Nghiên cứu chế biến, thành phần hoá học và tác dụng sinh học của phụ tử từ cây Ô đầu trồng ở Sa Pa (Aconitum carmichaelii Debx. var. carmichaelii)

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

Bùi Hồng Cường

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PHỤ TỬ TỪ CÂY Ô ĐẦU TRỒNG Ở SA PA

(Aconitum carmichaelii Debx var carmichaelii)

Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền

Mã số: 62 73 10 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2007

Trang 2

Công trình được hoàn thành tại: Viện Dược liệu, Trường đại học Dược Hà Nội,

Trường đại học Y Hà Nội, Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Công ty cổ phần Traphaco

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Phùng Hoà Bình

2 PGS.TS Nguyễn Trọng Thông

Phản biện 1: GS.TS Phạm Thanh Kỳ

Phản biện 2: GS.TSKH Hoàng Tích Huyền

Phản biện 3: GS.TSKH Đái Duy Ban

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại Viện Dược liệu

Vào hồi 8 giờ 30 phút, ngày 07 tháng 11 năm 2007

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Viện Dược liệu

- Thư viện Công ty cổ phần Traphaco

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

Trang 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Alc Alcaloid

Alc – CN Alcaloid chiết từ cao nước Phụ tử

AlcTP Alcaloid toàn phần

DĐTQ Dược điển Trung Quốc

DĐVN Dược điển Việt Nam

Diester alc Diester alcaloid

DL Dược liệu

g/kgTT Liều tính bằng g cho 1 kg thể trọng

gDL/kgTT Liều tính bằng g dược liệu cho 1 kg thể

trọng HPP Hắc phụ phiến

PP Phương pháp

PT Phụ tử (附子): củ con (củ nhánh) của

cây Ô đầu PTC Phụ tử chế

PTMg Phụ tử chế với dung dịch MgCl2

PTMgNa Phụ tử chế với dung dịch MgCl2 và NaCl

PTNa Phụ tử chế với dung dịch NaCl

PTP Phụ tử phiến

PTS Phụ tử sống

Trang 4

1

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Phụ tử là củ nhánh của một số loài thuộc chi Aconitum L (chi Ô đầu), là vị

thuốc quý trong y - dược học cổ truyền phương Đông, có tác dụng “hồi dương cứu nghịch”, nhưng có độc tính rất cao Trong y dược học cổ truyền, Phụ tử nhất thiết phải được chế biến nhằm giảm độc tính, phương pháp chế biến khác nhau thì tác dụng và độc tính khác nhau

Ở Việt Nam, ngay từ những năm đầu của thập kỷ 70 thế kỷ trước, cây Ô đầu đã được nhập trồng tại một số vùng núi phía Bắc Trong chiến tranh biên giới phía Bắc (1979), cây thuốc này đã bị phá hủy nhiều Từ năm 1990 trở lại đây, Ô đầu đã được người dân ở xung quanh thị trấn Sa Pa (Lào Cai) khôi phục và phát triển trồng trở lại và chế biến Phụ tử để làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian, không đảm bảo tính an toàn trong sử dụng Song, phần lớn dược liệu Phụ tử được

sử dụng ở Việt Nam hiện nay vẫn là do nhập khẩu không chính thức từ Trung Quốc, không có tiêu chuẩn chất lượng nên không đảm bảo an toàn, gây tâm lý lo ngại cho thầy thuốc và nhân dân Để có cơ sở khoa học cho việc đưa vị thuốc này vào sử dụng an toàn, hiệu quả từ nguồn nguyên liệu trong nước, nhằm ứng dụng

rộng rãi trong phòng và chữa bệnh, đề tài: “Nghiên cứu chế biến, thành phần hoá học và tác dụng sinh học của Phụ tử từ cây Ô đầu trồng ở Sa Pa

(Aconitum carmichaelii Debx var carmichaelii)” được tiến hành nghiên cứu

với 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp chế biến Phụ tử và bào chế cao Phụ tử cho sản phẩm có tác dụng cường tim và độc tính thấp

2 Xác định một số thành phần hoá học của Phụ tử sống và các sản phẩm góp phần tiêu chuẩn hoá phương pháp chế biến và bào chế

Trang 5

2 Ý NGHĨA CỦA LUẬN ÁN

Lần đầu tiên, Phụ tử thu từ cây Ô đầu trồng ở Việt Nam được nghiên cứu tiêu chuẩn hoá phương pháp chế biến, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học, làm cơ sở cho việc phát triển và sử dụng một vị thuốc quý làm nguyên liệu sản xuất thuốc ở Việt Nam

3 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN

Thực vật: Đã xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở Sa Pa là Aconitum

carmichaelii Debx var carmichaelii và mô tả các đặc điểm hình thái thực vật của

cây, các đặc điểm vi học của rễ củ, thân, lá cây Ô đầu, góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu

Chế biến Phụ tử chế và bào chế cao Phụ tử:

- Xác định thời điểm thu hoạch Phụ tử ở Sa Pa trong giai đoạn cây ra hoa đến

ra quả (cuối tháng 8 đến cuối tháng 10)

- Đã xây dựng được dự thảo quy trình chế biến Phụ tử chế từ Phụ tử khô theo phương pháp ngâm với dung dịch muối NaCl Phụ tử chế có hàm lượng alcaloid toàn phần là 0,23%, diester alcaloid là 0,036%, aconitin là 0,0012%

- Đã xây dựng được dự thảo quy trình bào chế cao đặc và cao khô Phụ tử từ Phụ tử khô bằng phương pháp chiết nóng với nước Cao đặc có hàm lượng alcaloid toàn phần là 3,43%, diester alcaloid là 0,323%, không có aconitin Cao khô có hàm lượng alcaloid toàn phần là 2,42%, diester alcaloid là 0,198%, không

có aconitin

Hoá học:

- Các bộ phận của cây đều có alcaloid, acid amin, đường tự do, acid hữu cơ Ngoài ra, rễ củ có chất béo, sterol; thân có carotenoid; lá và hoa có carotenoid, sterol, flavonoid; hạt có chất béo, carotenoid

- Đã xây dựng được phương pháp định lượng aconitin trong Phụ tử và các sản phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trang 6

3

- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất: karacolin, benzoylmesaconin, sitosterol glucopyranosid từ Phụ tử sống; neolin và acid benzoic từ cao Phụ tử

β-Tác dụng sinh học: Các mẫu chế biến, cao nước từ Phụ tử đã được chứng minh

có độc tính cấp thấp, có tác dụng tăng biên độ co bóp của tim thỏ cô lập, tăng lưu lượng mạch vành và không gây loạn nhịp tim, giãn mạch tai thỏ cô lập và có tác dụng giảm đau trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic

4 BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 142 trang với 4 chương, 44 bảng, 41 hình, 186 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 51, tiếng Anh: 116, tiếng Pháp: 1, tiếng Đức: 1, tiếng Trung Quốc: 16, tiếng Nhật Bản: 1) và 17 phụ lục Các phần chính bao gồm: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (36 trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (13 trang), kết quả nghiên cứu (62 trang), bàn luận (26 trang), kết luận và kiến nghị (3 trang)

B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học

Chi Ô đầu (Aconitum L.) là một chi cây thuốc nổi tiếng, trên thế giới có khoảng 400 loài Ở Việt Nam, cây Ô đầu được ghi nhận bởi 2 tên: A fortunei Hemsl và A carmichaelii Debx Đề tài cần xác định tên khoa học chính thức của

cây Ô đầu ở Sa Pa

1.2 Thành phần hoá học của chi Aconitum L và một số phương pháp kiểm

định alcaloid của chi này

Thành phần chính trong chi Aconitum L là alcaloid, flavonoid,

polysaccharid, ngoài ra còn có một số chất thuộc nhóm glycosid, sterol, acid hữu cơ,… Trong đó, được quan tâm nhiều nhất là các diterpenoid alcaloid, đây là nhóm chất có hoạt tính mạnh và độc tính cao

Trang 7

Các phương pháp kiểm định alcaloid Aconit gồm: định tính bằng phản ứng

hoá học, sắc ký lớp mỏng, quang phổ tử ngoại và định lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid, aconitin và các alcaloid khác

1.3 Tác dụng sinh học và độc tính

Phụ tử sống rất độc nhưng sau khi chế biến thì độc tính giảm và được sử dụng làm thuốc Tác dụng cường tim, tăng lưu lượng tuần hoàn, chống loạn nhịp tim được nhiều nhà khoa học quan tâm Một số tác dụng khác: chống sốc, chống

hạ thân nhiệt, chống viêm, giảm đau, tăng miễn dịch, chống ung thư, chống động kinh, hạ đường huyết,…

1.4 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

Phụ tử sống chỉ được dùng ngoài Phụ tử chế được dùng trong, có tác dụng hồi dương cứu nghịch, bổ hoả trợ dương, khứ hàn giảm đau, ấm thận hành thuỷ, kiện tỳ vị,…

loài A carmichaelii Debx ở Việt Nam

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phụ tử (củ con) thu từ cây Ô đầu được trồng ổn định ở Sa Pa – Lào Cai, tiêu bản thực vật được lưu trữ tại một số bảo tàng mẫu ở Hà Nội, các mẫu nghiên cứu chế biến, bào chế từ Phụ tử

2.2 Phương pháp (PP) nghiên cứu

- Xác định tên khoa học theo PP so sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối

chiếu với khoá phân loại chi Aconitum L Nghiên cứu đặc điểm vi học: làm tiêu

bản và bột củ, thân, lá cây Ô đầu

Trang 8

5

- Thu hoạch Phụ tử ở các thời kỳ sinh trưởng của cây, xác định khối lượng và

số lượng củ Phụ tử / gốc và tỷ lệ dược liệu khô / tươi để xác định thời điểm thu hoạch thích hợp cho năng suất cao

- Chế biến Hắc phụ phiến theo PP cổ truyền

- Chế biến PTMg, PTNa, PTMgNa từ Phụ tử khô theo PP ngâm với các dung dịch muối NaCl và MgCl2

- Bào chế cao đặc và cao khô chiết nước theo PP chiết nước nóng Bào chế cao đặc chiết cồn theo PP ngấm kiệt bằng cồn

- Phân tích sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hoá học

- Định tính alcaloid bằng các thuốc thử chung, quang phổ hấp thụ tử ngoại, sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Định lượng alcaloid toàn phần: PP acid-baze (DĐTQ)

- Định lượng diester alcaloid: PP đo độ hấp thụ (DĐTQ)

- Định lượng aconitin: PP sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn Phụ tử chế và cao Phụ tử: căn cứ kết quả nghiên cứu về chế biến và hóa học, tham khảo các tài liệu để đề nghị một số chỉ tiêu định tính, định lượng

- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột và xác định cấu trúc dựa trên các thông số vật lý và các PP phổ: điểm chảy, phổ khối lượng, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon

- Thử độc tính cấp và xác định LD50 theo PP Litchfield-Wilcoxon

- Thử tác dụng trên tim thỏ cô lập theo PP Langendorff

- Thử tác dụng trên cơ trơn mạch tai thỏ cô lập theo PP Kravkov

- Thử tác dụng trên tim và huyết áp chó

- Thử tác dụng giảm đau theo PP gây quặn đau bằng acid acetic (PP Koster)

Trang 9

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CÂY Ô ĐẦU TRỒNG Ở SA PA

3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học

Đã xác định các đặc điểm vi phẫu và bột rễ củ, thân, lá Ô đầu

3.2 NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN PHỤ TỬ VÀ BÀO CHẾ CAO PHỤ TỬ

3.2.1 Thu hoạch Phụ tử

Thu hoạch Phụ tử ở 5 thời kỳ sinh trưởng của cây, từ khi chưa ra hoa đến khi lụi trong 3 năm 2003-2005 Sơ chế thành Phụ tử khô Số lượng và khối lượng củ Phụ tử / gốc thấp nhất vào tháng 7; ổn định vào các tháng 8, 9, 10, 11 Tỷ lệ dược liệu khô / tươi ổn định vào các tháng 7, 8, 9, 10; thấp nhất vào tháng 11 Kết hợp kết quả nghiên cứu về hàm lượng alcaloid trong Phụ tử và thời tiết ở Sa Pa, thời điểm thu hoạch được đề nghị là từ cuối tháng 8 (ra nụ) đến cuối tháng 10 (ra quả)

3.2.2 Chế biến Phụ tử

3.2.2.1 Chế biến Hắc phụ phiến (HPP) từ Phụ tử tươi

Ngâm Phụ tử tươi vào dung dịch MgCl2 theo công thức:

Trang 10

7

3.2.2.2 Chế biến Phụ tử chế PTMg, PTNa, PTMgNa từ Phụ tử khô

Phụ tử khô được ngâm vào dung dịch muối theo các công thức (CT) nêu trong Bảng 3.7, rửa sạch, nấu với nước, thái phiến, sấy khô

Số lượng Nguyên liệu Đơn

vị CT 1

(PTMg)

CT 2 (PTNa) CT 3 (PTMgNa)

Kết quả: Phụ tử được chế biến theo 3 công thức trên đều có thể chất khô

cứng, giòn, màu trắng ngà, còn vết vỏ củ màu nâu đen ở phía ngoài phiến, độ ẩm 9-11% Hiệu suất chế Phụ tử PTMg, PTNa, PTMgNa tương đương nhau (p > 0,05) (Bảng 3.8)

Bảng 3.8 Hiệu suất chế biến Phụ tử chế PTMg, PTNa, PTMgNa

3.2.3.1 Phương pháp 1: Phụ tử khô, rửa sạch, đồ mềm, thái phiến, sấy khô thu

được Phụ tử phiến (PTP) Nấu PTP với nước, cô cao, loại tạp bằng cồn, cô đặc thu được cao đặc (chiết nước)

3.2.3.2 Phương pháp 2: Tương tự như bào chế cao đặc (chiết nước), không loại

tạp, cô đặc, sấy khô thu được cao khô (chiết nước)

3.2.3.3 Phương pháp 3: Bột thô Phụ tử được chiết bằng cồn, cất thu hối cồn, cô

đặc thu được cao đặc (chiết cồn)

Trang 11

Kết quả: Cao đặc và cao khô Phụ tử đạt các chỉ tiêu chung DĐVN III về thể

chất, hình thức và độ ẩm Hiệu suất bào chế cao khô Phụ tử cao hơn cao đặc có ý nghĩa thống kê (P < 0,01) Hiệu suất bào chế 2 cao đặc chiết nước chiết cồn khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) (Bảng 3.9) Cao Phụ tử chiết nước sau

15 phút nấu còn tê không đáng kể, sau 30 phút thì không còn vị tê, cao đặc (chiết nước) và cao khô Phụ tử không có vị tê, trong khi đó cao đặc Phụ tử (chiết cồn) vẫn còn vị tê rõ, chứng tỏ vẫn còn độc

Bảng 3.9 Hiệu suất bào chế cao Phụ tử

1 Cao đặc (chiết nước) 5 11,8 ± 1,9 15,6 ± 2,6

3.3.2 Nghiên cứu về alcaloid

3.3.2.1 Định tính

a Định tính bằng phản ứng hoá học

Các mẫu nghiên cứu Phụ tử sống, Phụ tử chế, cao Phụ tử và các dịch ngâm trong quá trình chế biến đều cho phản ứng dương tính với các thuốc thử chung của alcaloid

b Định tính alcaloid bằng quang phổ hấp thụ tử ngoại

Phổ tử ngoại của aconitin và alcaloid Phụ tử sống cho hấp thụ cực đại ở bước sóng 231 nm, alcaloid Phụ tử chế và cao Phụ tử đều cho hấp thụ cực đại ở 2 bước sóng 231 nm và 274nm (Hình 3.17)

Trang 12

9

a b c d

Hình 3.17 Phổ UV của aconitin (a), alcaloid trong Phụ tử sống (b), Phụ tử

chế (c) và cao Phụ tử (d)

c Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Trên sắc ký đồ của Phụ tử sống và Phụ tử chế xuất hiện pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic aconitin chuẩn, trên sắc ký đồ của cao Phụ tử không thấy pic aconitin (Hình 3.18)

a b c d

Hình 3.18 Sắc ký đồ của aconitin (a), alcaloid trong Phụ tử sống (b), Phụ

tử chế (c), cao Phụ tử (d)

3.3.2.2 Định lượng

a Định lượng alcaloid toàn phần

* Định lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử sống

Hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử sống thu hoạch ở 5 thời kỳ sinh trưởng của cây trong từng năm và giữa các năm nghiên cứu dao động không nhiều, từ 0,91% đến 1,11% (Bảng 3.11)

Trang 13

Bảng 3.11 Hàm lượng alcaloid toàn phần trong các mẫu Phụ tử sống

Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

Năm 2003 Năm 2004 Năm 2005

Thời kỳ

sinh trưởng

n X ±SD n X ±SD n X ±SD

P (3 năm) Chưa ra hoa 9 1,05 ± 0,16 9 0,93 ± 0,02 6 1,02 ± 0,03 > 0,05

Ra nụ 12 1,07 ± 0,15 12 0,98 ± 0,03 6 1,05 ± 0,10 > 0,05 Hoa nở rộ 9 1,00 ± 0,10 9 0,92 ± 0,02 6 0,91 ± 0,02 < 0,05

Ra quả 9 1,11 ± 0,15 9 1,05 ± 0,03 6 1,02 ± 0,07 > 0,05 Lụi 9 1,11 ± 0,11 6 1,02 ± 0,02 6 1,07 ± 0,03 > 0,05

P (từng năm) > 0,05 < 0,001 < 0,01

* Định lượng alcaloid toàn phần trong các mẫu chế biến và bào chế:

Hàm lượng alc toàn phần trong các mẫu chế biến và bào chế tính theo dược liệu đều thấp hơn trong PTS có ý nghĩa thống kê (P < 0,001), (Bảng 3.12)

Bảng 3.12 Hàm lượng alc toàn phần trong các mẫu chế biến và bào chế

b Định lượng diester alcaloid (nhóm chất có độc tính cao)

* Định lượng diester alc trong PTS ở các thời kỳ sinh trưởng của cây:

Hàm lượng diester alcaloid trong PTS qua các thời kỳ sinh trưởng của cây dao động nhiều, sự khác nhau trong từng năm có ý nghĩa thống kê (P < 0,01 – 0,001), (Bảng 3.14)

Trang 14

11

Bảng 3.14 Hàm lượng diester alcaloid trong các mẫu Phụ tử sống

Hàm lượng diester alcaloid (%)

Năm 2003 Năm 2004 Năm 2005

Thời kỳ

sinh trưởng

n X ±SD n X ±SD n X ±SD

P (3 năm)Chưa ra hoa 12 0,21± 0,02 12 0,18 ± 0,01 6 0,25 ± 0,01 < 0,001

Ra nụ 12 0,27± 0,02 12 0,25 ± 0,01 6 0,22 ± 0,02 < 0,001Hoa nở rộ 12 0,25 ± 0,03 12 0,25 ± 0,04 6 0,24 ± 0,01 > 0,05

Ra quả 12 0,31 ± 0,05 9 0,23 ± 0,03 6 0,23 ± 0,04 < 0,001Lụi 12 0,26 ± 0,04 6 0,20 ± 0,01 6 0,27 ± 0,01 < 0,01

P (từng năm) < 0,001 < 0,001 < 0,01