các sản phẩm trung gian và cuối có ích thu ðýợc từ các phản ứng oxi hóa khử sử dụng xúc tác sinh học

Sự chuyển hóa tương tự cũng có thể đạt được bằngcách sử dụng nấm men bánh mì, và lợi ích của việc sử dụng chất xúc tác sinh học cóthể thấy được ngay lập tức ví dụ như thu được cồn chứa c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP HCM

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Môn: CHUYỂN HÓA SINH HỌC VÀ CÁC SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT

THU ĐƯỢC TỪ CÁC PHẢN ỨNG OXI HÓA KHỬ

Mục lục

Trong nhiều phản ứng oxi hóa khử, việc lựa chọn sử dụng toàn bộ tế bào hay enzymetách chiết từ tế bào (với các co-factor cần thiết) cho phản ứng chuyển hóa sinh học làmột điều rất quan trọng Thuận lợi và khó khăn trong việc sử dụng toàn bộ tế bào hayenzyme đã được thảo luận ở chương 2, bảng 2.3.

4.2 Sự khử ketone sử dụng toàn bộ tế bào

Ví dụ dưới đây là một trong những quá trình khử đơn giản nhất của một ketone tạothành cồn bậc 2 Dĩ nhiên quá trình này cũng có thể được tiến hành bằng phương pháphóa học bởi sodium borohydride Sự chuyển hóa tương tự cũng có thể đạt được bằngcách sử dụng nấm men bánh mì, và lợi ích của việc sử dụng chất xúc tác sinh học cóthể thấy được ngay lập tức (ví dụ như thu được cồn chứa cacbon thủ tính ở dạng hoạt

động quang học) Nguyên nhân đơn giản là: sự khử sinh học diễn ra trong hố chọn lọc

đối quang của enzyme Ví dụ, cyclohexyltrifloromethyl ketone dễ dàng bị khử thành

rượu rất hiệu quả Tương tự, ethyl-3-oxobutanoate tạo ra 3(S)-hydroxybutanoate với sựchọn lọc rất cao khi sử dụng cùng chất xúc tác sinh học (sơ đồ 4.1)

Sơ đồ 4.1

Nấm men bánh mì cũng được sử dụng để khử những hợp chất có 2 nhóm carbonyl, như

là chất phái sinh của cyclopentane-1,3-dione Nếu nguyên tử carbon nằm giữa hainhóm carbonyl mang 2 nhóm thế khác nhau thì chất đó sẽ thường được chuyển hóa ởhiệu suất rất cao và tạo ra sản phẩm là hợp chất có 2 carbon thủ tính (sơ đồ 4.2)

Sơ đồ 4.2

Nếu ketone hoặc ester của ketone ban đầu đã có trước một carbon thủ tính, thì sau đó

sự khử bất đối xứng của hỗn hợp 2 đồng phân quang học ban đầu có thể cho sản phẩm

là một hỗn hợp mà trong đó đồng phân không đối quang nhiều hơn Ngoài ra, cả 2đồng phân đối quang của chất phản ứng có thể bị khử cho ra một hỗn hợp đẳng molcủa 2 đồng phân không đối quang (sơ đồ 4.3)

Sơ đồ 4.3

Kết quả của một quá trình khử xúc tác bằng nấm men của một ketone có thể dự doántrước một cách tương đối chắc chắn Ví dụ như dialkyl hay aralkyl ketone thì sản phẩmthu được hầu như luôn luôn là (S)- alcohol (Hình 4.1)

Trong khi quá trình khử B-ketoester bằng nấm men thì kết quả khó đoán trước hơn (sơ

đồ 4.4), kết quả có thể được dự đoán dựa vào mô hình đơn giản (Hình 4.2)

Sơ đồ 4.4

Và sẽ còn phụ thuộc vào nhóm thế methyl hay lượng acid acetic còn lại là thuộc loạinhóm thế nào (CH3: nhỏ; CH2COOC2H5: trung bình; ClCH2, BrCH2: lớn;CH2COOC8H17: rất lớn)

Quá trình khử cetoester có 2 nhóm thế xúc tác bởi nấm men thường làm phát sinh cácđồng phân không đối quang, và sản phẩm mới tạo thành tất cả đều có cacbon thủ tánhcấu hình dạng S Tỉ lệ của đồng phân không đối quang thường không phải là 50:50, doquá trình enol hóa, sự racemic hóa trong cơ thể vi sinh vật, sự khử nhiều hơn của một

đồng phân không đối quang, dẫn tới sự ưu thế hơn của một trong các đồng phân lập thể(sơ đồ 4.5)

Nấm men có sẵn rất nhiều trong tự nhiên và việc dễ dàng sử dụng toàn bộ tế bào nấmmen trong quá trình khử là 2 đặc điểm thu hút của những quá trình này Một số sinh vậtkhác có thể được sử dụng để khử kentone thành alcol bậc 2 Một số nấm (nhưMortierella isabellina) cho các kết quả nhiều đồng phân hóa học lập thể, giống với nấmmen, trong khi một số khác (Aspergillus niger) cho sản phẩm đồng phân lập thể ngượclại với dạng được hình thành do quá trình khử của nấm men (sơ đồ 4.6)

Cái cần phải quan tâm là số lượng lớn của (3) có thể thu được từ một số lượng lớn visinh vật được chứa trong polyhydroxybutyrate Polymer được chuyển thành monoestertrong ống nghiệm, sử dụng acid sulfuric trong điều kiện có mặt alcol

4.3 Sự khử liên kết đôi C=C

Nấm men và một số ít vi sinh vật khác được sử dụng để khử liên kết đôi C=C Các liênkết đôi rất nhạy cảm với các nhóm hút electron (electron-withdrawing) Vì vậy các acidchưa bão hòa (có liên kết đôi) có thể bị chuyển hóa thành hợp chất có 4 nhóm thế khácnhau với hoạt động quang học cao Chú ý rằng cấu hình của liên kết alken có thể xácđịnh cấu hình của Carbon thủ tánh vừa mới hình thành (phương trình 4.7)

Trong quá trình khử các rượu có liên kết đôi có sự tạo thành các aldehyde không bãohòa là các sản phẩm trung gian không được nhìn thấy Một ví dụ đó là geraniol bị khửthành (R)-citronellol thông qua các aldehyde tương ứng (phương trình 4.8)

Một phái sinh của cyclohexane-1,4-dione, là chất được sử dụng trong tổng hợp nhiềucarotenoid tự nhiên hiện nay, được tạo thành bằng sự khử của hợp chất en-dion tươngứng (phương trình 4.9)

TÌM HIỂU THÊM

e.e Lượng thừa đối phân là hiệu số giữa tỉ lệ phần trăm các đồng phân trong sản phẩm

(tổng các đồng phân được xem là 100%)

Phản ứng chọn lọc lập thể (stereoselectivity) là các phản ứng mà một chất ban đầutrong những điều kiện xác đinh có thể cho nhiều sản phẩm nhưng thường có một sảnphẩm ưu tiên Bất kỳ một phản ứng nào chỉ có một sản phẩm hình thành duy nhất hay

ưu tiên hơn một sản phẩm nào đó gọi là phản ứng chọn lọc lập thể

Hoạt động quang học: khả năng quay mặt phẳng dao động của ánh sáng Hoạt độngquang học càng cao thì làm quay mặt phẳng dao động của ánh sáng càng nhiều (Hình)

Electron-withdrawing là các nhóm có khả năng rút elecctron đi từ một trung tâm phảnứng Ví dụ electron-withdrawing: halogens (F, Cl); nitriles CN; carbonyls RCOR'; nitrogroups NO2

4.4 Sự khử ketone và các hợp chất carbonyl (α, β không no) sử dụng các enzyme

Tất cả các phản ứng sinh học được nêu trong chương này đòi hỏi sự tham gia của các tếbào nguyên vẹn (thường là nấm men) Enzyme dehydrogenas xúc tác phản ứng chuyểnhóa ketone thành alcohol thứ cấp có thể dễ dàng được tinh sạch Những enzyme này cóthể được thu nhận từ vi sinh vật, hoặc bộ phận của động vật Trong quá trình tinh sạch,đòi hỏi các co-factor, NAD(P) được tạo ra từ protein Để khôi phục hoạt tính xúc táccủa enzyme, các co-factor phải được tái tạo Điều đó là bất khả thi nếu sử dụng một hệ

số tỷ lượng lượng co-factor, bởi một vài lý do, mà lý do chính là bởi giá thành cao củaNAD(P) Do đó, phải giảm lượng co-factor sử dụng và cần có sự tái tạo lại co-factor(hình 4.3)

Hình 4.3 Tái tạo NAD(P)H trong phản ứng khử xúc tác enzyme

Câu hỏi về cách thức tái tạo co-factor đã được đặt ra bởi nhiều nhà khoa học và một vàigiải pháp đã được tìm ra Một trong những giải pháp đó được trình bày ở hình 4.4, đặc

trưng bởi nhóm đầu hoạt động của co-factor (woking head-group), hình vẽ mô tả việc

sử dụng một loại enzyme thứ hai, formate dehydrogenase, enzyme này giúp co-factortrở về dạng khử, giải phóng CO2.

Hình 4.4 Vai trò của NAD(P)H trong phản ứng khử xúc tác dehydrogenase

Phương pháp để tăng hiệu suất phản ứng đó là thêm vào 1 lượng lớn các alcohol phân

tử lượng thấp ví dụ ethanol hoặc isopropanol và cho phép dehydrogenase xúc tác cả haiphản ứng (Hình 4.5) Dehydrogenase minh họa cho TBAD - enzyme được phân lập từ

vi sinh vật sống gần dòng chảy núi lửa; trong sinh vật, ở điều kiện bắt buộc, enzymenày có hoạt tính ổn định ở nhiệt độ 800C hoặc cao hơn

Hình 4.5 Sự tái tạo NADPH nhờ isopropanol

Việc sử dụng các enzyme tinh sạch với các co-factor cần thiết là một trong những hạnchế chính của việc sử dụng hệ thống toàn bộ tế bào, cần tránh các phản ứng phụ xảy ra(xem phần 2.3.5) Vì thế các tế bào nấm men chứa enzyme xúc tác quá trình thủy phân,oxi hóa/khử, và các phản ứng khác Các enzyme dehydrogenase chỉ xúc tác cho cácquá trình oxi hóa –khử Hình 4.6 là yeast alcohol dehydrogenase (YAD),

Thermoanaerobium brocki alcohol dehydrogenase (TBAD), và horse liver alcohol

dehydrogenase (HLAD) bổ sung lẫn nhau về mặt kích thước được ưu tiên của cơ chất

Các ketone cao phân tử được xử lý tốt nhất bằng 3α,20β- hydroxysteroid alcohol

dehydrogenase (HSAD)

Hình 4.6 Dãy cơ chất trong bốn enzyme dehydrogenase.

Hình 4.7 Một số chu trình khử ketone

HLAD đã được nghiên cứu chi tiết Cơ chế sự khử tuân theo quy luật Prelog và một

mô hình vị trí hoạt động của enzyme đã được đề xuất, cho thấy các vùng được ưu tiên

và bị cấm ở các cơ chất tiềm năng (hình 4.7) Vì thế 2(S)-alkylcyclohexanone, là sản

phẩm trans (6) thu được trong khi phức hợp 2(R ) thì trơ Ngược lại, hỗn hợp racemic

của thiaketone cho 2 diastereoisomeric alcohol bằng sự khử của các đồng phân thôngqua thể cấu tạo phù hợp nhất

TBAD cho thấy tính chọn lọc tương tự lên cơ chất hơn các ketone đơn giản Giống nhưHLAD, enzyme này có thể biểu thị sự tổng hợp tâm bất đối xứng trong sự khử racemicketone, nơi mà các đồng phân đối hình không phù hợp với vị trí hoạt động của cácenzyme Do đó các ketone (8) sản sinh alcohol có hoạt tính quang học (9) và phục hồi,các ketone có hoạt tính quang học Như dự đoán, TBAD không có khả năng khử cácketones lập thể dày đặc (10) Tuy nhiên, HSAD xúc tác cho sự khử, cung cấp cácalcohol (>95% e.e) [lưu ý cấu hình (S) ở trung tâm bất đối xứng mới được thành lập.(Sơ đồ 4.12)

Sơ đồ 4.12

Tầm quan trọng của việc giải quyết những loại hợp chất bicyclic (9) và (11) là do thực

tế cho thấy rằng chúng có thể được biến đổi bởi những quy trình hóa học truyền thốnggồm nhiều giai đoạn để thành các hợp chất có hoạt tính sinh học và pheromone (ví dụnhư eldanolide), hợp chất tương lai có thể dùng để kiểm soát dịch hại (Hình 4.8)

Hình 4.8

Các loại enzyme khác, như enoate reductases, khử các ester không no α,β, cácaldehyde,.v.v… Những enzyme này đã được tinh sạch, và một vài biến đổi ấn tượng đãđược ghi nhận (Sơ đồ 4.13) Tuy nhiên, sự tái tạo co-factor và sự ổn đinh hoạt tínhenzyme vẫn đang là những vấn đề cần quan tâm, và dạng chuyển hóa sinh học này vẫnchưa thể sử dụng ở những quy mô lớn với những người chưa có kinh nghiệm

Sơ đồ 4.13

4.5 Sự oxy hóa alcohol thành aldehyde hoặc ketone

Sự oxy hóa alcohol thành aldehyde hoặc ketone Không được sử dụng nhiều như sự oxyhóa hóa học thông thường do sự oxy hóa thường loại bỏ trung tâm bất đối xứng khỏi

cơ chất và sự tái tạo co-factor NAD(P)+ dạng oxy hóa thường rất khó nếu sử dụng tếbào, do nó chỉ được thực hiện ở một vài loại tế bào chuyên biệt NAD+ là mộtcoenzyme mang các electron bên trong tế bào Tuy nhiên, vài ví dụ mà sử dụng chuyểnhóa sinh học có lợi hơn như: polyol D-sorbitol bị oxy hóa thành L-sorbose bởi vi khuẩn

Acetobacter suboxydans thông qua quá trình lên men (hình 4.14), L-sorbose là chất

dùng để sản xuất acid ascorbic (vitamin C) Galactose oxidase oxy hóa xylitol thành(L)-xylose nhờ HLAD xúc tác (hình 4.15) Quy trình hóa học để sản xuất xylitolthương mại được phát triển vào năm 1970 tại Phần Lan Kể từ đó, sản xuất xylitol nhờ

vi sinh vật đã được nghiên cứu như một giải pháp thay thế cho quy trình hóa học

Nghiên cứu đã cung cấp những thông tin mới về sự cân bằng oxy hóa - khử ở chủng S.

cerevisiae và Candida, việc sử dụng nguồn cơ chất carbon không ưu tiên Xylitol là

một loại đường hiếm, tồn tại với lượng thấp trong tự nhiên Xylitol có thể được sảnxuất công nghiệp bằng sự khử hóa học đường D-xylose tinh khiết với hiệu suất 50-60%(bằng sáng chế Phần Lan No.589.388) Mặc dù hiệu suất khử xylitol bằng vi sinh vật

có thể được tăng lên bằng các phương pháp sản xuất khác nhau (vd: sản xuất fed-batchlặp lại (Kwon et al 2006; Granström 2002)) thì sự khử hóa học vẫn chiếm ưu thế hơn ởquy mô sản xuất công nghiệp Các phản ứng thủy phân trong quá trình khử bằng visinh vật được xem là một lợi thế Có thể tinh sạch các loại đường hemicellulose khácnhau và sử dụng chúng như một nguồn nguyên liệu thô cho các chuyển hóa sinh hóa ởquy mô công nghiệp Để sản xuất các loại đường hiếm khác ở quy mô công nghiệp thìxylitol là nguồn nguyên liệu tương đối rẻ tiền Mặt khác, xylitol là một polyol đồngphân quang học bất hoạt nên có thể chuyển từ cấu hình dạng D sang L (ví dụ: D-xylosesang L-arabinose) L-xylulose và L-ribulose được sản xuất từ xylitol, cũng là nhữngnguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất nhiều phân tử đường nhánh khác, mà có thểứng dụng để sản xuất thuốc kháng virus trong tương lai

Sơ đồ 4.15 Sự chuyển đổi từ Xylitol sang (L)-xylose nhờ enzyme galactose oxidase

Sơ đồ 4.14 D-Sorbitol bị oxy hóa thành L-Sorbose bởi lên men nhờ A suboxydans

Hình: Sơ đồ sản xuất đường hiếm từ D-Xylose

Theo sơ đồ trên, xylitol bị oxy hóa thành L-xylulose nhờ xylitol dehydrogenase; tiếptheo, L-xylulose chuyển thành L-lyxose hoặc L-xylose bởi L-rhamnose isomerase

(Granström et al 2005) Enzyme L-rhamnose isomerase từ Pseudomonas stutzeri đã

xúc tác chuyển đổi các dạng đồng phân giữa L-rhamnose và L-rhamnulose, L-mannose

và L-fructose, D-allose và D-psicose, D-gulose và D-sorbose, L-talose và L-tagatose,D-ribosevà D-ribulose (Leang et al 2004) Tiếp theo, L-xylulose chuyển đổi thành L-ribulose nhờ enzyme D-tagatose 3-epimerase (Itoh et al., 1994), cuối cùng, chuyểnthành L-arabinose bởi L-arabinose isomerase (Izumori et al 1997) Cácpentoketuloses, ví dụ: L-xylulose và L-ribulose, có thể là tiền thân cho một số chuyểnhóa trung gian tạo thành aldopentoses, ketopentoses hoặc pentitols (Granström etal.2004)

4.6 Oxy hóa ketone thành ester và lactone

Nhiều loại ester được xem là những hợp chất có hương thơm tự nhiên quan trọng, đượcdùng làm dung môi, chất trung gian hóa học Tổng hợp sinh học ester từ Acyl-CoA nhờ

vi sinh vật Chất thơm họ lactone phổ biến trong các loại thực phẩm và đồ uống, chúng

có thể sản xuất thông qua con đường chuyển hóa các acid béo thông qua quá trình traođổi chất của tế bào nấm men Một số ví dụ: Gamma-butyrolactone (oxolan-2-one) sản

xuất từ các chủng Streptomyces, có mùi bơ, có thể dùng làm chất tạo mùi hoặc dung dịch tẩy rửa; sản xuất g-decalactone từ Pichia, Aspergillus, Cladosporium,…nhờ

enzyme acyl-CoA-oxidase (Aox)

Sự chuyển đổi một ketone acyclic thành một ester hay một ketone mạch vòng thànhmột lactone thông qua phản ứng Baeyer – Villiger và có thể được thực hiện bằngphương pháp hóa học sử dụng peracid (hình 1,2) Phản ứng Baeyer – Villiger xảy ra

khi cho aldehid hay ketone tác dụng với peracid trong môi trường acid, có sự gắn thêmnguyên tử ôxy vào vị trí giữa nhóm carbonil và nhóm alkil hay aril của aldehid hoặcketone, cho sản phẩm là ester.

Sự so sánh giữa các phương pháp hóa học và sinh học đã được ghi nhận rằng sự oxyhóa peracid của dẫn xuất cyclobutanone tạo ra hỗn hợp các đồng phân lactone có tính

triền quang Ngược lại, trong sự oxy hóa của vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus tạo

ra số lượng bằng nhau của hai lactones, mỗi loại có hoạt tính quang học thuần nhất(>95% e.e.)

Hình 1: phản ứng Baeyer-Villiger

Hình 2: phản ứng Baeyer-Villiger xúc tác bởi Mono-oxygenase

Sử dụng vi khuẩn cho các phản ứng này có thể có nhiều khó khăn, có thể thấy ở sựchuyển đổi sinh học của lactone Do đó, enzyme mono-oxygenase tinh sạch cócoenzyme là NADPH được sử dụng Tuy nhiên, hạn chế của hướng tiếp cận này là sựcần thiết để tái tạo các coenzyme Để giải quyết vấn đề này, enzyme dehydrogenase vàenzyme mono-oxygenase được sử dụng, đồng thời cho ra sản phẩm phụ là H2O giúpđơn giản quá trình tinh sạch sản phẩm.

4.7 Sự hydroxyl hóa của hợp chất béo và thơm

Sự hydroxyl hóa hợp chất béo bởi vi sinh vật có thể ảnh hưởng đến chức năng củanhững phân tử tại những vị trí cách xa các nhóm chức tồn tại từ trước Nhiều phản ứngtại các vị trí bất hoạt trong phân tử chất béo và thơm khó thực hiện bằng các phươngpháp hóa học thông thường Khá nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực này liên quan đếnchức năng của các steroid, và các vi sinh vật có khả năng oxy hóa ở hầu hết các vị tríkhông hoạt động của phân tử steroid

Ví dụ: các nhà nghiên cứu đã khám phá ra một phương pháp hydroxyl hóa vi trí 11 củacác vòng tetracyclic