XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG VIÊN CHỨA METFORMIN HYDROCLORID 500MG PHÓNG THÍCH KÉO DÀI VÀ SITAGLIPTIN 50MG PHÓNG THÍCH TỨC THỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Nguyễn Ngọc Nhã T[.]
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG VIÊN CHỨA METFORMIN HYDROCLORID 500MG PHĨNG THÍCH KÉO DÀI VÀ SITAGLIPTIN 50MG PHĨNG THÍCH TỨC THỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Nguyễn Ngọc Nhã Thảo1*, Nguyễn Ngọc Phương Vy1, Trịnh Thị Thu Loan2, Nguyễn Đức Tuấn2 Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh *Email: nnnthao@ctump.edu.vn TĨM TẮT Đặt vấn đề: Thuốc trị đái tháo đường kết hợp metformin hydroclorid 500mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50mg phóng thích tức thời nghiên cứu bào chế thành công [2] Xây dựng phương pháp xác định giới hạn tạp chất liên quan để hoàn thiện tiêu chất lượng cho chế phẩm điều cần thiết Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan chế phẩm chứa metformin hydroclorid 500mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50mg phóng thích tức thời Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Chế phẩm nghiên cứu xác định giới hạn tạp chất liên quan phương pháp HPLC theo quy trình: 01 quy trình xác định giới hạn tạp chất 1cyanoguanidin metformin theo tiêu chuẩn quy định Dược điển Việt Nam V [1]; 01 quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan sitagliptin theo quy định Dược điển Mỹ 41[3] Kết quả: Xác định quy trình xác định giới hạn tạp chất 1-cyanoguanidin metformin phương pháp HPLC với điều kiện: hệ thống sắc ký HPLC CM 5000 (chromaster-Hitachi), đầu dò DAD5453, cột Purospher ® STAR (RP-C8 5μm), pha động ACN-đệm (30:70), bước sóng phát 210nm, tốc độ dịng 0,7mL/phút; thể tích tiêm mẫu 20μl Xác định tạp sitagliptin theo Dược điển Mỹ 41: Cột Discovery® Cyano (150 x 4,6nm, 5μm), Pha động: ACN-đệm (15:85, tt/tt), Tốc độ dòng: mL/phút, Thể tích tiêm mẫu: 20μl, Nhiệt độ cột: 300C, Bước sóng phát hiện: 205nm Kết luận: Quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan đạt yêu cầu quy trình phân tích, áp dụng để xác định giới hạn tạp chất liên quan cho chế phẩm nghiên cứu Từ khóa: metformin hydroclorid, sitagliptin, tạp chất liên quan, phóng thích kéo dài ABSTRACT DEVELOPMENT OF AN ANALYTICAL METHOD FOR RELATED COMPOUNDS IN TABLET FORMULATION CONTAINING METFORMIN HYDROCLORID 500 MG EXTENDED RELEASE AND SITAGLIPTIN 50 MG IMMIDIATE RELEASE BY HPLC Nguyen Ngoc Nha Thao1, Nguyen Ngoc Phuong Vy1, Trịnh Thị Thu Loan2, Nguyen Duc Tuan2 Can Tho University of Medicine and Pharmacy Ho Chi Minh City University of Medicine and Pharmacy *Email: nnnthao@ctump.edu.vn Background: Fixed-dose combination tablet containing metformin hydroclorid extended release (500mg) and sitagliptin immediate release (50mg) was successfully formulated [2] To fulfill the specification for product, impurities standard is necessary Objectives: Develop the analytical method for related compounds in tablet formulation containing metformin hydroclorid 500mg extended release and sitagliptin 50mg immidiate release Materials and methods: Constructing suitable procedures: for 1-cyanoguanidin impurity of metformin meet the Viet Nam Pharmacopoeia V standard [1]; for impurities of sitagliptin base on United States Pharmacopoeia 41 [3] Results: For 1-cyanoguanidin, the chromatographic separation was achieved on HPLC 5000 (chromaster-Hitachi), DAD detector 5453, Purospher ® STAR (RP – C8 5μm) column using a buffer pH 4,5 and acetonitrile as organic solvent 70:30 in a isocratic program The flow rate was 0.7mL.min−1 and the detection wavelength was 210m For impurities of sitagliptin, using Discovery ® Cyano (150 x 4,6nm, 5μm) column with a solvent consisting of 1,36g posstasium dihydrogen phosphate in L water (pH adjusted to 2.0 with phosphoric acid) and acetonitrile as organic solvent 85:15 in a isocratic program The flow rate was 1mL.min−1 and the detection wavelength was 205nm Conclusion: The methods have found to be specific and meet the system suitability for the detection of the product’s impurities This method is suitable for routine analysis and quality control of pharmaceuticals Keywords: metformin hydrocloride, sitagliptin, related compound, extended release I ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc trị đái tháo đường kết hợp metformin hydroclorid 500mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50mg phóng thích tức thời giúp kiểm sốt đường huyết hiệu quả, tác dụng không mong muốn tăng cân hay hạ đường huyết mức Sản phẩm nghiên cứu bào chế thành cơng Để hồn thiện tiêu chất lượng cho sản phẩm nghiên cứu Vấn đề xây dựng phương pháp xác định giới hạn tạp chất liên quan cho chế phẩm đặt để phục vụ cho việc đăng ký thuốc đồng thời giúp kiểm soát chất lượng thuốc tốt Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan viên chứa metformin hydroclorid 500mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50mg phóng thích tức thời phương pháp HPLC” thực cần thiết Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan sitagliptin chế phẩm nghiên cứu phương pháp HPLC II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng Viên lớp bao phim chứa metformin hydroclorid 500 mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50mg phóng thích tức thời Nguyên vật liệu thiết bị Nguyên liệu: Các hóa chất, dung mơi đạt tiêu chuẩn dược dụng tinh khiết Acetonitril methanol (Merck) đạt tiêu chuẩn HPLC Chất chuẩn metformin hydroclorid-số lô QT.16806016 Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM cung cấp Chất chuẩn sitagliptin phosphat-số lô Y0001812 1-cyanoguanidin-số lô WS.0117331.01 Sigma Aldrich cung cấp Hàm lượng nguyên trạng 99,41%, 99,15% 99,04% Thiết bị: Bể siêu âm BRANSON 5510, Cân phân tích Metter Toledo (4 số lẻ), Cân phân tích Metter Toledo (5 số lẻ), Hệ thống máy HPLC CM 5000 (Chromaster-Hitachi) gồm: Bơm 5110 Bộ phận tiêm mẫu tự động 5210 Buồng ổn nhiệt 5310 Đầu dò dãy diod quang 5430, Máy lọc nước siêu Milli – Q, Máy ly tâm Table Top Centrifuge, Máy đo pH Metter Toledo, Tủ sấy Phƣơng pháp nghiên cứu Thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid sitagliptin chế phẩm phương pháp HPLC Quy trình thử giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid sitagliptin tham khảo chuyên luận viên nén metformin hydroclorid dược điển Việt Nam V chuyên luận viên nén sitagliptin USP 41 Chuẩn bị mẫu xác định xác định giới hạn tạp chất metformin Dung dịch chuẩn 1-cyanoguanidin: Hút xác 10mL dung dịch chuẩn gốc 1cyanoguanidin 5mg/mL cho vào bình định mức 100mL, thêm pha động vừa đủ 100ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm Dung dịch thử: Gỡ bỏ lớp bao phim, tách lớp viên nhân (thực 10 viên), nghiền lớp chứa metformin hydroclorid cho mịn đều, khuấy lượng bột viên tương ứng với 2,5g metformin hydroclorid với 200,0mL nước với tốc độ 2000 vòng/phút 10 giây, thực lặp lại lần, sau nghỉ phút, thực thêm chu kỳ, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút, hút 40,0mL dịch ly tâm, cho vào bình định mức 100mL, thêm pha động vừa đủ 100mL, lọc qua màng lọc 0,45 µm Hút xác 10mL dịch lọc, cho vào bình định mức 100mL, thêm pha động vừa đủ 100mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm Hàm lượng % tạp 1-cyanoguanidin so với metformin hydroclorid tính theo cơng thức: (ru/rs) x a × C% x 10-3 Trong đó: ru: Diện tích pic 1-cyanoguanidin mẫu thử; rs : Diện tích pic 1-cyanoguanidin mẫu chuẩn; a : Lượng cân 1-cyanoguanidin chuẩn (mg); C%: Độ tinh khiết chuẩn Yêu cầu: Giới hạn cho phép tạp 1cyanoguanidin không 0,02% Chuẩn bị mẫu xác định thử giới hạn tạp chất sitagliptin Dung dịch chuẩn sitagliptin phosphat: Pha dung dịch chuẩn 0,0002mg/mL, Dung dịch thử: Gỡ bỏ lớp bao phim, tách lớp viên nhân (thực 10 viên), nghiền lớp chứa sitagliptin cho mịn đều, cân lượng bột thuốc tương ứng 50mg sitagliptin, cho vào bình định mức 50mL, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ 50mL, lắc đều, khuấy kỹ Lấy 8,0mL dung dịch cho vào bình định mức 100mL, thêm dung mơi pha mẫu vừa đủ tới vạch, trộn đều, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút, lấy dịch ly tâm, lọc qua màng lọc 0,45µm Dung dịch thử độ nhạy: Dung dịch chuẩn 0,0001mg/mL Dung dịch kiểm tra tính phù hợp hệ thống: Cân 10mg chuẩn sitagliptin phosphat 1mg natri stearyl fumarat vào lọ phù hợp, thêm 1mL nước, đậy kín, sấy 80 oC 30 để tạo sản phẩm cộng fumarat sitagliptin, chuyển hết dung dịch lọ vào bình định mức 100mL, bổ sung thể tích vừa đủ, khuấy kỹ giờ, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút, lấy dịch ly tâm, lọc qua màng lọc 0,45µm Tiến hành sắc ký dung dịch thử độ nhạy u cầu: Tỷ lệ tín hiệu/ nhiễu khơng nhỏ 10 Tiến hành sắc ký dung dịch kiểm tra tính phù hợp hệ thống Yêu cầu: Độ phân giải pic sitagliptin sản phẩm cộng fumarat sitagliptin không nhỏ 1,5 Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn, dung dịch thử ghi lại sắc ký đồ Hàm lượng phần trăm tạp chất viên tính theo cơng thức: (ru/rs) × (Cs/Cu) × (1/F) × (Mr1/Mr2) × 100 Trong đó: ru : Diện tích pic tạp chất mẫu thử; rs : Diện tích pic sitagliptin mẫu chuẩn; Cs : Nồng độ sitagliptin phosphat dung dịch chuẩn (mg/mL); Cu : Nồng độ sitagliptin phosphat dung dịch thử (mg/mL); F: Hệ số đáp ứng; Mr1: Trọng lượng phân tử sitagliptin (407,32); Mr2: Trọng lượng phân tử sitagliptin phosphat (505,31) Yêu cầu: Các tạp acid sitagliptin (F = 0,65), sitagliptin fumarat (F = 1,0), sitagliptin triazecine analog (F = 1,0), sitagliptin styrylacetyl analog (F = 1,0), sitagliptin phenylcrotonyl analog (F = 2,1) có giới hạn cho phép không 0,2% Tổng tạp không 0,6% III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất 1-cyanoguanidin metformin Kiểm tra tính phù hợp hệ thống Tính phù hợp hệ thống kiểm tra cách tiêm lần liên tiếp dung dịch chuẩn metformin hydroclorid 1-cyanoguanidin Kết trình bày Bảng Bảng Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống phương pháp mẫu chuẩn (n=6) Hoạt chất 1-cyanoguanidin Giá trị thống kê Trung bình RSD tR (phút) 3,27 0,20% S (V x giây) 246.836 0,87% Nbk 2.529 0,43% AS 0,93 - Rs 4,97 - tR: thời gian lưu, S: diện tích đỉnh, Nbk: số đĩa lý thuyết biểu kiến, As: hệ số đối xứng, Rs: độ phân giải Nhận xét: RSD thông số sắc ký tR, S, Nbk pic 1-cyanoguanidin mẫu chuẩn < 2%, hệ số đối xứng pic 1-cyanoguanidin nằm khoảng 0,8 – 1,5 Độ phân giải 1-cyanoguanidin metformin lớn 1,5 Như vậy, quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan metformin đạt tính phù hợp hệ thống Tính chọn lọc metformin 1-cyanoguanidin Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc quy trình xác định tạp chất liên quan 1cyanoguanidin metformin: (1) mẫu pha động, (2) mẫu placebo, (3) mẫu chuẩn 1cyanoguanidin (4) mẫu chuẩn metformin HCl, (5) mẫu hỗn hợp chuẩn 1-cyanoguanidin metformin HCl, (6) mẫu thử Hình 3: Sắc ký đồ mẫu viên giả dược chứa 0,1 mg 1-cyanoguanidin chuẩn Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu giả dược mẫu trắng khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic 1-cyanoguanidin sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử không xuất pic 1-cyanoguanidin mẫu viên giả dược có chứa chuẩn 1-cyanoguanidin xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu 1cyanoguanidin sắc ký đồ mẫu chuẩn (Hình 3) Pic tách hoàn toàn pic khác Phổ UV thời gian lưu pic giống với phổ UV thời gian lưu 1-cyanoguanidin Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic tinh khiết (theo phổ UV) (Hình 4) Như quy trình có tính chọn lọc Hình 4: Phổ UV thời gian lưu 1-cyanoguanidin mẫu chuẩn mẫu giả dược chứa 1-cyanoguanidin hình minh họa độ tinh khiết pic 1-cyanoguanidin Giới hạn phát Từ dung dịch chuẩn 1-cyanoguanidin, pha lỗng dần đến tỷ lệ tín hiệu thu gấp khoảng lần độ nhiễu đường Tiến hành sắc ký lần dung dịch thu được, ghi lại sắc ký đồ xác định RSD diện tích pic Kết cho thấy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,03 µg/mL cho đáp ứng pic gấp khoảng lần độ nhiễu đường Kết độ lặp lại diện tích pic dung dịch 1cyanoguanidin có nồng độ mức giới hạn phát ghi bảng Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp LOD (n=6) Hoạt chất 1-cyanoguanidin Giá trị thống kê Trung bình RSD tR (phút) 3,23 0,1% S (V x giây) 564 7,6% Nbk 2.563 0,4% AS 0,8 - Rs 0,0 - tR: thời gian lưu, S: diện tích đỉnh, Nbk: số đĩa lý thuyết biểu kiến, As: hệ số đối xứng, Rs: độ phân giải Hình 5: Sắc ký đồ mẫu trắng (1) mẫu chuẩn 1-cyanoguanidin pha loãng đến nồng độ 0,03 μg/mL (2) Kết luận: Quy trình xác định giới hạn tạp chất 1-cyanoguanidin metformin HCl đạt tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc với LOD 0,03µg/mL Kết thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất sitagliptin Tiến hành sắc ký mẫu thử độ nhạy, mẫu kiểm tra tính phù hợp hệ thống ghi lại sắc ký đồ (Hình Hình 7.) Sitagliptin fumarat Sitagliptin Hình 6: Sắc ký đồ dung dịch kiểm tra tính phù hợp hệ thống Sitagliptin Hình 7: Sắc ký đồ dung dịch thử độ nhạy Bảng Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống quy trình xác định giới hạn tạp chất sitagliptin Mẫu Độ phân giải pic sitagliptin 2,54 pic sitagliptin fumarat Tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) 26,35 pic sitagliptin TB RSD 2,48 2,49 2,61 2,49 2,52 2,52 1,76% 27,55 26,51 27,83 26,97 27,13 27,06 1,94% Nhận xét: Mẫu thử độ nhạy có tỷ lệ tín hiệu/ nhiễu 27,06 > 10 nên đạt yêu cầu độ nhạy Mẫu kiểm tra tính phù hợp hệ thống có độ phân giải pic sitagliptin pic sitagliptin fumarat lớn 1,5 nên đạt yêu cầu tính phù hợp hệ thống Kết kiểm tra tính chọn lọc thể Hình Hình [a] [b] [c] [d] [e] Hình 8: Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc quy trình xác định tạp chất liên quan sitagliptin: (a) pha động, (b) dung môi pha mẫu, (c) giả dược, (d) chuẩn sitagliptin, (e) thử Hình 9: Phổ UV thời gian lưu sitagliptin mẫu chuẩn thử (A) biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic sitagliptin mẫu thử (B) Nhận xét: Các pic sắc ký đồ tách hoàn toàn Trên sắc ký đồ mẫu giả dược mẫu trắng không xuất pic Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu sitagliptin sắc ký đồ mẫu chuẩn Mẫu thử khơng xuất pic có thời gian lưu tương đối 0,55; 1,0; 1,2; 1,8; 4,1 4,7 so với pic sitagliptin Pic sitagliptin mẫu thử tinh khiết (theo phổ UV) Như quy trình xác định tạp chất liên quan sitagliptin có tính chọn lọc Kết luận: Quy trình xác định giới hạn tạp chất sitagliptin đạt tính phù hợp hệ thống, độ nhạy có tính chọn lọc IV BÀN LUẬN Việc xác định giới hạn tạp chất liên quan áp dụng riêng cho hoạt chất quy định tạp chất liên quan metformin dựa quy định Dược điển Việt Nam V [1] tạp chất liên quan sitagliptin dựa quy định Dược điển Mỹ 41 [4] Kết xây dựng quy trình cho thấy giới hạn phát đạt gần với nghiên cứu Victor David (2005) [3] khoảng 0,03µg/mL 1-cyanoguanidin So với Dược điển Việt Nam V mẫu thử xây dựng pha loãng 10 lần giúp giảm áp lực cột mà đáp ứng yêu cầu độ nhạy mà Dược điển đặt Việc ảnh hưởng lớp hoạt chất cịn lại lên quy trình phân tích lớp hoạt chất cần xác định khảo sát cho thấy quy trình xác định có tính chọn lọc có diện lớp hoạt chất cịn lại Việc thực quy trình xác định tạp chất liên quan sitagliptin theo yêu cầu Dược điển Mỹ 41 kết cho thấy quy trình đạt tính tương thích hệ thống độ nhạy quy định V KẾT LUẬN Đề tài xây dựng quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan 1-cyanoguanidin metformin hydroclorid quy trình xác định tạp chất liên quan sitagliptin phương pháp HPLC đạt yêu cầu tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc, đạt u cầu độ nhạy Quy trình áp dụng để xác định giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid sitagliptin chế phẩm viên lớp bao phim nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2017), “Chuyên luận Viên nén Metformin”, Dược Điển Việt Nam V, Nxb Y Học, Hà Nội, tr 623 - 624 Nguyễn Ngọc Nhã Thảo, Nguyễn Đức Tuấn, Trịnh Thị Thu Loan (2019), “Nghiên cứu cơng thức viên chứa metformin hydroclorid 500 mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50 mg phóng thích tức thời”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, phụ tập 23, số 2-2019, tr 150160 Victor David (2005), “Retention Behavior of Metformin and Related Impurities in Ion-Pairing Liquid Chromatography”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 28, pp 81–95 United State Pharmacopoiea 41 – NF 36 (2018), “Sitagliptin tablets”, pp 3769-3770 (Ngày nhận bài: 25/9/2019 - Ngày duyệt đăng bài: 17/9/2019) ... dựng quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan sitagliptin chế phẩm nghiên cứu phương pháp HPLC II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP... Phƣơng pháp nghiên cứu Thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid sitagliptin chế phẩm phương pháp HPLC Quy trình thử giới hạn tạp chất liên quan metformin hydroclorid. .. xác định giới hạn tạp chất liên quan viên chứa metformin hydroclorid 500mg phóng thích kéo dài sitagliptin 50mg phóng thích tức thời phương pháp HPLC? ?? thực cần thiết Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng