Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của chế phẩm có hoạt tính điều hòa miễn dịch từ lá chay bắc bộ (artocarpus tonkinensis) họ dâu tằm (moraceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHẾ PHẨM CĨ HOẠT TÍNH ĐIỀU HỊA MIỄN DỊCH TỪ LÁ CHAY BẮC BỘ (ARTOCARPUS TONKINENSIS) HỌ DÂU TẰM (MORACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng – Năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CHẾ PHẨM CĨ HOẠT TÍNH ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH TỪ LÁ CHAY BẮC BỘ (ARTOCARPUS TONKINENSIS) HỌ DÂU TẰM (MORACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số : 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRỊNH THỊ THỦY Đà Nẵng – Năm 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ HỌ DÂU TẰM (MORACEAE) 1.2 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ CHI CHAY (ARTOCARPUS) 1.2.1 Đặc điểm chung hình thái chi Artocarpus 1.2.2 Phân biệt số loài chi Artocarpus 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI ARTOCARPUS 17 1.3.1 Một số tác dụng dược lý chay bắc 17 1.3.2 Một số thuốc từ Chay 18 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 19 1.4.1 Trên giới 19 1.4.2 Ở Việt Nam 19 CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 27 2.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 27 2.1.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật tạo chế phẩm 27 2.1.2 Phương pháp tách tinh chế chất hữu 28 2.1.3 Phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng 28 2.1.4 Phương pháp sắc ký cột 31 2.1.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học chất 38 2.2 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 38 2.2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 38 2.2.2 Quy trình điều chế chế phẩm phân lập chất từ chế phẩm 41 2.2.3 Phân lập chất từ chế phẩm Chay (AT) 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TÁCH ĐƯỢC 52 3.1.1 Số liệu phổ chất tách 52 3.1.2 Xác định cấu trúc chất tách 57 3.2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CÁC CHẤT TÁCH ĐƯỢC, THỜI GIAN LƯU VÀ HÀM LƯỢNG CỦA CÁC CHẤT TRONG CHẾ PHẨM AT 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (BẢN SAO) DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh s Singlet (NMR) t Triplet (NMR) m Multiplet J Tiếng việt Hằng số tương tác (NMR) d doublet (NMR) dd dublet dublet Độ dịch chuyển hóa học tính δ (ppm) ppm (NMR) Rf Retention factor ppm part per million Hệ số di chuyển DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu H-NMR Tiếng Anh Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectrocopy proton Carbon-13 13 C-NMR Tiếng Việt Magnetic Nuclear Resonance Spectrocopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Distotionless DEPT Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer HMBC EI EI-MS Heteronuclear bond correlation Phổ tương quan 1H - 13C tương tác xa (qua 2-3 liên kết) Electronic impact Electron Impact – Mass spectroscopy Electron ESI-MS multiple Phổ khối va chạm electron Spray Ionisation-Mass Phổ khối bụi electron Spectroscopy IR Infrared Spectroscopy UV Ultraviolet SKC Sắc ký cột SKLM CH2Cl2 Phổ hồng ngoại Sắc ký lớp mỏng Dichloromethan CHCl3 Me Chloroform Methyl MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetate CD3OD Methanol deutri MS LC-MS Mass spectrometry Liquid chromatography – mass spectrum Sắc ký lỏng hiệu cao gắn HPLC-MS NMR khối phổ (HPLC-ESI-MS) Nuclear magnetic resonance LH-20 Sephadex LH 20 RP18 Rervse phase 18 EtOH Ethanol BuOH Butanol PĐ HCTN DM Sắc ký lỏng gắn khối phổ Chất ngược pha RP18 (Pha đảo) Phân đoạn Hợp chất tự nhiên Dung môi DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng Trang 2.1 Kết sắc ký cột sephadex phân đoạn C5.2.1 50 3.1 Kết phổ 1H-NMR AT2.3 53 3.2 Số liệu phổ 13C-NMR DEPT chất AT2.3 53 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR C5.P 55 3.4 Số liệu phổ 13C-NMR DEPT C5.P 56 3.5 3.7 3.8 3.9 3.10 11 So sánh phổ hồng ngoại AT2.3 với phổ hồng ngoại kaempferol So sánh phổ khối lượng AT2.3 với kaempferol Vị trí proton phổ 1H-NMR AT2.3 kaempferol Vị trí carbon phổ H-NMR AT2.3 kaempferol Số liệu phổ 13 C-NMR AT2.3 kaempferol (125 MHZ, δ ppm, CD3OD) Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR chất C5.P chất so sánh catechin Kết sắc ký đồ HPLC chất xuất chế phẩm AT 57 58 59 60 63 75 78 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình 1.1 Cây mít dai miền bắc (Artocarpus heterophyllus Lamk.) Trang 1.2 Cây Mít tố nữ (Artocarpus integer) 1.3 Mít Petelot (Artocarpus petelotii Gagnep.) 11 1.4 Chay bóng (Mít rễ khoai) (Artocarpus nitidus Trécul) 11 1.5 Cây Chay to (Artocarpus lakoocha Roxb.) Cây xa kê (Artocarpus altilis) 13 1.6 1.7 Cây, hoa Chay bắc (Artocarpus tonkinensis A Chev Gagnep.) 13 14 1.8 Quả Chay bắc xanh 15 1.9 Quả Chay bắc chín 15 1.10 Quả chín thái lát phơi khơ 15 1.11 Rễ Chay bắc 15 2.1 Chế phẩm AT từ Chay bắc 38 2.2 Một số dung môi sử dụng 40 2.3 Đèn tử ngoại UV 40 2.4 Bộ cất dung môi tinh khiết 40 2.5 Bộ quay cất chân không Buchi 40 2.6 Cột silicagel tách chất từ chế phẩm AT 42 2.7 Cột sephadex tách chất từ phân đoạn AT3 45 2.8 Cột sephadex LH-20 chạy phân đoạn C5 47 2.9 Cột sắc ký silicagel phân đoạn C5.2 nạp mẫu 48 69 Hz; H-2’) dd dH 6,75 (J = 8,5; 2.0 Hz, H-6’) cho thấy vịng B có hai nhóm C-3’ C-4’ Phổ 1H-NMR C5.P có tín hiệu H-2 d dH 4,58 (J = 7,5 Hz) H-3 m dH 4,00; chất epicatechin tín hiệu H-2 br s dH 4,83 H-3 br d dH 4,18 [10], [8] So sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR C5.P với catechin cho thấy tín hiệu hai chất hoàn toàn phù hợp vị trí tương ứng Epicatechin catechin hai đồng phân lập thể nhau, cấu trúc hai hợp chất khác cấu hình C-3 Trong phân tử catechin C-3 có cấu hình S, C-3 epicatechin có cấu hình R [8] 70 Hình 3.6 Phổ 1H-NMR chất C5.P (CD3OD, 500 MHz) 71 Hình 3.7 Phổ H-NMR(giãn rộng) chất C5.P (CD3OD, 500 MHz) 72 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR (giãn rộng)của chất C5.P (CD3OD, 500 MHz) 73 * Phổ 13C-NMR DEPT Phổ 13 C-NMR catechin có tín hiệu 15 nguyên tử cacbon với đặc trưng khung flavan-3-ol bao gồm: tín hiệu cacbon bậc dC 132,2-157,8; tín hiệu nhóm methin có tín hiệu methin nhân thơm dC 95,5-120,0; nhóm oxymethin (C-2, C-3) dC 68,8 82,6; nhóm metylen (C-4) dC 28,5 74 Hình 3.9 Phổ DEPT 13C-NMR chất C5.P (CD3OD, 125 MHz) 75 Qua phân tích liệu phổ so sánh với số liệu công bố, cấu trúc chất C5.P xác định catechin [10] Các số liệu phổ chất C5.P bảng 3.10 Bảng 3.10 Số liệu phổ 13C-, 1H-NMR chất C5.P catechin [10] Chất C5.P Vị trí Catechin [10] C δC δH δC δH 82,79 4,58 d (7,5) 82,85 4,59; d (7,5) 68,77 4,00 m 68,81 28,45 3,99; m ax 2,53; dd (16,1;8,1) 156,87 95,52 157,52 96,31 157,77 157,56 10 100,83 100,86 1’ 132,19 132,23 2’ 115,25 3’ 146,19 146,24 4’ 146,17 146,22 5’ 116,10 6,79 d (8) 116,11 6,78; d (8,1) 6’ 120,04 6,82 dd (8; 2,0) 120,05 6,74; dd (8,1; 1,9) 2,52 dd (16; 8) 2,87dd (16,0; 5,5) 28,50 eq 2,87; dd (16,1;5,4) 156,91 5,87 d (2,5) 96,33 5,95; d (2,3) 157,82 5,95 d (2,5) 6,86 d (2) 95,54 115,28 5,88; d (2,3) 6.86, dd (1,9) 76 3.2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CÁC CHẤT TÁCH ĐƯỢC, THỜI GIAN LƯU VÀ HÀM LƯỢNG CỦA CÁC CHẤT TRONG CHẾ PHẨM AT Chế phẩm AT hai chất auronol glucosid TAT2 (maesopsin 4-O-bD-glucopyranosit) là: 10,89 phút chất TAT6 (alphitonin 4-O-b-Dglucopyranosit) nhóm GS Trần Văn Sung tách trước đó, luận văn tách thêm hai chất (C5.P, AT2.3) Vì chúng tơi xác định có mặt chất chế phẩm với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm AT Kế thừa kết có phịng tổng hợp hữu xác định thời gian lưu chất (TAT6, TAT2, catechin kaempferol), chúng tơi phân tích sản phẩm AT HPLC điều kiện với chất chuẩn để nhận diện thành phần chất tách xác định (TAT6, TAT2, AT2.3 C5.P) Khảo sát HPLC Cân xác mg chất C5.P, AT2.3, TAT2, TAT6 chất chuẩn catechin kaempferol phịng tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa Hịa tan chất 0,5 ml MeOH bình định mức đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha lỗng thành nồng độ thích hợp mẫu chuẩn tương ứng tiêm vào hệ thống HPLC điều kiện (*) để xác định thời gian lưu chất Điều kiện (*): Máy: HPLC-Waters Alliance 2695, Mỹ; Detector: PDA-3D; cột: RP-C18, 250x4,6mm, cỡ hạt 5mm; dung môi: MeOH-H2O (75:25, v/v); Tốc độ dòng: 1ml/phút; thời gian chạy 25 phút; thời gian lưu (Rt) chất TAT2 (maesopsin 4-O-b-D-glucopyranosit) là: 10,89 phút chất TAT6 (alphitonin 4-O-b-D-glucopyranosit) là: 9,40 phút 77 Ở điều kiện tiêm vào hệ thống HPLC chế phẩm AT với chất chuẩn TAT2 thấy xuất peak to cao lên (màu đỏ) Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC AT (thêm chất chuẩn TAT2 tách được) Tương tự tiêm vào hệ thống HPLC chế phẩm AT với chất chuẩn catechin (cùng điều kiện) thấy xuất peak A có giá trị Rt= 16.88 phút to lớn lên, chứng tỏ peak A C5.P; peak B có giá trị Rt= 16.29 phút to lớn lên kaempferol (AT2.3) Các chất khẳng định thêm sắc ký lỏng hiệu cao gắn khối phổ (HPLC-ESI-MS) 78 Hình 3.11 Sắc ký đồ HPLC chế phẩm AT (thời gian lưu tương ứng với chất tách với chất chuẩn) Bảng 11 Kết sắc ký đồ HPLC chất xuất chế phẩm AT Chất Thời gian lưu Rt Diện tích(AU.s) Hàm lượng (%) Chiều cao TAT6 9.40 959855 7,94 83677 TAT2 10.89 8796463 72,77 815787 AT2.3 16.29 179090 1,48 19049 C5.P 16.88 538134 4,45 55604 79 * Hàm lượng chất chế phẩm AT Chạy HPLC chế phẩm AT điều kiện chạy xác định Rt chất chuẩn, cho phép xác định catechin (C5.P) kaempferol (AT2.3) hàm lượng tương đối chúng chế phẩm AT trình bày bảng 3.11 80 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong khuôn khổ đề tài luận văn thạc sĩ, nghiên cứu thành phần hoá học chế phẩm AT thu kết sau: Từ chế phẩm AT phương pháp sắc kí cột silicagel, lọc gel sephadex LH – 20, kết hợp với kiểm tra sắc kí lớp mỏng phân lập hai chất ký hiệu là: C5.P AT2.3; Bằng cách kết hợp phương pháp phổ đại phổ FT-IR, MS, H-, 13 C-NMR, xác định cấu trúc hai hợp chất flavonoid bao gồm: - Chất C5.P: Catechin (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavan) - Chất AT2.3: Kaempferol (3,4’,5,7-tetrahidroxiflavon) Đã xác định có mặt chất chế phẩm AT sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kết đóng góp cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho chế phẩm AT từ Chay bắc Đây tiêu chí để tiêu chuẩn để phát triển sản phẩm sử dụng làm thuốc thực phẩm chức Kiến nghị Tiếp tục phân lập phân đoạn lại chế phẩm AT để xác định thành phần hoá học chất khác chế phẩm Nghiên cứu sâu hoạt tính điều hịa miễn dịch từ chất tách góp phần tạo sản phẩm thuốc thực phẩm chức từ Chay ứng dụng điều trị số bệnh tự miễn Tiếp tục nghiên cứu cách sử dụng hai hợp chất catechin kaempferol lĩnh vực Y-Dược học Chay bắc loại đặc hữu trồng nhiều Việt Nam DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Đặng Dũng, Trịnh Hiền Trung, Phạm Hoàng Ngọc, Trần Lưu Vân Hiền (2002), “Phân lập xác định ampelopsin Chay”, Tạp chí Dược liệu,7 (5), 137-140 [2] Lê Xuân Hải, Vũ Dương Quý, Phạm Mạnh Hùng (1996), Tác dung chống thải mảnh ghép da dị gen chuột hợp chất flavonoid chay, Báo cáo khoa học giảng dạy nghiên cứu Miễn dịch học, Học viện quân y [3] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ TP Hồ Chí Minh [4] Trịnh Phương Liên, Ngơ Quốc Anh, Trần Văn Sung (2001), “Hoạt tính ức chế chuyển dạng lympho bào ±-catechin chiết tách từ Chay bắc (Artocarpus tonkinensis)”, Tạp chí dược liệu, 6(6), 173-176 [5] Đỗ Ngọc Liên, Cesari l., Hoebeke J.(1992), Sử dụng lectin chay (Artocarpus tonkinensis A Chev ) để chuẩn đoán miễn dịch ký sinh trùng Schistosoma mansoni, Vệ sinh phòng dịch 2(3) tr.189-194 [6] Đỗ Ngọc Liên, Duarte.F, Aucouturier p., Một số đặc tính miễn dịch lectin chi Artocarpus Việt Nam, Di truyền học ứng dụng 2, tr 20-23 [7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Các phương pháp cô lập hợp chất tự nhiên, NXB ĐHQG Tp HCM, tr – 73; 151 – 206; 323 – 334 [8] Trịnh Thị Thủy, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Huy Cường, Trần Văn Sung (2008), “Catechin epicatechin từ Dây săng máu (Celastrus paniculatus Willd.)” Tạp chí Dược liệu (Journal of Materia MedicaHanoi), 13 (3), 108-110 [9] Từ điển hợp chất tự nhiên tr 276-278 [10] Nguyễn Hồng Vân, Trịnh Thị Thuỷ, Trần Văn Sung (2007), “Flavonoids from Fissistigma acuminatissima”, Tạp chí Hóa học (Vietnam Journal of Chemistry) 45 (5), 648-651) TIẾNG ANH [11] Deny Susanti, Hasnah M Sirat, Farediah Ahmad, Rasadah Mat Ali, Norio Aimi, Mariko Kitajima (2007), “Antioxidant and cytotoxic flavonoids from the flowers of Melastoma malabathricum L.”, Food Chemistry 103, 710–716.] [12] Khang N.Q., J Lectins (1988), Biology, Biochemistry, 6, 341 [15] [13] Khang N Q., Strosberg, A., D, Hocbeke J (1998), Purification and characterization of the Artocarpus tonkinensis lectin, Lectins – Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry, Vol 6, 314 [14] Lin, L.C et al (2000), Planta Medica, 66, 333-336 [15] L.K.Dung, T T Thuy, T V Sung, P, T, Ninh (2004), “Phenolglycosides from Vietnamese Artocarpus tokinensis”, Journal of Materia Medica-Hanoi (1): 2-6 [16] L K Dung, T T Thuy, T V Sung, P T Ninh (2004), “Phenol glycosides from Vietnamese Artocarpus tonkinensis”, Tạp Chí Dược liệu (Journal of Materia Medica-Hanoi) (1), 2-6 [17] Mahato, S B., Nandy, A K., and Roy, G (1992), Phytochemistry, Vol 34, No 7, p 2199 - 2249 [18] Trinh Phuong Lien, H Ripperger, Tran Van Sung and G Adam (1998), Constituents of Artocarpus tonkinensis Die Pharmazie, 53 (5) 353 [19] U B Jagtap, V A Bapat (2010), “Artocarpus: A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology”, Ethnopharmacology, Vol.129, pp 142-166 Journal of WEBSITE [20] http://en,wikipedia.org/wiki/Artocarpus [21] http://en,wikipedia.org/wiki/Moraceae [22] http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%ADt [23] http://vi.wikipedia.org/wiki/Xa_k%C3%AA [24] http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Chay-3470/ [25] http://www.caycongtrinh.com.vn/cay-cong-trinh/cay-chay [26] http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=1013 [27] http://vi.wikipedia.org/wiki/Chay_B%E1%BA%AFc_B%E1%BB%99 [28] http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.13653083.2005.01560.x/full [29] http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_D%C3%A2u_t%E1% BA%B1m [30] http://www.vietgle.vn/trithucviet/detail.aspx?pid=NzhDRTAy MEMwQQ&key=Lo%C3%A0i+Chay+C%C3%BAc+ph%C6%B0% C6%A1ng%2C+Chay+Petelot%2C+M%C3%ADt+Petelot&type=A0 &stype=0 [31] http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%ADt_t%E1%BB%91_ n%E1%BB%AF [32] http://www.duoclieu.org/2013/06/chay-la-bong-cong-dung-cach-dungcay.html [33] http://www.thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/tac-dung-cua-dich-triet-caychay-len-bach-cau-da-nhan-va-bach-cau-tu-nhien-cuachuot/2935.yhoc [34] http://nld.com.vn/182107p0c1050/chat-flavonoid-tu-la-cay-chay-giupbao-quan-mo-than-uc-che-phan-ung-thai-ghep.htm [35] http://www.duoclieu.org/2012/02/tac-dung-sinh-hoc-cua-flavonoid.html ... tơi chọn đề tài ? ?Nghiên cứu xác định thành phần hóa học chế phẩm có hoạt tính điều hịa miễn dịch từ Chay bắc (Artocarpus tonkinensis) họ Dâu tằm (Moraceae)? ?? Mục đích nghiên cứu Xác định thành phần. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHẾ PHẨM CĨ HOẠT TÍNH ĐIỀU HỊA MIỄN DỊCH TỪ LÁ CHAY BẮC BỘ (ARTOCARPUS TONKINENSIS) HỌ DÂU... phần hóa học có chế phẩm AT Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng: Chế phẩm Chay AT phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học điều chế Phạm vi nghiên cứu: Xác định thành phần hóa học (định tính định