XÚC tác SINH học

Xúc tác sinh học trong quá trình tổng hợp thuốc

B XÚC TÁC SINH HỌC – ENZYME

I.Giới thiệu về xúc tác sinh học - Enzyme

1.Khái Niệm

Các quá trình hoá học xảy ra trong cơ thể sống là những phản ứng có hiệu quả cao nhất Đó là nhờ tác dụng xúc tác của enzyme, enzyme là những chất xúc tác sinh học Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể Điểm rất đặc biệt của enzyme là chúng hoạt động trong diều kiện ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ thể sinh vật Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng Nhiệt độ càng cao, tốc độ xúc tác phản ứng hóa học càng cao Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau[1]:

1- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

2- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao

3- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

4- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

5- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng

enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme

6- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào Trong hơn

1000 loại enzyme đã biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng

200 loại

2.Danh pháp, cấu tạo và phân loại

a.Danh pháp

- Đuôi tận cùng là –ase

- Theo cơ chât phản ứng

• Phần thể hiện cơ chất

• Phần thể hiện loại phản ứng + phân đuôi ase

Ví dụ :sucrase – phản ứng sucrose, lipase – phản ứng lipid

Theo chức năng của enzyme

Ví dụ: oxidase – catalyzes oxidation, hydrolase – catalyzes hydrolysis

- Đối với các enzyme xúc tác cho các quá trình tiêu hóa thức ăn thường tận cùng là “in” pepsin, trypsin

Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme được gọi theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộng thêm đuôi “ase”

b Cấu tạo

- Enzyme 1 cấu tử:là enzyme trong thành phần cấu tạo chỉ có protein

VD: pepsin ,urease[2]

Enzyme 2 cấu tử là enzyme trong thành phần của nó ngoài protein còn có thành phần non-protein-nhóm ngoại[2]

- Phần protein là”feron” hay ”apoenzyme” có vai trò định tính đặc hiệu của enzyme

- Phần nhóm ngoại là “agon” hay “coenzyme” là bộ phận trực tiếp tham gia vào phản ứng Thường nhóm ngoại là dẫn xuất của các vitamin,các

nucleotide Phần lớn enzyme có dạng cầu hoặc dạng sợi

VD: catalase,xitocrom

3.Phân loại

Loại Enzyme Loại phản ứng được xúc tác

Oxidoreductase Các enzyme này xúc tác các phản ứng

oxi-hoá khử có nghĩa là chúng vận chuyển các nguyên tử Hydro hoặc điện

tử của chúng từ cơ chất của chúng sang các phần tử nhận

chuyển từ cơ chất này sang cơ chất khác Hydrolase Các enzyme này làm gãy đứt các lien kết hoá học bằng phản ứng thủy phân

kết hoá học bằng phản ứng thủy phân

vào cơ chất bằng cách làm gãy nối đôi,nguợc lại nó cũng có thể xúc tác để tạo nối đôi

nguyên tử trong cơ chất,tức là chúng tạo

ra các đồng phân của cùng 1 hợp chất

mới,năng lượng từ ATP sẽ cần cho sự tạo các lien kết hoá học này, Ligase giúp cho sự tổng hợp nên Hydro carbon, protein và các đại phân tử khác

 Oxydoreductaza

Có tác động đến phản ứng oxy hóa khử Có khả năng chuyển e-, H+ …

Phản ứng tổng quát: A- + B  A + B

-Các dạng thông dụng:

- Dehydrogenase: tách H+ Ví dụ: alcol dehydrogenase (1.1.1.1.), glutamate dehydrogenase

- Reductase: tác động khử

- Oxygenase: tác động oxy hóa

- Peroxydase: tác động khi có H2O2, có tác dụng loại khả năng gây độc của

H2O2 trong cơ thể

 Transferase

Có tác động lên phản ứng chuyển nhóm chức Phương trình phản ứng tổng quát:

A – B + C  A + B – C

Các dạng thông dụng:

- Acyltransferase: có nhóm acyl (coenzyme A)

- Glucosyltransferase: chuyển nhóm glucose Enzyme chuyển hóa tinh bột

- Amino transferase: chuyển nhóm amin

- Photpho transferase: ATP  ADP

ATP + AMP  ADP + ADP

 Hydrolase

Có tác động lên phản ứng thủy phân Phương trình phản ứng tổng quát:

A – B + H2O  A – H + B – OH

Các dạng thông dụng:

- Amylase:

• α – amylase: có trong nước bọt, mầm hạt ngũ cốc, nấm, vi khuẩn Có khả năng phân giải 1- 4-glucozit tại vị trí giữa mạch

• ß – amylase: có trong thực vật (hạt củ) Phân giải 1-4 glucozit tại vị trí đầu mạch Bền hơn α – amylase (bền tính acid)

- Peptit hydroláe: có khả năng thủy phân liên kết peptit

- Lipase có khả năng thủy phân lipit Ví dụ triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

 Lyase

Có tác động đến phản ứng nhờ bổ sung nhóm chức vào nối đôi hoặc tạo nối đôi nhờ lấy đi nhóm chức Phương trình phản ứng tổng quát:

AX – BY  A = B + X – Y

Ví dụ: Pyruvat decarboxylase: loại CO2 ra khỏi acid pyruvic tạo thành

acetaldehyde

 Isomerase

Có khả năng chuyển các nhóm chứctrong phân tử tạo thành các đồng phân

Phương trình phản ứng tổng quát: AX – BY  AY - BX

Ví dụ chuyển đổi galactose thành glucose

 Ligase

Có khả năng tổng hợp liên kết C – C, C – S, C – O, C – N nhờ vào phản ứng trùng ngưng liên hợp với sự thủy phân ATP và tác dụng của enzyme

Ví dụ: dưới tác dụng của pyruvat carboxylase, từ acid pyruvit tạo thành

oxaloacetic

3.Tính đặc hiệu của enzyme

Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme Tính đặc hiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme

Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu[3]:

1.Đặc hiệu kiểu phản ứng

Phần nhiều mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng

ấy phải do một enzyme đặc hiệu xúc tác

Ví dụ: amino acid có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase,

aminoacid oxydase và aminotransferase

2 Đặc hiệu cơ chất

Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định Mức

độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme khác nhau không giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức như sau:

- Đặc hiệu tuyệt đối

Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi

Ví dụ: Urease, arginase, glucoseoxydase v.v Đối với các enzyme này, ngoài các cơ chất đặc hiệu của chúng là ure, arginine, - D - Glucose (theo thứ tự tương ứng) chúng cũng có thể phân giải một vài chất khác nhưng với vận tốc thấp hơn nhiều Chẳng hạn như urease, ngoài ure nó còn có thể phân giải hydroxyure nhưng với tốc độ thấp hơn 120 lần

- Đặc hiệu nhóm tuyệt đối

Các enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên

tử ở phần liên kết chịu tác dụng

Ví dụ: maltase thuộc nhóm - glucosidase chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glucoside được tạo thành từ nhóm OH glucoside của - glucose với nhóm

OH của một monose khác

- Đặc hiệu nhóm tương đối

Mức độ đặc hiệu của các enzyme thuộc nhóm này kém hơn nhóm trên Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó

Ví dụ lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este

Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptid

- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể):

Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của

cơ chất

4 Cơ chế của xúc tác enzyme

Hầu như tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa số các chất xúc tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao

Chính nhờ việc tạo được môi trường đặc hiệu (bởi trung tâm hoạt động của enzyme liên kết với cơ chất) có lợi nhất về mật năng lượng để thực hiện phản ứng

mà enzyme có được những khả năng đặc biệt đã nêu trên

Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme - cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất xúc tác thông thường

Quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau[4]:

E + S  ES  P + E Trong đó: E là enzyme

S là cơ chất (Substrate)

ES là phức hợp enzyme - cơ chất,

P là sản phẩm (Product)

- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh

và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp;

- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

5 Các yếu tố ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng enzyme:

a Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

- Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào [E]: v= k.[E]

Trong đó: v- vận tốc phản ứng

[E]- nồng độ cơ chất

- Có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn thì tốc độ phản ứng chậm

b Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Ở nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động chưa liên kết với cơ chất Nên việc tăng hạn chế cơ chất là tăng tốc độ phản ứng Tuy nhiên,

ở nồng độ cơ chất cao, hầu hết các trung tâm phản ứng đã liên kết với cơ chất làm cho số phân tử enzyme trở thành yếu tố giới hạn Khi số phân tử ezyme tăng tốc độ phản ứng cự đại tăng lên tương ứng[5]

c Các chất kìm hãm

Hoạt tính của enzyme bị thay đổi khi có mặt của chất ức chế

 Chất ức chế cạnh tranh

Các chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất Chất ức chế gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzyme cạnh tranh với cơ chất, khiến cho hoạt động xúc tác của enzyme chậm lại Khi chất ức chế được giải phóng hoạt động xúc tác của enzyme trở lại mình thường

Ví dụ: acid malonic hoạt động như chất cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzyme sucxinic dehydrogenase với acid sucxinic Trong điều kiện bình thường,

sucxinic dehydrogenase xúc tác loại hai nguyên tử H của acid sucxinic tạo thành acid fumaric Khi có mặt của acid maloic, enzyme liên kết với trung tâm hoạt động tạo thành phức hợp enzyme – chất ức chế và không thể chuyển hóa được Như vậy làm số lượng trung tâm phản ứng giảm và tốc độ phản ứng cũng giảm theo

 Chất ức chế không cạnh tranh

Chất ức chế không cạnh tranh không gắn vào vị trí xúc tác mà gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzyme Điều này sẽ làm thay đổi cấu hình của vị trí hoạt động không còn phù hợp với cơ chất Vùng mà chất ức chế cạnh tranh gắn vào enzyme gọi là vị trí di lập thể (allosteric site) và gây ra hiệu ứng dị lập thể (allosteric effect) Khi chất ức chế giải phóng, hoạt động xúc tác của enzyme trở lại bình thường

Một số chất kìm hãm gây biến đổi hoạt tính enzyme một cách không thuận

nghịch Chất kìm hãm dạng này làm biến đội liên tục hay phá hủy trung tâm hoạt động của enzyme Phần lớn các chất độc là những chất kìm hãm không thuận nghịch chẳng hạnh như cyanide (CN-) gắn vào cytochrome cản trở việc vận

chuyển điện tử đến O2, penicillin ức chế không thuận nghịch enzyme

transpeptidase của vi khuẩn cản trở tạo vách tế bào

d Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong nước

Ví dụ: Mg++ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất là ATP) Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ

e Nhiệt độ

Mỗi một enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ tối ưu nhất định Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu hoạt động của enzyme giảm và tốc độ phản ứng sẽ giảm theo Sự tăng nhiệt độ làm cho làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn Các phức chất

emzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính Khi cấu hình vị trí xúc tác không còn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm Tần số va chạm giữa chúng thấp> Ít phức hợp enzyme-cơ chất hình thành và tốc độ phản ứng giảm

f PH

Mỗi một enzyme hoạt động tối ưu tại một giới hạn pH thích hợp chẳng hạn

pepsin hoạt động tối ưu ở pH 2, trypsin hoạt động tối ưu ở pH 8.5 Khi pH lệch sang hai bên phía pH tối thích, hoạt tính của enzyme giảm xuống

II.Tổng hợp Penicillin có sử dụng xúc tác sinh học

1 Giới Thiệu Penicillin

- Penicillin là một trong một nhóm kháng sinh thu được từ nấm penicillium hay được điều chế

- Penicillin sát trùng bằng cách giết vi khuẩn và hạn chế sự sinh trưởng của chúng

- Penicillin tiêu diệt nhiều loài vi khuẩn gây bệnh khác nhau như

pneumococci, streptococci, gonococci, meningococci, clostridium và

syphilis spirochete

- Penicillin được sử dụng làm dược phẩm trị các căn bệnh chết người

như viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng máu, gas gangrene, mủ lậu, và sốt vàng

da, giang mai, viêm loét lưỡi cấp

2 Cấu trúc và phân loại penicillin

a Cấu trúc

Penicillin là dẫn xuất của 6-aminopenixilamic gồm 1 vòng thiazolidine và một vòng beta-lactam[6]

Công thức chung của penicillin :

- Khi thay thế H bằng kim loại kiềm hoặc kiềm thổ sẽ được các penicillin dể tan trong nước (như Na, Ca, K,…)

- Vòng becta-lactam là yếu tố quyết định hoạt tính của kháng sinh

- Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau sẽ được các penicillin có tác dụng khác nhau

b Phân loại

Dựa vào nguồn gốc có thêt sắp xếp penicillin vào 3 nhóm[6]:

- Penicillin nhóm I: gồm các penicillin tự nhiên được chiết xuất từ môi trường nuôi cấy nấm penicillium notatum hoặc P chrysogenum như penicillin G hoặc penicillin V

- Penicillin nhóm II: Gồm các dẫn xuất của các penicillin bán tổng hợp có khổ kháng khuẩn hẹp hơn Penicillin G nhưng có khả năng kháng penicillinase dung để chữa bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu kháng penicillin nhóm I như methycylin, cloxaxilin

- Penicillin nhóm III: Gồm các penicillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng được penicilase nhưng kháng được khác vi khuẩn Gram (-) mà các penicillin nhóm II ít tác dụng bền vững trong môi trừng dịch vị nên có thể dùng để uống như ampicillin, amoxicillin

3 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P Chrysogenum

Nhìn cung, có 3 bước chính và quan trọng trong việc sinh tổng hợp ra penicillin

G (benzylpenicillin)[7]:

• Bức thứ nhất là trùng ngưng 3 amino axit—α-aminoadipic axit,

L-cysteine, L-valine thành tripeptit Trước khi trùng ngưng thành tripeptit, amino axit L-valine phải trải qua epimer (đồng phân không gian) hóa để tạo thành D-valine Tripeptit được trùng ngưng được đặt tên là δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine (ACV) Phản ứng trùng ngưng và epimer hóa được xúc tác bởi enzym δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine synthetase (ACVS)