Luận văn thạc sĩ khoa học khảo sát qui trình chiết tách ent kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm bắc bộ

MỞ ĐẦU Việt Nam nằm vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa nên có hệ thực vật phong phú đa dạng với 12.000 loài, bao gồm 300 họ 1.200 chi Nguồn thực vật phong phú cung cấp cho người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng lớn nhiều lĩnh vực khác sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh Các loại thuốc thảo mộc gây tác dụng phụ độc hại cho người sử dụng Chúng dùng tác nhân điều trị trực tiếp, làm chất dị sinh hố để làm sáng tỏ nguyên lí dược học làm chất chuẩn để phát triển loại thuốc Chính việc nghiên cứu hố học hoạt tính sinh học lồi thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng cách hợp lý có hiệu quản nguồn tài nguyên thiên nhiên Chi Croton chi lớn thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) quan tâm nghiên cứu giới Chính hoạt tính lý thú ent-kauran diterpenoid từ khổ sâm Bắc Bộ Croton tonkinensis (Euphorbiaceae) mà luận văn có nhiệm vụ sau: Tiến hành khảo sát qui trình chiết tách ent-kauran diterpenoid từ khổ sâm Bắc Bộ Thực số phản ứng chuyển hóa với hợp chất ent-kauran diterpenoid phân lập gồm: - Phản ứng epoxi hóa nối đôi thủy phân epoxit - Phản ứng thủy phân - Phản ứng axetyl hóa - Phản ứng oxi hố Tiến hành thử hoạt tính sinh học với sản phẩm chuyển hóa nhận Chương TỔNG QUAN 1.1 Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.) 1.1.1 Thực vật học [1, 2] Cây khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học Croton tonkinensis Gagnep thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Hình 1: Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Khổ sâm Bắc Bộ nhỏ, cao độ 0,7-1 m Lá mọc cách hay gần mọc đối, có mọc thành vịng giả gồm 3-6 Lá hình mũi mác, mép nguyên dài 5-10 cm, rộng 1-3 cm Cả hai mặt có lơng hình khiên óng ánh (kiểu lơng nhót) mặt nhiều mặt Khi phơi khơ mặt có màu trắng bạc, mặt có màu nâu đen Cụm hoa mọc kẽ hay đầu cành, lưỡng tính hay đơn tính Hoa đực có đài,12 nhị Hoa có đài, vịi nhị Quả gồm mảnh vỏ màu đỏ 1.1.2 Nơi sống thu hái [1] Cây khổ sâm Bắc Bộ mọc hoang trồng khắp nơi, vườn gia đình vườn thuốc, chủ yếu tỉnh phía bắc Việt Nam Thường trồng gieo hạt hay trồng cành vào mùa xuân Thu hái có hoa, đem phơi sấy khơ, dùng đem vàng 1.1.3 Hoạt tính cơng dụng khổ sâm Bắc [1, 2] Cây khổ sâm Bắc Bộ dùng dân gian làm thuốc chữa mụn nhọt, lở ngứa, viêm mũi, lỵ, đau bụng, viêm loét dày, tá tràng, tiêu hoá Ngày dùng 15-20 vàng, dạng thuốc sắc, dụng lấy nước sắc đặc để rửa Gần đây, khổ sâm Bắc Bộ ý nhiều dùng đơn thuốc chữa bệnh đau dày kết hợp với vị thuốc khác (lá bồ công anh Lactuca indica khôi Ardisia sylvestris) dùng riêng dạng nước sắc Nước sắc khổ sâm Bắc Bộ thực nghiệm có tác dụng kháng số nấm ngồi da Khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng kháng sinh trực khuẩn lỵ đồng thời có tác dụng kháng lỵ amip, làm cho đơn bào co thành kén Tác dụng ký sinh trùng sốt rét: nước sắc thuốc gồm Khổ sâm vỏ Bưởi có tác dụng ức chế ký sinh trùng sốt rét mạnh động vật thí nghiệm gây nhiễm sốt rét, nhưng  tái phát thời gian 10 ngày theo dõi mơ hình thực nghiệm chuột nhắt nhiễm Plasmodium berghei gà nhiễm Plasmodium gallinaceum 1.1.4 Các ent-kauran diterpenoid khổ sâm Bắc Năm 2000, Phan Tống Sơn cộng công bố quốc tế diterpen từ khổ sâm Bằng phương pháp phổ xác định cấu trúc diterpen ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl axetat (1) [5, 33] Chất có hoạt tính kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum in vitro Nhóm tác giả tiếp tục đánh giá hoạt tính diterpen với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (với chủng nhạy chủng kháng cloroquin) tác dụng gây độc số tế bào ung thư (Hep-G2, RD, FI, VR), tác dụng ức chế phát triển vi sinh vật kiểm định [7] CH3 CH2 H CH3COOCH2 H CH3 OH O Trong nghiên cứu Phan Minh Giang cộng [19] bốn entkaurane diterpen gồm hai chất biết, ent-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (2) ent-18-acetoxy-7α-hydroxykaur-16-en-5-one (3) hai chất mới, ent-1β-acetoxy-7α, 14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (4) ent-18-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en15-one (5) phân lập từ khổ sâm Bắc Bộ Các ent-kauranoid ức chế nhân tố phiên mã NF-ĸB sản xuất NO hoạt hoá LPS đại thực bào RAW264.7 chuột IC50 = 0,07 - 0,42 µg/ml R1 R3 OH O R2 R1 =H, R2 =H, R3 =OH R1 =H, R2 =OAc, R3 =H R1 =OAc, R2 =H, R3 =OH R1 =H, R2 =OAc, R3 =OH Năm 2004, ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-ol (6) phân lập từ khổ sâm Bắc Bộ [30] H O OH H HO Tiếp đó, Phan Minh Giang cộng cơng bố cấu trúc ent-kauran diterpen mới, ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one (7), ent-1α,7βdiaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (8), ent-18-acetoxy-14α-hydroxykaur-16en-15-one (9) ent-(16S)-18-acetoxy-7β-hydroxy kauran-16-en-15-one (10) [20] R1 R4 H R1 R2 R3 H R2 R3 R4 OAc H OH OAc OAc H OAc OH H H OAc H O AcO H O OH 10 OH Năm 2005, có ent-kauran diterpenoid phân lập từ khổ sâm Bắc Bộ chất ent-7β -acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (11), ent-18acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (12), ent-11α-acetoxykaur-16-en-18-oic acid (13), ent-15α,18-dihydroxykaur-16-ene (14), ent-11α,18-diacetoxy-7β -hydroxykaur- 16-en-15-one (15), and ent-(16S)-1α,14a-diacetoxy-7β -hydroxy-17-methoxykauran15-one (16) [21] Ba diterpenoid R1 R2 R3 R4 R5 11 H H OAc H OH 12 H OAc H H OH 15 H OAc OH H OAc với cấu trúc ent-kaur-16-ene, en-11α-acetoxy-7β, 14α dihydroxykaur-16-en-15-one (17), ent-18–hydroxykaur-16-ene (18) ent-kaur-16- en15-oxo-18-oic acid (19) phân lập từ phần chiết metanol khô khổ sâm Bắc Bộ phương pháp tách sắc ký cột silica gel, ODS gel, HPLC pha đảo [18] AcO OH H H OH H H O O HOOC H HO 17 18 H 19 1.2 Vài nét terpen diterpen [3, 25] Khái niệm “terpen” dùng để lớp hợp chất thiên nhiên có cấu trúc phân chia thành đơn vị isopren Căn vào số đơn vị isopren hợp thành người ta phân biệt monoterpen C 10, sesquiterpen C15, diterpen C20, sesterterpen C25, triterpen C30, tetraterpen C40 polyterpen Bên cạnh thuật ngữ “terpen” người ta dùng khái niệm “terpenoit” để bao hàm rộng rãi sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ ionon dẫn xuất tự nhiên tổng hợp terpen, thí dụ terpen - ancol, -andehit, -xeton, axit, - este, - epoxit, v.v… Tuy nhiên sử dụng thường khơng có phân chia ranh giới thật rõ rệt khái niệm “terpen” “terpenoid” vừa nêu Thuật ngữ terpen nhiều dùng để bao hàm terpen – hidrocacbon lẫn dẫn xuất chúng Các diterpenoid hợp thành nhóm lớn hợp chất C-20 dẫn từ geranyl geraniol pyrophotphat Chúng chủ yếu xuất loài nấm thực vật bao gồm axít nhựa hocmon sinh trưởng thực vật nhóm gibberellin Các diterpenoid có số nét riêng đặc trưng Sự oxi hoá thường hay xảy nhóm phân tử ta thấy xuất nhiều phản ứng tạo ete lacton Các tương tác nhóm khơng liên kết trực tiếp với thường làm cho khung cacbon bị biến dạng dẫn tới nhiều chuyển vị lý thú Đa số diterpen hợp chất vòng Đối với diterpen chủ yếu kiểu đóng vịng để hình thành dẫn xuất perhidronaphtalen perhidrophenantren Có hai kiểu đóng vịng : Kiểu 1: Đóng vịng proton hố nối đôi đơn vị isopropyliden xuất phát Kiểu thứ thuộc dãy lập thể với steroid Kiểu 2: Nhóm pyrophotphat rời khỏi phân tử cho cacbacation khai mào cho phản ứng đóng vịng Từ tiền thân khơng vịng, thơng qua kiểu đóng vịng khác mà dẫn đến hệ thống khung vô phong phú terpen diterpen Chẳng hạn ngày ta biết đến 170 khung cacbon diterpen, số có khung (hình 1) chiếm khoảng 50% diterpen biết, khung labdan chiếm số lượng lớn cembran pimaran clerodan labdan abietan kauran gibberellan Hình 2: Một số khung diterpen Các diterpen có hoạt tính sinh học vơ phong phú: Điển hình hocmon sinh trưởng thực vật dãy gibberellin Người ta phân lập tinh chế axít gibberellic từ nấm Gibberella fujikuroi tác dụng đặc trưng cho phát triển bình thường Các axít nhựa thuộc vào số sản phẩm thiên nhiên xuất với lượng lớn Chúng có tác dụng cố kết sợi gỗ, đặc biệt axít nhựa có nhóm phenolic có hoạt tính kháng sinh nhẹ bảo vệ cho gỗ khỏi bị vi sinh vật làm mục nát (axít podocarpic axít ferruginol) Nhựa copan hình thành số nhiệt đới mục nát có tác dụng bảo vệ Diterpen pleu-romutilin phân lập từ Pleurotus mutilus có hoạt tính kháng khuẩn Ngồi nhiều hợp chất diterpenoid cịn có tác dụng kìm hãm phát triển khối u (ví dụ quinon-methin), hợp chất có độc tính nguy hiểm (ví dụ taxin thuỷ tùng) Từ nhựa Fabiana densa Remy var ramulosa Wedd tách hai diterpen mới: ent-beyer-15-en-18-O-succinat (20) ent-beyer-15-en-18-O-oxalat (21) Hai hợp chất có hoạt tính kháng vi trùng Escherichia coli (ATCC 8739), Klebsiella pneumoniae, Salmonella aviatum (ATCC 2228), Pseudomonas aerug-inosa (ATCC 14207), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Micrococeus flavus (ATCC 10290), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Saccharomyces cerevisiae [16] R O H2C CH3 Phần chiết CH2Cl2 Croton zambesicus (Euphorbiaceae) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư biểu mô tử cung Từ phần chiết tách trachyloban diterpen, ent-trachyloban-3β-ol (22) với hoạt tính độc tế bào dịng tế bào Hela, IC50=7,3 µg/ml [14] H HO H 22 1.3 Khái quát kauran ent-kauran Các kauran tồn hai dạng: dạng ent phyllocladane Phần lớn kauran dạng ent, phổ biến phyllocladan có cầu metylen vị trí đối diện so với nhóm metyl C-10 20 19 11 12 10 H 13 16 14 11 17 20 15 H 19 18 ent-kauran 10 12 H 13 16 14 17 15 H 18 phyllocladan 1.3.1 Sinh tổng hợp ent-kauran Ent-kauran hình thành từ geranylgeranyldiphosphat (GGPP) tác dụng xúc tác enzym [22] Enzym ent-kaurene synthase (A) (copalyl PP synthase) xúc tác đóng vòng tạo thành (-)-copalyl PP (ent-copalyl diphosphat) 10 H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 0,86 (3H, s, Me-19), 0,92 (H, dt, J = 13,2 Hz, 3,6 Hz, H-1a), 1,12 (3H, s, Me-20), 1,36(2H, m, 2H-3), 1,40 (1H, m, H-5), 1,48 (1H, q, J = 12,5 Hz, H-6a), 1,58 (1H, m, H-2a), 1,59 (1H, brs, H-9), 1,63 (1H, m, H-2b), 1,65 (1H, m, H-12a), 1,80 (1H, dd, J = 12,5 Hz, H-6b), 1,87 (1H, m, H-1b), 1,92 (2H, m, 2H-11), 1,96 (1H, m, H-12b), 2,0 (1H, brs, H-13), 2,07 (3H, s, OCOCH 3), 2,42 (1H, brs, H-13), 2,52 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-17a), 2,80 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-17b), 3,65 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-18a), 3,83 (1H, dt, J = 12,0 Hz, 4,0 Hz, H-7), 3,89 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-18b) 13 C-NMR (CDCl3): δ (ppm): 17,5 (t, C-2), 17,8 (t, C-11), 17,84 (q, C-19), 18,4 (q, C-20), 21,0 (q, -OCOCH3), 24,8 (t, C-14), 26,8 (t, C-6), 26,9 (t, C-12), 33,1 (d, C13), 35,2 (t, C-3), 36,3 (s, C-4), 39,7 (t, C-1), 40,0 (s, C-10), 46,2 (d, C-5), 51,38 (d, C9), 51,4 (t, C-17), 55,9 (s, C-8), 72,1 (t, C-18), 76,9 (d, C-7), 91,1 (s, C-16), 170,4 (s, C-15), 171,1 (s, - OCOCH3)  Hằng số vật lý kiện phổ chất F: Bột vơ định hình màu trắng Rf = 0,59 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 2:1 (v/v)), vệt chất có màu vàng phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4 160: 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 0,91 (3H, s, CH3-19), 0,95 (3H, s, CH3-18), 1,29 (3H, s, CH3-20), 1,98 (3H, s, 14-OAc), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 2,91 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-17a), 3,26 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-17b), 4,17 (1H, brs, H-7), 4,89 (1H, s, H-1), 6,16 (1H, s, H-14) 161: 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 0,88 (3H, s, CH3-19), 0,97 (3H, s, CH3-18), 1,18 (3H, s, CH3-20), 2,01 (3H, s, 1-OAc), 2,02 (3H, s, 7-OAc), 2,94 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17a), 3,18 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17b), 4,89 (1H, s, H-1), 5,04 (1H, s, H-14), 5,46 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 4,0 Hz, H-7) 53 3.4.2 Phản ứng mở vòng epoxit A3 thủy phân kiềm Cân 100 mg chất A3 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng với dung dịch NaOH 2,5% MeOH (10 ml) nồi nước nóng 2h Sau phản ứng thêm nước cất vào bình phản ứng Chiết hỗn hợp phản ứng lần diclometan (mỗi lần ml) Gộp dịch chiết diclometan lại, rửa nước cất đến môi trường trung tính Làm khan dung dịch nhận Na 2SO4, lọc cất loại diclometan, thu cặn thô Cặn thô tinh chế sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v) thu ml/ phân đoạn cho tinh thể L (162) (60 mg) Hiệu suất phản ứng đạt 42,4%  Hằng số vật lý kiện phổ chất L (162): Tinh thể màu trắng hình kim Rf = 0,65 (TLC, silica gel, hệ dung mơi n-hexan-axeton (1:2, v/v)), vệt chất có màu vàng phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4 H-NMR (CDCl3 + CD3OD, δ, ppm): 0,73 (3H, brs, CH3-19), 1,0 (3H, brs, CH3- 20), 2,54 (1H, brs, H-13), 3,0 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H17b), 3,76 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18a), 3,77 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,4 Hz, H-7), 3,95 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18b) 13 C-NMR (CDCl3 + CD3OD, δ, ppm): 17,4 (C-19), 17,5 (C-18), 17,6 (C-2), 17,9 (C-11), 26,3 (C-6), 27,3 (C-12), 28,4 (C-14), 34,9 (C-3), 36,9 (C-4), 38,2 (C-10), 39,6 (C-1), 34,8 (C-13), 44,8 (C-5), 54,9 (C-9), 62,4 (C-17), 70,0 (C-18), 73,9 (C-7), 82,7 (C-8), 87,9 (C-16), 180,3 (C-15) 54 3.4.3 Phản ứng thủy phân hỗn hợp epoxit F phức BF3.Et2O Cho 20 mg epoxit F hòa tan CHCl3 khan vào bình cầu phản ứng khuấy từ điều kiện làm lạnh đá Thêm giọt BF 3.Et2O vào bình phản ứng Sau phút, hỗn hợp phản ứng rửa dung dịch NaHCO 3, làm khô Na2SO4, lọc cất loại dung môi áp suất giảm thu cặn thô Cặn thô phân tách sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (10:1, v/v), thu ml/ phân đoạn cho tinh thể F2 (163) (7 mg) Hiệu suất phản ứng 27%  Hằng số vật lý kiện phổ chất F2 (163): Bột màu trắng vơ định hình Rf = 0,32 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 (v/v), vệt chất có màu vàng phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4 H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,91 (3H, s, CH3-19), 0,97 (3H, s, CH3-18), 1,17 (3H, s, CH3-20), 2,01 (3H, s, 1-OAc), 2,29 (1H, brs, H-13), 2,91 (1H, d, J=11,0 Hz, H17a), 3,18 (1H, d, J=11,0 Hz, H-17b), 4,34 (1H, dd, J=12,5 Hz, 4,0 Hz, H-7), 4,88 (1H, brs, H-14), 5,04 (1H, J=1,5 Hz, H-1) 13 C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 18,2 (C-11), 18,6 (C-20), 21,3 (C-19), 21,5 (1- OAc), 22,7 (C-2), 27,6 (C-6), 28,0 (C-12), 32,9 (C-4), 33,3 (C-20), 34,9 (C-3), 42,8 (C10), 42,9 (C-13), 45,5 (C-9), 47,2 (C-5), 48,3 (C-17), 61,9 (C-8), 62,4 (C-16), 72,8 (C1), 74,2 (C-7), 75,4 (C-14), 170,1 (1-OAc), 217,1 (C-15) 3.4.4 Phản ứng thủy phân Cân 200 mg chất đầu cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml Thêm ml metanol chứa 15% KOH vào bình phản ứng Hỗn hợp phản ứng đun hồi lưu nhiệt độ khoảng 70 – 80oC 12 55 Sau phản ứng, thêm 30 ml nước cất vào hỗn hợp cất loại metanol Chiết dung dịch lần diclometan (mỗi lần ml) Rửa nước đến pH = 7, gộp dịch chiết diclometan lại, làm khan cất loại diclometan, thu cặn thô Cặn thô phân tách sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040 0,063 mm), hệ dung môi gradient n-hexan-axeton thu ml/ phân đoạn cho sản phẩm thủy phân tương ứng Từ chất đầu chất thu sản phẩm 164 (90 mg) Hiệu suất phản ứng 75% Từ chất đầu hỗn hợp chất thu sản phẩm K2 (165) (83 mg) Hiệu suất phản ứng 74%  Hằng số vật lý kiện phổ chất K2 (165): Tinh thể màu trắng hình kim Rf = 0,53 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4 H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,89 (3H, s, CH3-19), 0,96 (3H, S, CH3-18), 1,09 (3H, s, CH3-20), 3,08 (1H, s, H-13), 3,69 (1H, brs, OH), 4,37 (1H, dt, J = 12,5 Hz, 4,0Hz, H-7), 4,91 (1H, s, H-1), 5,29 (1H, s, H-14), 5,41 (1H, s, H-17a), 6,18 (1H, s, H17b), 13 C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 18,6 (C-20), 21,4 (C-19), 33,2 (C-18), 117,7 (C-17), 146,0 (C-16), 206,5 (C-15), 76,1 (C-14), 44,2 (C-13), 32,3 (C-12), 16,6 (C-11), 43,0 (C-10), 48,1 (C-9), 61,6 (C-8), 72,9 (C-7), 27,3 (C-6), 47,6 (C-5), 32,9 (C-4), 35,0 (C3), 22,7 (C-2), 72,7 (C-1) 56 3.4.5 Phản ứng axetyl hóa chất Cân 50 mg chất cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml Thêm 0,2 ml anhidrit axetic, sau cho 0,5 ml pyridin (làm khan kỹ KOH rắn chưng cất trước dùng) vào bình phản ứng Phản ứng tiến hành nhiệt độ phòng ngày Sau phản ứng, thêm nước cất dung dịch HCl 7M vào bình phản ứng Chiết hỗn hợp phản ứng khoảng lần diclometan (mỗi lần ml) Gộp dịch chiết diclometan lại, rửa nước đến môi trường trung tính Làm khan cất loại diclometan, thu cặn thô Cặn thô phân tách sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể 166 (47mg) Hiệu suất phản ứng 89,5%  Hằng số vật lý kiện phổ chất 166: Tinh thể hình kim, màu trắng Rf = 0,63 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat (2:1, v/v), vệt chất có màu tím hồng phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4 H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,82 (3H, s, Me-19), 1,15 (3H, s, Me-20), 1,91 (3H, s, 7-OAc), 2,13 (3H, s, 18-OAc), 3,10 (1H, sbr, H-13), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H18A), 3,85 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-18B), 5,10 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz, H-3), 5,29 (1H, s, H-17A), 5,96 (1H, s, H-17B) 13 C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 17,6 (t, C-2), 17,7 (q, C-19), 17,9 (t, C-11), 18,2 (q, C-20), 21,0 21,0 (q, 7-OAc, 18-OAc), 24,4 (t C-6), 29,2 (t, C-14), 32,6 (t, C-12), 35,7 (t, C-3), 36,4 (s, C-4), 35,7 (d, C-13), 39,0 (t, C-1), 39,7 (s, C-10), 45,9 (d, C-5), 51,9 (d, C-9), 56,2 (s, C-8), 72,0 (d, C-7), 73,1 (t, C-18), 115,2 (t, C-17), 148,8 (s, C16), 169,5 (s, 7-OAc), 171,4 (s, 18-OAc), 207,4 (s, C-15) 57 3.4.6 Phản ứng oxi hoá chất Cân 50 mg chất cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml Thêm ml clorofoc vào bình để hồ tan chất Sau cho vào bình dung dịch A (40mg K2Cr2O7 2,5 ml nước cất) nhỏ giọt từ từ 0,1 ml axit sunfuric đặc vào Hỗn hợp phản ứng khuấy đun hồi lưu nhiệt độ 50 – 60oC ngày Sau phản ứng chiết dung dịch thu lần clorofoc (mỗi lần ml) Rửa nước cất đến pH = 7, gộp dịch chiết clorofoc lại, làm khan cất loại clorofoc, thu cặn thô Cặn thô phân tách sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm), hệ dung môi gradient n-hexan-axeton thu ml/ phân đoạn cho tinh thể 167 (42 mg) Hiệu suất phản ứng đạt 82,5%  Hằng số vật lý kiện phổ chất 167: Bột màu trắng vơ định hình Rf = 0,69 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat (2:1, v/v), vệt chất có màu vàng da cam phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,85 (3H, s, Me-19), 0,94 (3H, s, Me-20), 2,11 (3H, s, 18-OAc), 2,40 (1H, dd, J = 18,5 Hz, 11,5 Hz, H-6A), 2,71 (1H, dd, J = 18,5 Hz, 8,0 Hz, H-6B), 3,02 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 4,5 Hz, H-13), 3,64 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18A), 3,82 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18B), 5,39 (1H, s, H-17A), 5,92 (1H, s, H-17B) 13 C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 14,8 (q, C-20), 17,2 (q, C-19) 17.5 (t, C-2), 17,7 (t, C-11), 21,0 (q, 18-OAc), 27,7 (t, C-6), 30,2 (t, C-14), 35,1 (d, C-13), 35,8 (t, C-3), 36,8 (s, C-4), 38,2 (s, C-10), 38,4 (t, C-12), 39,2 (t, C-1), 44,0 (d, C-5), 54,9 (d, C-9), 63,8 (s, C-8), 72,2 (t, C-18), 116,9 (t, C-17), 151,2 (s, C-16), 171,5 (s, 18-OAc), 203,2 (s, C7), 210,7 (s, C-15) 58 3.4.7 Phản ứng oxi hoá hỗn hợp tác nhân Jones Cân 20 mg chất đầu vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml Thêm 10 ml axeton (được làm lạnh đến -20oC) vào bình để hồ tan chất Sau thêm từ từ vào bình dung dịch ml tác nhân Jones (tác nhân Jones điều chế từ 27g CrO 23 ml H2SO4 đặc sau thêm 20 ml nước cất) cho nhiệt độ phản ứng không vượt 5oC Sau phút phản ứng kết thúc, thêm isopropanol để phá hủy lượng dư tác nhân Sau phản ứng đổ hỗn hợp phản ứng vào nước, chiết dung dịch thu khoảng lần diclometan (mỗi lần ml) Gộp dịch chiết diclometan lại, rửa dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH = Làm khan cất loại diclometan, thu cặn thô Cặn thô phân tách sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063– 0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể hình kim màu trắng O1 (168) (16 mg) Hiệu suất phản ứng đạt 78,5%  Hằng số vật lý kiện phổ chất O1: Tinh thể màu trắng hình kim Rf = 0,41 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4 H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,90 (3H, s, CH3-19), 0,91 (3H, s, CH3-18), 1,41 (3H, s, CH3-20), 1,96 (3H, s, 14-OAc), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 3,12 (1H, brs, H-13), 4,97 (1H, s, H-1), 5,43 (1H, s, H-17a), 5,76 (1H, s, H-14), 6,19 (1H, s, H-17b) 13 C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 16,1 (C-11), 17,2 (C-20), 20,8 (1-OAc), 20,9 (14- OAc), 21,1 (C-19), 22,5 (C-2), 31,9 (C-12), 32,3 (C-18), 33,2 (C-4), 34,8 (C-3), 38,1 (C-6), 42,2 (C-10), 43,1 (C-13), 46,6 (C-5), 48,6 (C-9), 68,7 (C-8), 72,9 (C-1), 76,2 (C14), 118,7 (C-17), 145,5 (C-16), 170,0 (1-OAc), 171,0 (1H-OAc), 201,5 (C-7), 205,1 (C-15) 59 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm dẫn xuất Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh mẫu chiết thực phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp đại Vander Bergher Vlietlinck (1991), MCKane, L., & Kandel (1996) Các chủng vi sinh vật kiểm định: - Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus - Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum - Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae Chứng dương tính: + Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-) + Nystatin Amphotericin B cho nấm sợi nấm men Thuốc tháng sinh pha DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin: 50 mM; Tetracylin: 10 mM; Nystatin: 0,04 mM Chứng âm tính: Vi sinh vật kiểm định không trộn lẫn kháng sinh chất thử Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Mơi trường trì bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men nấm mốc Vi khuẩn môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)Sigma 60 Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm Tiến hành thí nghiệm: Các chủng kiểm định hoạt hóa pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland tiến hành thí nghiệm Đọc kết quả: Kết đọc sau ủ phiến thí nghiệm tủ ấm 37 oC/24 cho vi khuẩn 30oC/48 nấm sợi nấm men Kết dương tính nồng độ mà khơng có vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU< Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) chất có hoạt tính: Các mẫu có hoạt tính sàng lọc ban đầu pha loãng theo thang nồng độ thấp dần từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà vi sinh vật bị ức chế phát triển gần hồn tồn Mẫu thơ có MIC ≤ 200µg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50µg/ml có hoạt tính Kết thử hoạt tính nêu phần 2.4 61 KẾT LUẬN Thực nội dung nghiên cứu phân lập chuyển hoá ent-kauran diterpenoid từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) khảo sát hoạt tính sinh học sản phẩm nhận được, luận văn thu kết sau: Đã phân lập ent-kauran diterpenoid hỗn hợp + làm chất đầu cho chuyển hóa Các chất đầu chuyển hóa vị trí nối đơi nhóm chức hidroxy cacbonyl để tạo thành dẫn xuất Đã thực thành cơng phản ứng epoxi hóa nối đơi ent-kauran diterpenoid mở vịng epoxit tạo thành nhờ thủy phân botriflorua eterat; thực phản ứng thủy phân, axetyl hóa oxi hóa ent-kauran diterpenoid thành dẫn xuất dihydroxy, diaxetyl dixeton tương ứng Cấu trúc sản phẩm chuyển hóa xác định phương pháp phổ Đã thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật với sản phẩm nhận Sản phẩm oxi hóa ent-kauran diterpenoid cho kết ức chế tốt số vi khuẩn nấm 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phan Tống Sơn (1986), Hoá học terpen terpenoid, ĐHTH Hà Nội ĐHTH Amsterdam, Amsterdam Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh (1976, 1977), Thực hành hoá học hữu (Organikum, dịch từ tiếng Đức), Tập 1, 2, Nhà xuât Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Taylor Water C (1999), “Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hố học, 37 (4), tr 57 – 59 Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1976, 1980), Cơ sở Hoá học hữu cơ, tập 1, 2, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Phan Tống Sơn, Lê Huyền Trâm, Phan Minh Giang (2002), “Đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hố học, 40, tr 53 – 57 Bế Thị Thuần, Trương Văn Như, Nguyễn Duy Khang (1991), “Góp phần nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết khổ sâm số vi khuẩn”, Tạp chí Dược học, 1, tr 16 – 17 Bế Thị Thuần, Trương Văn Như (1991), “Nghiên cứu thành phần hoá học khổ sâm thăm dò tác dụng ký sinh trùng sốt rét thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 5, tr 11 – 12 63 10 Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức (2007), Vi sinh vật thực phẩm, NXB Y học, Hà Nội 11 Trường Đại học Y Hà Nội – Bộ môn vi sinh vật (2003), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội 12 Viện dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh 13 Batista R., Braga F C., Oliveira A B (1999), “Synthesis and trypanocidal activity of ent-kaurane glycosides”, Bioorganic & Medicinal Chemistry 17, pp 381-391 14 Block S., Stevigny C., Gillet M C D P., Hoffmann E D., Uabres G., Adjakidje V., Leclercq J Q (2002), “Ent-trachylabdan-3β-ol, a new cytotocic diterpene from Croton zambesicus”, Planta Med 68, pp 647 – 649 15 Bruno M., Rosselli S., Pibiri I., Kilgore N., Lee K H (2002), “Anti-HIV agents derived from the ent-kaurane diterpenoids lineanol”, J Nat Prod 65, pp.1594 – 1597 16 Erazo S., Zaldivar M., Delporte C., Backhouse N., Tapia P., Belmonte E., Monache F D., Negrete R (2002), “Antibacterial diterpenoids from Fabiana densa var ramulosa”, Planta Med 68, pp 361 – 363 17 Phan M G., Jin H E., Phan T S., Lee J H., Hong Y S., Lee J J (2003), “entKaurane Diterpenoids from Croton tonkinensis Inhibit LPS-Induced NF-κB Activation and NO Production”, J Nat Prod 66, pp 1217 – 1220 18 Phan M G., Otsuka H., Phan T S (2005), “Three minor ent-kaur-16-ene-type diterpene from Croton tonkinensis Gagnep”, Viet nam J Chem 43 (2), pp 263 – 264 19 Phan M G., Phan T S., Lee J J., Otsuka H., Wat C Taylor (2003), “Chemical constituents and therapeutic potential of the Vietnamese medicinal plant Croton 64 tonkinensis GAGNEP (Euphorbiaceae)”, Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and Other Natural Products (ASOMPS XI), October 2003, Kunming, China 20 Phan M G., Phan T S., Lee J J., Otsuka H (2004), “Four ent-kaurane – Type Diterpenoids from Croton tonkinensis GAGNEP”, Chem Pharm Bull 52 (7), pp 879 – 882 21 Phan M G., Phan T S., Hamada Y., Otsuka H (2005), “Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis GAGNEP”, Chem Pharm Bull 53 (3), pp 296 – 300 22 Phan M G., Phan T S., Matsunami K., Otsuka H (2006), “  Anti-staphylococcal activity of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis”, J Nat Med 60, pp 93-95 23 Han L., Huang X., Sattler E., Dahse H M., Lin W., Grabley S (2004), “New Diterpenoids from the Marine Mangrove Bruguiera gymnorrhiza”, J Nat Prod 67, pp 1620 – 1623 24 Han Q B., Zhao A H., Zhang J X., Lu Y., Zhang L L., Zheng Q T , Sun H D (2003), “Cytotoxic Constituents of Isodon rubescens var lushiensis”, J Nat Prod 66, pp 1391 – 1394 25 Hanson J R (1999), Nat Prod Rep 16, pp 209 – 219 26 Jiang B., Hou A J., Li M L., Li S H., Han Q B., Wang S H., Lin Z W., Sun H D (2002), “Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon sculponeata”, Planta Med 68, pp 921 – 925 27 Jiang B., Yang H., Li M L., Hou A J., Han Q B., Wang S J , Sun H D (2002), “Diterpenoids from Isodon adenantha”, J Nat Prod 65, pp 1111 – 1116 65 28 Li S H., Niu X M., Peng L Y., Zhang H T., Yao P., Sun H D (2002), “entKaurane Diterpenoids from the Leaves of Isodon xerophilus”, Planta Med 68, pp 946 - 948 29 Marquina S., Parra J L., González M., Zamilpa A., Escalante J., María R., Laura Álvarez L (2009), “Hydroxylation of the diterpenes ent-kaur-16-en-19oic and ent-beyer-15-en-19-oic acids by the fungus Aspergillus niger” , Phytochemistry 70, pp 2017–2022 30 Minh P T., Ngoc P H., Walter C T., Cuong N M (2004), “A new ent-kaurane diterpenoid from Croton tonkinensis leaves”, Fitoterapia 75, pp 552 – 556 31 Niu X M., Li S H., Li M L., Zhao Q S., Med S X., Na Z., Wang S J., Lin Z W., Sun H D (2001), “Antiviral, Haemolytic and Molluscicidal Activities of Triterpenoid Saponins from Maesa lanceolata: Establishment of StructureActivity Relationships”, Planta Med 68, pp 528 – 533 32 Perry N B., Burgess E J., Back S H., Weavers R T., Geis W., Mauger A B (1999), “11-Oxygenated cytotoxic 8,9-secokauranes from a New Zealand liverwort, Lepidolaena taylorii”, Phytochemistry 50, pp 423 – 433 33 Phan T S., Phan M G., Taylor W C (2000), “An ent-Kaurane Diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep”,  Aust J Chem 53, pp 1003 – 1005 34 Tang W., Hemm I., Bertram B (2003), “Recent Development of Antitumor Agents from Chinese Herbal Medicines; Part I Low Molecular Compounds”, Planta Med 69, pp 97 – 108 35 Vanden Berghe D A., Vlietlinck A J (1991), Method in plant biochemsitry, ed Hosttetman K., Academic Press, London 36 Wu Y C., Hung Y C., Chang F R., Cosentino M., Wang H K., Lee K H (1996), “Identification of ent-16β,17-Dihydroxykauran-19-oic Acid as an AntiHIV Principle and Isolation of the New Diterpenoids Annosquamosins A and B from Annona squamosa”, J Nat Prod 59, pp 635 – 637 66 37 Wikens M., Alarcon C., Urzua A., Mendoza L (2002), “Characterization of the Bactericidal Activity of the Natural Diterpene Kaurenoic Acid”, Planta Med 68, pp 452 – 454 38 Xiang W., Na Z., Li S H., Li M L., Li R T., Tian Q E., Sun H D (2003), “Cytotoxic Diterpenoids from Isodon enanderianus”, Planta Med 69, pp 1031 – 1035 39 Xu L., Wang F P., (2005), “Exhaustive degradation of the ring D of 3,20-epoxy ent-kaurane-type diterpene maoecrystal A”, Tetrahedron 61, pp 4467-4474 40 Zamilpa A., Tortoriello J., Navarro V., Delgado G., Alvarez L (2002), “Antispasmodic and Antimicrobial Diterpenic Acids from Viguiera hypargyrea Roots”, Planta Med 68, pp 281 – 283 41 Zhang H., Fan Z., Tan G T., Chai H B., Pezzuto J M , Sun H., Fong H H S (2002), “Pseudoirroratin A, a New Cytotoxic ent-Kaurene Diterpene from Isodon pseudo-irrorata”, J Nat Prod 65, pp 215 – 217 42 Zhao Y., Niu X M., Qian L P., Liu Z Y., Zhao Q S, Sun H D (2007), “Synthesis and cytotoxicity of some new eriocalyxin B derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry 42, pp 494-502 67 ... 1.1 Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.) 1.1.1 Thực vật học [1, 2] Cây khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học Croton tonkinensis Gagnep thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Hình 1: Cây khổ sâm Bắc. .. NMR) 1H NMR, 13C NMR, DEPT 31 2.1.4 Điều chế phần chiết từ khổ sâm Bắc Bộ Bột khô khổ sâm Bắc Bộ ngâm chiết lần với metanol khan nhiệt độ phòng Dịch chiết metanol cất loại dung mơi xuống cịn 1/10... chiết Na2SO4 Cất loại dung môi Phần chiết diclometan (D) Dịch nước 32 2.2 Qui trình phân lập ent- kauran diterpenoid từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Để phân lập ent- kauran