence of duplicated genes results in a novel blast resistance gene Pi50 at the Pi2/9 locus. Theor. Appl. Genet. 128, 2213–2225

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Su, J., Wang, W. J., Han, J. L., Chen, S., Wang, C. Y., Zeng, L. X., et al
Năm:	2015

88. W.A.D. Jayawardana et al., (2014). Evaluation of ADN markers linked to blast resistant genes, pikh, Pit(p), and Pita, for parental selection in Sri Lankan rice breeding, Trop. Agric. Res. 26 82-93

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	W.A.D. Jayawardana et al
Năm:	2014

94. Yu J. Hu S, Wang J et al., (2002). A draft sequence of the rice genome {Oryza sativa L. ssp. indica). Science 296:79-92

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Yu J. Hu S, Wang J et al
Năm:	2002

99. Zheng, W., Wang, Y., Wang, L., Ma, Z., Zhao, J., Wang, P., et al., (2016). Genetic mapping and molecular marker development for Pi65(t), a novel broad- spectrum resistance gene to rice blast using next-generation sequencing. Theor.Appl. Genet. 129, 1035–1044. doi: 10.1007/s00122-016-2681-7

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al
Tác giả:	Zheng, W., Wang, Y., Wang, L., Ma, Z., Zhao, J., Wang, P., et al
Năm:	2016

5. Tổng cục thống kê (2018). https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=717 II. Tài liệu tiếng Anh

Link

1. Arabidopsis Genome Initiative (2000). Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408:796-815

Khác

2. Ashkani, S., Rafii, M. Y., Rahim, H. A., & Latif, M. A. (2013). Genetic dissection of rice blast resistance by QTL mapping approach using an F3 population. Molecular Biology Reports, 40, 2503-2515

Khác

3. Ballini E, Morel JB, Droc G, Price A, Courtois B, Notteghem JL, Tharreau D, (2008). A genome-wide meta-analysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance. Mol Plant-Microbe Interact 21:859–868

Khác

4. Basavaraj SH, Singh VK, Singh A, Singh A, Singh A. (2010). Marker-assisted improvement of bacterial blight resistance in parental lines of Pusa RH10, a superfine grain aromatic rice hybrid. Molecular Breeding 26: 293-305

Khác

5. Basavaraj SH, Singh VK, Singh AK, Singh D, Nagarajan M (2009). Marker aided improvement of Pusa 6B, the maintainer parent of rice hybrid Pusa RH10, for resistance to bacterial blight. Indian journal of Genetics and Plant Breeding 69: 10-16

Khác

6. Biswas C, Dey P, Karmakar PG, Satpathy S. (2015). Discovery of large-scale SNP markers and construction of linkage map in a RIL population of jute (Corchorus capsularis). Mol Breeding.;35(5):1–10

Khác

7. Chaisson, M. J. và p. A. Pevzner (2008). Short read fragment assembly of bacterial genomes. Genome research 18(2): 324-330

Khác

8. Chaisson, M. J., D. Brinza và p. A. Pevzner (2009). De novo fragment assembly with short matepaired reads: Does the read length matter? Genome research 19(2): 336-346

Khác