Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184 26

Bộ Y TÉ VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀLNGHIÊN cứu LÊN MEN TỔNG HỢP I Dir vien Vien oaiiTOc MOria [NQI KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.26 Ngưòi hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Sinh viên thực hiện: Bùi Ngọc Bích Lóp: CMSH-1101 Khóa: K18 HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Được phân công Khoa Công nghệ sinh học - Viện đại học mờ Hà Nội Và đồng ý cúa thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu Đại học Dược Hà Nội lôi dã thực đề lài “ Nghiên cứu long hợp kháng sinh từ streptomyces 184.26” Đe hồn thành khóa luận tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo tận tình hướng dẫn, giáng dạy tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Khoa Công Nghệ Sinh Học- Viện Đại Học Mờ Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn đến thay giáo hướng dẫn PGS.TS: Cao Văn Thu tận tình, chu đáo hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận Đồng thời tơi biết ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại Học Dược tạo điều kiện tốt cho lơi hồn thành khóa luận Mặc dù cố gắng để hồn thành khóa luận hồn chinh buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học hạn chế kinh nghiệm kiến thức nên khơng tránh khói thiếu sót định cúa bán thân Tơi mong góp ý q Thầy giáo bạn đe khóa luận hồn chinh „ A Viện Đại học Mở Hà Nội Tôi xin chart thành earn ớn ■ Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2015 Sinh viên Bùi Ngọc Bích MỤC LỤC ĐẶT VÁN DÈ CHƯƠNG I TÓNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.3 Cái tạo giống bão quàn giống vi sinh vật 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh 1.6 Sơ lược số phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh 1.7 Một số nghiên cứu kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces 10 CHƯƠNG II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.1 Giong xạ khuẩn 12 2.7.2 Vi sinh vật 2.1.3 Các loại môi trường nuôi cấy 12 2.1.4 Dụng cụ, hóa chất 14 2.2 Đ.ại b.Q.c M.Q:.H.à.NỘ.Ị 12 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.2 Chọn lọc cải tạo giống 16 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh 16 2.2.4 Sơ xác định số tính chất cùa kháng sinh thu 16 2.3 Phương pháp thực nghiệm 17 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giong 17 2.3.2 Phương pháp xác định hình thái xạ khuân 17 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 18 2.3.4 Phương pháp chọn môi trường ni cấy thích hợp 19 2.3.5 Phương pháp cài tạo chọn giống 19 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21 2.3.6 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ ben pH kháng sinh dịch lọc dịch lên men 21 Các phương pháp chiết tách kháng sinh 22 2.3.8 2.3.8.2 Phương pháp tách kháng sinh sắc ký 22 2.3.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 23 2.3.10 Sơ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu 24 CHƯƠNG III: KÉT QUẢ THỤ C NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25 3.1 Xác định hình thái xạ khuẩn streptomyces 184.26 26 3.2 Kết q chọn MT ni cấy thích hợp xác định tác dụng cùa kháng sinh.25 3.3 Ket cãi tạo giống 26 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 26 3.3.1 Kết đột biến 27 3.3.2 3.4 Kết quà lên men sinh tổng bợp kháng sinh .28 - " TI11Í viẹiĩ ViệnTJại nọc Mợ Hà Nội 3.5 Kết đánh giá ảnh hường pH nhiệt độ đến độ bền cùa kháng sinh dịch lọc 30 3.6 Kết quà chọn dung môi hữu chiết xuất kháng sinh 31 3.7 Kết tách kháng sinh sắc ký lớp mỏng 32 3.8 Kết chạy sắc kí cột 33 3.9 Sơ xác định cấu trúc hóa học số đặc diếm cùa KS thu 35 KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHÁO 38 PHỤ LỤC 41 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẨT AND Acid 2'- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh KTCC Khuân ty chất KTKS Khuấn ty khí sinh MC Mầu chứng MT Mơi trường MTdt tewiioW E coli Escherichia coli ATCC 25922 s Sai số chuẩn hiệu chình SKLM Sắc ký lớp móng SLNN Sàng lọc ngầu nhiên TB Tế bào uv Ultra violet (tứ ngoại) V The tích vsv Vi sinh vật Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC Bâng 2.1 Các vi sinh vật kiếm định 12 Bàng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cay xạ khuẩn (g/100ml) 13 Băng 2.3 Môi trường nuôi cay vsv kiếm định .14 Bảng 2.4 Các dung mơi sử dụng số đặc tính 14 Bàng 3.1 Kốt quà thừ HTKS với 10 vsv kiếm định 25 Băng 3.2 Ket thử nghiệm HTK.S sàng lọc ngẫu nhiên 26 Bảng 3.3 Kết quà thừ HTKS đột biến lần 27 Băng 3.4: Kết thử HTKS đột biến lần 28 Báng 3.5 Ket quà thử HTKS chọn môi trường lên men 29 Băng 3.6 Kết lên men biến chủng tốt MT2dt 29 Bang 3.7 Kết ành hưởng cùa pH đến độ bền kháng sinh 30 Bãng 3.8 Anh hường nhiệt độ tới độ bền kháng sinh trongdịch lọc 30 Bàng 3.9 Kết quà chiết kháng sinh DMHC pH khác 31 Bàng 3.10 Kết quáỉ tách kháng áinh^rotig.ítỊch.chiềlbàngSKÈM i 32 Báng 3.11 Ket quà thừ HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 33 Bâng 3.12 Kết SKLM PĐ 2-12 cúa lần chạy cột lần tách KS1 KS2 34 Bảng 3.13 Kết SKLM PĐ 2-15 cũa lần chạy cột lần tách KS2 KS3 35 Phụ lục Bàng 3.14 Ket thừ HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 41 Phụ lục Bàng 3.15 Kết quà thủ' HTKS đột biến lần 42 Phụ lục Bảng 3.16 Kết thử HTKS đột biến lần 44 Phụ lục 4: Hình ành thử HTKS SLNN E coli 46 Phụ lục 5: Hìnhảnh thử HTKS ĐB E coli 46 Phụ lục 6: Hìnhảnh thứ HTKS ĐB B subtilis 47 Phụ lục 7: Hìnhánh phố tử ngoại vết (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 47 Phụ lục 8: Hìnhãnh phố từ ngoại vết (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 48 Phụ lục 9: Hình ảnh phố hồng ngoại (IR) KS2 Streptomyces 184.26 48 Phụ lục 10: Hình ãnh phổ khối (IM) KS2 Streptomyces 184.26 49 ĐẬT VÁN ĐÈ Năm 1928 Alexander Fleming ngẫu nhiên phát ức chế phát triến s.aureus Penicillin notatum, đến năm 1940, Ermst Chain Howard Walter chiết Penicillin từ chúng Penicilium chrysogenium có hoạt tính cao nhiều lần cứu dược hàng ngàn thương binh chiến tranh giới thứ Từ đó, cơng trình nghiên cứu kháng sinh liên tục tiến hành, ứng dụng rộng rãi y học lâm sàng, ngành công nghệ lên men sàn xuất kháng sinh đời Mặc dù có nhiều thành công việc phát kháng sinh tiến kỹ thuật sản xuất kháng sinh, bệnh nhiễm khuẩn nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn giới, khoang 17 triệu người chết năm Tự sử dụng thuốc lạm dụng kháng sinh yếu tố quan trọng gây tượng kháng kháng sinh, giảm tuồi thọ cùa thuốc Do dó thay dược cấp thiết phái liên tục cho nghiên cứu phát triển loại thuốc kháng sinh Khí hậu Việt Nám điềù kỊiệh thuận lợi ého phát then đa dạng hệ vsv, đáng ý xạ khuẩn có khả sinh tồng hợp kháng sinh, số 55% chi Streptomyces săn xuất Chi cịn có nhiều vsv ngồi khả sinh tổng hợp kháng sinh cịn tống hợp chất khác: chất điều trị ung thư (actinomycin D), chất kích thích tăng trường sử dụng nhiều chăn ni Chính tơi chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 184.26" với mục tiêu sau: - Cãi tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế KS - Sơ xác định vài đặc tính vật lí, hóa học kháng sinh tơng họp dược CHƯƠNG I TÔNG QUAN 1.1 Dại cương kháng sinh ì / Định nghĩa kháng sinh Theo quan niệm truyền thống: "Kháng sinh sán phấtn trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triền tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật khác" Theo quan niệm nay: Kháng sinh đại diện cho tất cà hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tồng hợp có tác dụng ức chế tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật nhiễm sinh (cũng cá với tế bào ung thư) nồng độ thấp, mà khơng có tác dụng tác dụng yếu lên người, động vật thực vật bang đường cung cấp chung Kháng sinh sán phẩm trao đổi chất thứ cấp chi sinh tống hợp mạnh mẽ giai đoạn phát triến sau (pha logarit muộn, pha dừng, pha suy tàn) cùa sinh trường vsv [9] ỉ 1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách khác đế phân loại kháng sinh: > Phân loại theo nguồn gốc: Khártg ạnh có.nguồn gốc tự nhiên,.kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp tổng hựp > Phân loại theo tính nhạy căm vi khuân với kháng sinh: kháng sinh diệt khuân , kháng sinh kìm khuân > Phân loại theo chế tác dụng: úc chế tống hợp vách tế bào vi khuân, ức chế tổng hợp protein, ức chế tống hợp acid nucleic, ức chế chuyển hóa, thay đổi tính thấm cùa màng tế bào > Phân loại theo cấu trúc hóa học: Đây cách phân loại khoa học giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng đặc diem cùa chất kháng sinh phát biết cấu trúc hóa học nó, tránh lãng phí thời gian đế nghiên cứu đặc diem khác Khái quát theo đích tác dụng kháng sinh: - Tổng họp thành tế bào: p -lactam, vancomycin - Màng tế bào chat: Polyen amphotericin, - Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin - Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), macrolid (liên kết t-ADN) - Trao đối chất hô hấp: Antimycin, - Trao đồi chat folat: Sulfamid, Sơ đồ chế tác dụng kháng sinh trình bày phụ lục p ỉ 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh kháng sinh cùa xạ khuẩn - Sự hình thành chất kháng sinh cùa xạ khuẩn: kháng sinh sàn phẩm chuyển hóa thứ cấp hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân trình sinh trường - Anh hường thành phần lên men: nguồn carbon, nguồn nitơ, phosphat vô yếu tố vi lượng - Ảnh hường điều kiện ni cấy: độ thơng khí nhiệt độ pH, tuổi giống.[9] 1.2 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi tự nhiên Trước chúng xếpíýàoTân thực-vậts hgày nay, chúng xếp vào vi khuẩn (Schizomyces) Đa số xạ khuấn vi khuấn Gr (+), hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), tý lệ G+C > 55% Chúng sinh tồng hợp nhiều sản phẩm trao đối chat quan trọng như: kháng sinh, enzym, vitamin, Vì the, chúng nghiên cứu nhiều Tuy nhiên số xạ khuấn có the gây hại cho người động vật 1.2.1 Đặc điêm hình thái cùa xạ khuân Streptomyces Streptomyces chi xạ khuan Gram (+) - Khuẩn lạc cùa xạ khuẩn Streptomyces' đặc biệt, thường có dạng khơ ráp dạng phan, khơng suốt, có nếp gấp tịa theo hình phóng xạ, dùng que cấy không di chuyền khuấn lạc xạ khuấn KTCC bám sâu vào thạch - Khuân ty xạ khuẩn: Đường kính khuân ty xạ khuẩn thay đối khoảng từ 0,3-1,0 pm đến 2-.3pm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn khơng có vách ngăn, màu sắc khuẩn ty phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu KTCC tiết vào mơi trường số loại sắc tố như: sắc tó tan nước, sắc tố tan DMHC, đặc biệt có lồi tạo sắc tố melanoid sẫm đen - K.TCC phát triển thời gian dài khơng khí thành KTK.S Sau thời gian phát triền, đinh KTKS xuất chuỗi bào tứ mọc đơn hay mọc vòng (thang, uốn cong, xoắn lò xo, ) - Bào tử trần quan sinh sản yếu chi xạ khuẩn Streptomyces Bề mặt bào tử có the nhằn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc, với hình dạng phong phú: hình cầu, hình ellipsoic, hình trụ 1.2.2 Đặc điêm câu tạo tê bào xạ khuân - Thành tế bào: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm, có chức trì hình dạng cùa khuẩn ty bào vệ tế bào Chi Streptomyces thuộc nhóm CWI có chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) glycin - Màng tế bào chất: dày khoảng 7.5-10nm Chúng có cấu trúc chức giống vi khuẩn nói chung - Mesosom nằm phíá lrịiigítìia-tệ bào éhầt có-hình phiến, hình bọng hay hình ống Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc màng tế bào chat qua làm tăng cường hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện từ - Các vật ấn nhập tế bào chất xạ khuẩn gồm có hạt phosphat hạt polysaccarid 1.2.3 Đặc điêm sinh lý Streptomyces vsv dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Đe phát triến, chúng phân giãi hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất lượng, đồng thời thủy phân hợp chất gelatin, casein, chúng khư nitrat thành nitrit Streptomyces loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí nhiệt độ tối thích thường 25-3O°C, pH tối thích thường từ 6,8-7,5 Sac tố tạo thành từ Streptomyces chia thành nhóm: sắc tố hịa tan, sắc tố cùa KTCC, sắc tố cúa KTKS sắc tố melanoid [9], 1.2.4 Xác định hình thái xạ khuân Xác định hình thái chuồi bào tử dựa vào cách phân loại theo ISP Bàng 3.13 Kết SKLM phân doan 2-15 ciía lần chay cột lần tách KS1, KS2 Rf Phân đoạn vết 0.59 - 0.57 0,51 0.53 0,52 vết 0.54 0,49 0.50 0,47 0,52 0,47 - 0.48 - 0,47 10 - 0,43 11 - 0,39 12 - 0.40 13-15 Thư viện Viện Đại hẹ c Mớ Hà Nội Nhàn xét: -phân đoạn chi có vết kháng sinh, nhận thấy kháng sinh I (KS1), gộp lại với lượng KS1 từ lần tinh chế thu in = 0.0145g - Từ phân đoạn 8-12, chi có I vết kháng sinh, nhận thấy vết kháng sinh (KS2), gộp lại thu đươc m2 = 0,0264g Tổng kết: Hiệu suất tách KS1 là: %H= 0,0145/0.101 = 14,36% Hiệu suất tách KS2 là: %H= 0.0264/0,101 = 26,13% 3.9 So' xác định cấu trúc hóa học số đặc điểm KS thu đưọc Thấy dược HTKS hiệu suất tách KS2 thu dược cao KS nên tiến hành xác dinh cấu trúc hóa học số đặc diem KS2 chủ yếu 35 ❖ Phố uv (McOH) Xmax (phụ lục II): Phổ uv có đinh hấp thụ ỡ bước sóng 441 nm 301 nm, chứng tỏ cấu trúc kháng sinh có the có nhân thơm, liên kết bội dị tố o, N halogen ❖ Phố khối lượng MS (phụ lục p 12): m/z= 686,29 [M+H/Nal Phân tích lý thuyết cho kết quà khối lượng phân tứ dự kiến 685,29 đvC ❖ Phố IR(KBr) vmax cm'1 (phụ lục p 11): dựa vào đinh hấp thụ ghi thành phần kháng sinh có nhóm chức sau: _ 2978,09 cm'1 đặc trưng cho nhóm -OH chức H-bonded _ 2601,97 cm đặc trưng cho nhóm -OH chức carbonxylic (-COOH) _ 2945,30 cm đặc trưng cho liên kết C-H ankanes đầu dãy ( CH2=R) _ 1658,78 cm đặc trưng cho liên kết c=o cú nhóm chức aldehyl (R-CH=O) cúa nhóm chức ester (RCOOR) _ 1033,85 cm đặc trưng chọ liên kết C-N cúa nhóm chức amid liên kết C-F cùa Fluoride * "ư viẹn V iẹií Đại nọc Mở Ha 1X101 _1170.79 cm'1 đặc trưng cho liên kết C-0 cúa alcohol, ester, carboxylic acid, anhydride C-F Fluoride C-N cùa nhóm chức amin _ 1396.46 cm đặc trưng cho liên kết C-X halogenide (Fluoride , Chloride , Bromide, Iodide) _ 731,02 cm đặc trưng cho lien het C-Cl _ 464,84 cm đặc trưng cho liên kết C-Br C-I cùa halogenide 36 KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ ỉ Kết luận Qua q trình nghiên cứu, tơi hồn thành mục tiêu cùa khóa luận rút số kết luận sau: • Xác định đặc điểm hình thái chùng Streptomyces 184.26 • Chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.26 q trình ni cấy tạo kháng sinh phơ rộng có tác dụng cà Gr (+) Gr (-) Cái tạo chúng Streptomyces 184.26 theo hướng sinh tống hợp kháng sinh + bàng cách sàng lọc, đột biến tạo 10 chùng có hoạt tính kháng sinh cao hãn chúng gốc Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp MT2dt, biến chủng ĐB 1.10 • cho HTKS cao + Kháng sinh chiết tốt bang dung môi Ethylacctat pH=3, tinh chéđượctón8hẬ"lW( vfểnmth‘ỊÍWhọc Mơ Hà Nội + Hiệu suất tách KS: Hiệu suất tách KS1 là: %H= 0,0145/0,101 = 14,36% Hiệu suất tách KS2 là: %H= 0,0264/0.101 = 26,13% Kiến nghị - Tiếp tục tiến hành phân loại chúng Streptomyces 184.26 theo ISP - Tiếp tục cãi tạo giống phương pháp truyền thống kỹ thuật di truyền đại dê nâng cao hiệu suât sinh tông hợp tinh chê KS - Tiến hành đo cộng hưởng từ hạt nhân đế xác định xác cấu trúc KS thu - Tiến hành giãi trình tự gen dế xác định xác tên khoa học chúng Streptomyces 184.26 - Nghiên cứu, tinh chế xác định cấu trúc hóa học thành phần KS khác Streptomyces 184.26sinh tổng hợp - Nghiên cứu chống nấm chúng Sưeptomyces 184.26 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm độc chất, Trung tâm Thông tin - thư viện ĐH Dược Hà Nội, trang 40-41,49-59 Kiều Hữu Ánh (1999) Giáo trình Vi sinh vật học cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội trang 167- 184 Bộ mơn Hóa Phân tích (2006), Hóa phân tích ỉl trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, trang 23-69, 125-147, 215-219,318 Bộ môn Vi sinh- sinh học (2005), Thực tập vi sinh - ký sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, trang 37-54 Bộ Y tế (2007), Dược lý học, NXB Y học, Hà Nội, tập 2, trang 130- 142 Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ, NXB Y học Hà Nội tập trang 105-1179 Bộ Y tế (2007), Kiếm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, trang 68- 82, 115-133 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sán xuất dược phàm, NXB Y học, Hà Nội, tập 2, trang 26-40,81-93 10 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học NXB Giáo dục, Hà Nội, trang 36-39, 90-95 Nguyễn Văn Cách (2005), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội trang 11-16 11 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, trang 39-41 12 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chù yêu - Phân loại xạ khuân 13 Từ Minh Kng (2004), Cơ sớ cơng nghệ sinh học sân xuất dược phàm, NXB Y học Hà Nội trang 42-54 14 Đỗ Thu Hà (2002), Định loại chủng Streptomyces, Tạp chí sinh học, Hà Nội, tập 24 (số 1), trang 59-63 38 15 Từ Văn Mạc (2003), Phân tích hóa lý, phương pháp phô nghiệm nghiên cứu cấu trúc phân từ NXB Khoa học ký thuật, trang 150 - 165 16 Trần Thị Phương Nhung (2012), Nghiên cứu lên men sinh tống hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.29, Luận văn Thạc sỹ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội, trang 2-13 17 Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội tập 1, trang 9-27 18 Hồng Trọng m, Dưong Văn Tuệ (2001), Hóa học hữu cơ, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập trang 240-250 19 Nguyễn Văn Thanh (2001), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục, Hà Nội, trang 14-56 20 Cao Văn Thu, Bùi Việt Hà, Quách Thị Lê Hà, Nguyễn Thị Thúy Hiền, Nguyễn Hồng Hạnh, Võ Thi Linh, Vũ Nguyên Thành, Phan Văn Kiên, Võ Thi Thu Thủy (2010), Nghiên cứu lên men sinh tống hợp kháng sinh nhờ Streptomyces r Sfreptptyyc'pj imppoflaviis Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48(5), trang 108-111 Tiếng Anh 21 Meyyappan Arumugam, Anindita Mitra, Arnab Pramanik, Malay Saha, Ratal! Gachhui and Joydeep Mukherjee (2012), International Joural of Systematic and Evolutionary Microbiology, The Society for General Microbiology, page 139- 144 22 Thompson J D„ Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G (1997), The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools, Nucl.Acids Res 25, page 4786- 4882 23 Tobias Kieser, Mervyn J Bibb, Mark J Buttner, Keith F Chater, David A Hopwood (2000), Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation Norwich, page 170-171 24 Donald L - Pavia, Gary M.Lampman, George S.Kriz, James R.Vyvyan 39 (2008), Introduction to spectroscopy, Deparment of Chemistry Wertern Washington University Bellingham - Whashing 25 Ser HL, Zainal N, Palanisamy UD, Goh BH, Yin WF, Chan KG, Lee LH (2014), Streptomyces gilvigriseus sp nov., a novel actinobacterium isolated from mangrove forest soil, Antonie Van Leeuwenhoek 26 Norimasa Tamehiro, Takeshi Hosaka, Jun Xu, Haifeng Hu, Noboru Otake, Kozo Ochi (2003), Applied and Environmental Microbiology, Innovative Approach for Improvement of an Antibiotic-Overproducing Industrial Strain of Streptomyces albus Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội 40 PHỤ LỤC Hoạt tính kháng sinh (D , s) Dạng chủng D (mm) Dạng chủng B.subtilis E.coli Hoạt tính kháng sinh (D , s) D s s (mni) p.mừabilis B.subtilis D (mm) s D (mm) s SLNN.l 22.96 2.21 26.06 0.66 SLNN.17 22.30 1.4 26.23 2.797022 SLNN.2 22.63 1.59 25.96 2.61 SLNN.18 22.50 0.88 25.33 1.61 SLNN.3 22.90 1.11 25.76 0.05 SLNN.19 22.90 0.34 26.66 2.31 SLNN.4 23.56 1.53 27.06 1.01 SLNN.20 23.66 1.02 26.53 0.65 SLNN.5 21.83 1.76 27.26 0.98 SLNN.2I 23.70 1.03 25.06 1.91 SLNN.6 22.90 1.31 26.40 0.95 SLNN.22 20.93 0.47 28.00 1.11 SLNN.7 23.60 1.73 26.13 1.10 SLNN.23 20.53 0.50 28.16 1.50 SLNN.8 25.40 ÝSỗr 21.00 26.80 0.78 SLNN.9 24.56 1.22 27.30 2.55 SLNN.25 23.30 0.60 26.23 0.85 SLNN.10 23.90 1.21 23.23 0.41 SLNN.26 21.56 1.40 24.53 0.05 SLNN.12 24.46 1.00 23.23 1.33 SLNN.27 21.30 0.75 24.93 1.80 SLNN.13 24.23 0.64 25.20 2.81 SLNN.28 21.20 1.11 24.06 0.70 SLNN.14 19.83 2.51 26.60 0.34 SLNN.29 22.13 1.15 24.13 1.55 SLNN.15 21.46 0.76 26.90 0.81 SLNN.30 24.90 1.20 25.73 2.11 24.23 0.83 24.66 2.35 SLNN.31 24.30 1.12 26,83 2.05 SLNN.16 MB Phụ lục Bảng 3.14 Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 41 Hoạt tính kháng sinh (Streptomyces 184.225) Bien B.suhtilis E.coli chúng D s (mm) % biến đổi D (mm) s % biến đỗi hoạt tính hoạt tính ĐB1.1 22,53 2,95 112,08 21,90 2,60 103,30 ĐB1.2 23,53 1,83 117,06 22,89 1,86 107,97 ĐB1.3 21,50 1,15 106.96 23,30 1,93 109.90 ĐB1.4 21,80 0,85 108,45 22,56 1,15 106,41 ĐB1.5 22,03 1,10 109,60 23,04 0,96 108.67 ĐB1.6 21,33 1,77 106,11 22,26 1,41 105.00 ĐB1.7 23,89 1,93 118,85 24,86 0,05 117,26 ĐB1.8 22,70 1,76 112,93 23,43 2,35 110.51 ĐB1.9 21,93j i àỌ 107.68 ĐB1.10 24,46 1,33 121,69 25,56 1,15 120,56 ĐB1.11 21,43 1,65 106,61 22,06 0,73 104,05 ĐB1.12 23.53 1,40 117,06 22.45 1,29 105,89 ĐB1.13 22,20 1,90 110,44 21,63 2,65 102,02 ĐB1.14 21,83 0,46 108,60 22,93 0,63 108,16 ĐB1.15 22,80 1,24 113,43 21,33 0,80 100,61 ĐB1.16 20,50 1,11 101,99 21,50 2,85 101,41 ĐBI.17 22,36 1,70 111,24 22,13 1,00 104,38 ĐB1.18 21,76 1,88 108,25 22,23 1,36 104.85 DB1.19 22,00 0,43 109,45 23,80 0,60 112.26 ĐB1.20 22,06 0,49 109,75 22,20 0.17 104.71 ưMện Vi Wai 42 ỌcW 1- DB1.21 21,10 1,60 104,97 23,80 1,70 112,26 ĐB1.22 21,33 0,77 106,11 23,36 1,44 110.18 ĐB1.23 23,30 1.00 115,92 21,96 1,15 103,58 ĐB1.24 23,00 1,44 114,42 22,90 2,13 108,01 DB1.25 21,90 0,34 108,95 22,83 0,75 107,68 ĐB1.26 23,43 0,96 116,56 21,23 0,55 100.14 ĐB1.27 20,53 1,00 102.13 22,96 1,92 108.16 ĐB1.28 21.56 0.87 107,26 23,23 1,02 109.57 ĐB1.29 22,30 1,21 110,49 23,43 1,40 110,51 ĐB1.30 21,66 0,90 107,76 23,23 0,90 109.57 ĐB1.31 22,66 0,90 112,73 22,23 0,90 104.85 DB1.32 23,70 0.51 ĐB1.33 Th 25,56 ĐB1.34 22,96 Chứng 20,10 117,91 23,66 1,64 111.60 \/ínn 13-1Í 1■ 127,jyn 24,10 2,88 113,67 2,01 114,22 22,10 1,12 104,24 1,57 100,00 21,20 2,33 100,00 Phụ lục Bảng 3.15 Kết thử HTKS đột biến lần 43 Hoạt tính kháng sinh (Streptoniyces 184.225) Biến B.subtilis E.coli chủng D (mm) s ĐB2.1 22.90 0,35 DB2.2 23.66 ĐB2.3 % biến đổi % biến đổi D (mm) s 106,71 22,93 0,45 100,74 0,41 110.25 22.96 0,92 100,87 22,70 0.69 105,77 23,23 0,92 102,06 ĐB2.4 22.16 0,45 103,26 23,23 0,97 102.06 DB2.5 23,96 0.86 111.64 23,86 0,85 104,83 ĐB2.6 22.46 0,52 104,65 23,26 0,85 102,19 ĐB2.7 23.60 0,24 109,97 23,33 0,11 102,50 ĐB2.8 2.3,60 0,11 109,97 24,60 0,34 108,08 ĐB2.9 23.20 0.36 108.10 23.00 0.24 101,05 DB2.10 Till 22.46 0,46 104.65 p Mff H? NÂi 0,07 23,06 101,31 ĐB2.11 22.86 0,53 106,52 0,23 108.38 ĐB2.12 23.26 hoạt tính hoạt tính 0,83 102,94 22,76 0,55 100.00 23,42 0,96 102,89 23,43 ĐB2.13 22.16 0,59 103,26 ĐB2.14 24.00 0,65 111,83 22,88 0,63 100,52 ĐB2.15 22.85 1,37 106,47 23,40 0,60 102,81 ĐB2.16 22.18 2,80 106,24 23,62 0,64 103,77 ĐB2.17 23.80 0,51 110.90 22,81 0,94 100.21 DB2.18 21.52 1,09 100.27 22,79 0,92 100.13 ĐB2.19 21.60 1,50 101.11 23,83 0,91 104,70 ĐB2.20 22,96 1,20 106,98 23.03 0,46 101.18 ĐB2.21 23.26 0,87 108,38 23,13 0,64 101,62 44 DB2.22 21.70 0,19 101,11 23,73 0,13 104.26 ĐB2.23 22.23 0,41 103,58 23,16 0,89 101,75 ĐB2.24 25,26 0,20 117,70 24,53 0,81 107.77 22,96 0,23 100,87 ĐB2.25 23.80 0,95 110,90 ĐB2.26 22.13 0,50 103.12 23,63 0,98 103,82 DB2.27 22.33 0,87 104,05 23,20 0,81 101,93 DB2.28 24,76 0,93 115,37 25,70 0,47 112,91 ĐB2.29 22.03 0,20 102,65 23.23 0,50 102,06 ĐB2.30 24.10 0,55 112,30 23,00 0,45 101,05 ĐB2.31 21,76 0,55 100,74 23,40 0,57 102,81 ĐB2.32 22.40 0,36 104.38 22,80 0,58 100.17 ĐB2.33 23,50 0.86 109,50 23.00 0.38 101,05 ĐB 2.34 25,40 113,92 Chứng 1.46 118,35 0,92 1,55 25,93 r VIen \ hên Đai ho c Mơ Hì NoT 0.27 0,15 100,00 22,76 Phụ lục Bảng 3.16: Kết quă thử HTKS đột biến lần 45 100,00 Phụ lục 4: Hình ảnh thử HTKS SLNN E.coli Phụ lục 5: Hình ảnh thửHTKS ĐB E.coli 46 Phụ lục 6: Hình ảnh thử HTKS dột biết B.subtilis Select Function or press START ■Data Process BScale "Baseline 0Print Setup Phụ lục 7:Hình ảnh Phổ tử ngoại (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 47 Phụ lục 9: Hĩnh ánh phơ hồng ngoại ( IR) KS2 cùa Streptomyces 184.26 48 Phụ lục 10: Hình ánh Phổ khối (IM) KS2 cùa Streptoinyces 184.26 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội 49 ... ? ?Nghiên cứu lên men tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 184. 26" với mục tiêu sau: - Cãi tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định, lựa chọn mơi trường lên men. .. sinh vật 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh 1.6 Sơ lược số phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh 1.7 Một số nghiên cứu kháng sinh. .. hành nghiên cứu 3.4 Kết lên men sinh tống hợp kháng sinh * Chọn mơi trường lên men chìm tốt nhất: từ biến chúng ĐB.34 tiến hành lên men MT2, MT5 MT6 dịch the Sau trình lên men lọc loại bỏ sinh