Xây dựng quy trình phân tích đồng thời dư lượng kháng sinh flumequin, enrofloxacin, ciprofloxacin, sarafloxacin có trong thịt, tôm, cá bằng phương pháp lc ms

HUỲNH HUỲNH ANH THI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ HUỲNH HUỲNH ANH THI LUẬN VĂN THẠC SĨ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH FLUMEQUIN, ENROFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, SARAFLOXACIN CĨ TRONG THỊT, TƠM, CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS VÀ ỨNG DỤNG TRÊN MẪU THU THẬP TẠI KIÊN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ CẦN THƠ - 2021 Cần Thơ - 2021 HUỲNH HUỲNH ANH THI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ HUỲNH HUỲNH ANH THI LUẬN VĂN THẠC SĨ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH FLUMEQUIN, ENROFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, SARAFLOXACIN CÓ TRONG THỊT, TÔM, CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS VÀ ỨNG DỤNG TRÊN MẪU THU THẬP TẠI KIÊN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ CẦN THƠ - 2021 Cần Thơ - 2021 HUỲNH HUỲNH ANH THI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ HUỲNH HUỲNH ANH THI LUẬN VĂN THẠC SĨ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH FLUMEQUIN, ENROFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, SARAFLOXACIN CĨ TRONG THỊT, TƠM, CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS VÀ ỨNG DỤNG TRÊN MẪU THU THẬP TẠI KIÊN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ CẦN THƠ - 2021 Cần Thơ - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ HUỲNH HUỲNH ANH THI XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH FLUMEQUIN, ENROFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, SARAFLOXACIN CĨ TRONG THỊT, TƠM, CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS VÀ ỨNG DỤNG TRÊN MẪU THU THẬP TẠI KIÊN GIANG Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Độc Chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ Người hướng dẫn khoa học PGs Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Cần Thơ – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận văn Huỳnh Huỳnh Anh Thi LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Liên mơn Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất Đây nơi tơi học tập, nghiên cứu, tìm hiểu mở rộng thêm nhiều kiến thức Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô truyền đạt kiến thức chuyên môn kinh nghiệm bổ ích suốt q trình tơi học tập thực đề tài Đặc biệt, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến PGs Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người truyền thụ kiến thức trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi giải khó khăn học tập thực luận văn Cảm ơn Thầy truyền đạt kinh nghiệm quý báu đam mê nghiên cứu! Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị học viên lớp Sau đại học Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất khóa 2019-2021 quan tâm, giúp đỡ tận tình suốt thời gian qua Một lần xin gửi lời cảm ơn lời chúc sức khỏe đến Thầy, Cô anh, chị! Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận văn Huỳnh Huỳnh Anh Thi i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh tình hình sử dụng kháng sinh ni trồng thủy sản chăn nuôi thú y 1.1.1 Tính cấp thiết việc quản lý sử dụng kháng sinh 1.1.2 Thực trạng kháng kháng sinh 1.1.3 Kháng sinh chăn nuôi nuôi trồng thủy sản 1.2 Tổng quan kháng sinh nghiên cứu 1.2.1 Tổng quan kháng sinh quinolon 1.2.2 Tính chất kháng sinh cần phân tích 10 1.2.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon 14 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ba tứ cực 16 1.3.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 16 1.3.2 Đầu dò khối phổ ba tứ cực 16 1.3.3 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu ghép nối với đầu dò khối phổ ba lần tứ cực 18 1.4 Khái niệm thông số cần thiết cho thẩm định phương pháp 19 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng sắc ký lỏng phân tích dư lượng kháng sinh nhóm Quinolon 22 ii Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 28 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 29 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu thời gian nghiên cứu 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 29 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 29 2.2.3 Phương pháp chọn mẫu 30 2.2.4 Nội dung nghiên cứu 31 Chương KẾT QUẢ 46 3.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời flumequin, enrofloxacin, ciprofloxacin, sarafloxacin mẫu thịt, tôm, cá phương pháp LCMS/MS 46 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 46 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 47 3.1.3 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình tách chiết làm mẫu 49 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiễu 55 3.1.5 Độ ổn định 55 3.1.6 Quy trình chuẩn bị mẫu thích hợp 58 3.2 Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn EC 657/2002 AOAC 2002 59 iii 3.2.1 Thẩm định quy trình phân tích 59 3.3 Ứng dụng quy trình thẩm định phân tích dư lượng kháng sinh flumequin, enrofloxacin, ciprofloxacin, sarafloxacin mẫu thịt, tôm, cá Kiên Giang 73 Chương 75 BÀN LUẬN 75 4.1 Xây dựng quy trình định lượng 75 4.1.1 Điều kiện khối phổ 75 4.1.2 Điều kiện sắc ký 80 4.1.3 Quy trình xử lý mẫu 84 4.2 Thẩm định quy trình phân tích 90 4.3 Ứng dụng quy trình thẩm định phân tích mẫu thịt, tôm, cá thị trường 92 KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO x PHỤ LỤC xxiv iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Giới hạn cho phép kháng sinh quinolon theo EC No.1181/2002 15 Bảng 1.2 Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 8/VBHNBNNPTNT 15 Bảng 1.3 Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon QĐ 46/2007/BYT 16 Bảng 1.4 Các nghiên cứu nước giới ứng dụng sắc ký lỏng phân tích kháng sinh quinolon 22 Bảng 2.1 Độ thu hồi cho phép khoảng nồng độ khác 42 Bảng 2.2 Số lượng đối tượng mẫu địa điểm lấy mẫu 43 Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ tối ưu 46 Bảng 3.2 Chương trình gradient pha động 48 Bảng 3.3 Kết quy trình xử lý mẫu mẫu 54 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mẫu đến chất phân tích 55 Bảng 3.5 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc 55 Bảng 3.6 Độ ổn định dịch chiết mẫu trắng thêm chuẩn 57 Bảng 3.7 Kết tính tương thích hệ thống 59 Bảng 3.8 Độ lệch chuẩn thời gian lưu chất phân tích 60 Bảng 3.9 Sai khác tỷ lệ ion chất phân tích 60 Bảng 3.10 Số điểm nhận diện IP chất phân tích 61 Bảng 3.11 Tính tuyến tính chất phân tích mẫu 63 Bảng 3.12 Kết phân tích giới hạn phát giới hạn định lượng 65 Bảng 3.13 Kết độ lặp lại nồng độ 67 Bảng 3.14 Kết độ tái lặp nồng độ 69 Bảng 3.15 Kết độ thu hồi chất mẫu 70 Bảng 3.16 Kết đánh giá độ không đảm bảo đo 71 Bảng 3.17 Tổng hợp kết thẩm định quy trình phân tích 72 Bảng 3.18 Kết phân tích mẫu thực tế 73 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo chung kháng sinh nhóm quinolon Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo flumequin 10 Hình 1.3 Phổ đồ flumequin theo Thư viện phổ châu Âu 11 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo enrofloxacin 11 Hình 1.5 Phổ đồ enrofloxacin theo Thư viện phổ châu Âu 12 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo ciprofloxacin 12 Hình 1.7 Phổ đồ ciprofloxacin theo Thư viện phổ châu Âu 13 Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo sarafloxacin 13 Hình 1.9 Phổ đồ sarafloxacin theo Thư viện phổ châu Âu 14 Hình 1.10 Sơ đồ khối đầu dị khối phổ ba lần tứ cực 17 Hình 2.1 Phương pháp xử lý mẫu 36 Hình 2.2 Phương pháp xử lý mẫu 37 Hình 3.1 Kết tổng hợp từ auto-tune 47 Hình 3.2 Kết auto-tune (a) manual-tune (b) sarafloxacin 47 Hình 3.3 SKĐ mẫu hỗn hợp chuẩn ENR, CIP, SAR, FLU mẫu trắng điều kiện khối phổ tối ưu sắc ký thích hợp (gradient 3) 49 Hình 3.4 Độ thu hồi chất loại tạp n-hexan 50 Hình 3.5 Kết khảo sát nồng độ acid formic 51 Hình 3.6 Kết khảo sát tỷ lệ lượng mẫu/dung môi chiết mẫu 52 Hình 3.7 Kết khảo sát thời gian ngâm lạnh 53 Hình 3.8 Phổ đồ daughter scan mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp 62 Hình 3.9 Phương trình hồi qui tuyến tính sarafloxacin (a), ciprofloxacin (b), enrofloxacin (c) flumequin (d) mẫu cá 64 Hình 3.10 Giới hạn phát giới hạn định lượng ciprofoxacin (a), enrofloxacin (b), sarafloxacin (c) flumequin (d) 66 vi Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu cá CB10 (a), CB8 (b), mẫu thịt heo TH4 (d), mẫu gà G1 (f) chứa ENR mẫu thịt bò TB5 (c), mẫu thịt heo TH2 (e) chứa FLU 74 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 Masslynx 4.1 để tối ưu hóa điều kiện khối phổ để thu ion mẹ phân mảnh chế độ MRM (multi-reaction montoring) có cường độ tín hiệu tối ưu kháng sinh cần phân tích với thơng số khối phổ cần khảo sát: ES+ hay ES-, mao quản, cone, tốc độ dịng khí phun (source gas flow), nhiệt độ buồng ion hóa, nhiệt độ khí bay (desolvation temp), tốc độ dịng khí bay (desolvation gas flow), lượng va đập (collision energy) Dựa vào cấu trúc hóa học kháng sinh nghiên cứu, kỹ thuật sắc ký pha đảo áp dụng với hệ dung môi phân cực bao gồm acetonitril, methanol, nước có thêm khơng thêm chất điều chỉnh pH acid formic, acid acetic băng (< 0,1%) để khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu tách đồng thời kháng sinh mẫu thử giả lập + Thẩm định quy trình theo EC 657/2002 - Độ đặc hiệu - chọn lọc: Đánh giá sai khác thời gian lưu chất phân tích mẫu thử so với mẫu chuẩn phải 2,5%, sai khác tỷ lệ ion 20%, khơng điểm xác nhận theo EC - Tính tuyến tính: Xây dựng đường tuyến tính với điểm mức nồng độ 10%, 25%, 50%, 80%, 100%, 120%, 150%, 200% giá trị MRL chất (với MRL SAR: 10 ppb; CIP: 100 ppb; ENR: 100 ppb; FLU: 500 ppb) - Độ đúng, độ xác: thực mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ 80%, 100%, 120% giá trị MRL; nồng độ thực mẫu; thực thời điểm khác nhau, tổng cộng 63 mẫu Đánh giá dựa độ lệch chuẩn tương đối độ thu hồi chất phân tích - Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ): pha lỗng tìm giá trị nồng độ chất thỏa mãn tương ứng S/N ≥ S/N ≥ 10; nồng độ xác nhận LOD LOQ thỏa mãn độ đặc hiệu - chọn lọc + Ứng dụng quy trình phân tích: Ứng dụng quy trình thẩm định phân tích 10 mẫu tơm thu thập siêu thị thành phố Rạch Giá – Kiên Giang III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xây dựng quy trình định lượng - Điều kiện khối phổ tối ưu: chế độ MRM xác định hai ion sản phẩm ứng với chất Ion có tín hiệu cao ổn định chọn làm ion định lượng, ion cịn lại dùng để định tính Các thơng số khối phổ tối ưu trình bày Bảng Bảng Kết khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu phân tích chất Chất phân tích Kiểu ion hóa ESI ENR m/z ion mẹ 360,06 CIP 332,03 ES+ SAR 386,02 FLU 261,98 m/z ion 245 316 245 288 299 342 202 244 Nhiệt độ khí bay (oC) Tốc độ dịng khí bay (l/h) Thế cone (V) Thế mao quản (kV) 1000 35 35 40 40 42 42 30 30 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 500 Năng lượng va đập (V) 25 25 25 20 26 20 30 18 Ghi định tính định lượng định tính định lượng định tính định lượng định tính định lượng Nhận xét: Các chất phân tích đảm bảo có mảnh (1 mảnh định tính mảnh định lượng) đáp ứng đủ điểm IP theo EC Các chất phân tích điều kiện tín 47 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 hiệu tối ưu mảnh - Điều kiện sắc ký thích hợp: Pha tĩnh: Cột GL InertSustainTM C18 (4,6 x 250 mm, µm) Pha động: acetonitril - nước acid formic pH=3,0 theo chương trình gradient trình bày Bảng Thể tích tiêm mẫu: 10µL Tốc độ dịng: mL/phút Bảng Gradient pha động thích hợp Thời gian (phút) 2,0 2,1 5,2 5,3 9,0 9,1 11 Tốc độ dòng (mL/phút) 1 1 1 1 ACN 5 20 40 65 80 5 Nước acid formic pH = 3,0 95 95 80 60 35 20 95 95 Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn kháng sinh điều kiện thích hợp Quy trình xử lý mẫu thích hợp Sau tham khảo nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu tiến hành xử lý mẫu theo quy trình: chiết acetonitril có acid hóa acid formic 5%, loại nước muối natri sulfat khan magie sulfat khan, bay dịch chiết khí nitơ hịa lại vào dung môi acetonitril : nước (1:1), dịch chiết làm lạnh lọc qua màng lọc 0,22 µm để loại chất phân cực Quy trình sử dụng để thẩm định tiến hành áp dụng mẫu thực Quy trình xử lấy mẫu thích hợp trình bày sơ đồ Hình 48 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 2,0 ± 0,1 g mẫu vào ống ly tâm 50ml + 3,0 ml acetonitril chứa 5% acid forrmic Lắc vortex phút + 0,48 g NaCl Lắc vortex phút + 1,6 g Na2SO4 khan + 0,2 g MgSO4 khan Lắc vortex phút Ly tâm 5000 vòng/phút x phút Lấy 1,5 ml dịch phía Bay dung mơi 40oC Hòa tan vào ml acetonitril : nước (1:1) Làm lạnh đá 30 phút Lọc qua màng lọc 0,22 µm Vial Hình 2: Quy trình xử lý mẫu thích hợp Thẩm định quy trình phân tích theo EC 657/2002 - Độ đặc hiệu – chọn lọc: Bảng Độ đặc hiệu – chọn lọc chất phân tích Chất phân tích Sai khác thời gian lưu (%) Sai khác tỷ lệ ion (%) Số điểm IP SAR 0,12 0,72 CIP 0,08 5,29 ENR 0,1 1,62 FLU 0,09 1,49 Nhận xét: Các chất phân tích đáp ứng yêu cầu sai khác thời gian lưu (≤ 2,5%), sai khác tỷ lệ ion (≤ 20%) đạt số điểm IP (≥ 4) Do đạt độ đặc hiệu – chọn lọc (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3: Sắc ký đồ mẫu dung mơi pha động (a), dung môi pha mẫu (b), mẫu trắng (c), mẫu chuẩn (d), mẫu trắng thêm chuẩn (e), mẫu trắng thêm chuẩn lần (f) CIP 49 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 - Tính tuyến tính đường chuẩn, LOD, LOQ: Bảng Khoảng tuyến tính, phương trình hồi quy, LOD, LOQ Chất phân tích CIP ENR SAR FLU Phương trình hồi quy y = 191,071x + 65,5031 y = 614,418 x – 1443,5 y = 426,848x – 395,249 y = 2123,84x – 9534,57 Khoảng tuyến tính (ppb) 10 - 200 10 - 200 - 20 50 - 600 Hệ số tương quan (r2) 0,995 0,997 0,990 0,997 LOD (ppb) 0,5 0,03 0,125 0,3 LOQ (ppb) 1,5 0,125 0,5 1,5 Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát kháng sinh đạt tính tuyến tính với giá trị R2 > 0,99 với khoảng tuyến tính bao phủ giá trị MRL (SAR: 10 ppb; CIP: 100 ppb; ENR: 100 ppb; FLU: 500 ppb), giá trị LOD (0,03-0,5ppb) LOQ (0,125-0,5ppb) đặc trưng cho phân tích khối phổ, nên đáp ứng yêu cầu ứng dụng cho mẫu thực tế để xác định dư lượng chất (b) (a) (d) (c) Hình 4: Đường tuyến tính của CIP (a), ENR (b), SAR (c) FLU (d) truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1 - Độ đúng, độ xác ngày liên ngày: Bảng Độ đúng, độ xác ngày liên ngày Chất phân tích SAR CIP ENR FLU Nồng độ thêm chuẩn (ppb) 10 12 80 100 120 80 100 120 400 500 600 Ngày (n=7) TB RSD (%) Thu hồi (%) 7,87 9,28 10,89 80,26 95,91 110,04 75,34 89,70 106,19 382,14 485,87 580,62 2,89 5,64 4,95 6,81 4,74 5,21 4,87 3,54 6,91 3,56 4,35 4,66 98,42 92,84 90,76 100,04 95,91 91,70 94,17 89,70 88,49 95,54 97,17 96,77 Ngày (n=7) TB RSD (%) Thu hồi (%) 7,66 9,20 11,18 79,60 93,63 116,90 78,83 92,04 107,12 401,12 480,07 593,84 4,72 4,17 2,88 2,58 7,50 5,07 4,94 5,48 7,26 2,26 3,75 2,89 95,72 92,04 93,20 99,50 93,63 97,41 98,53 92,04 89,27 100,28 96,01 98,97 Ngày (n=7) Thu RSD hồi TB (%) (%) 7,68 9,61 11,77 80,45 96,38 116,75 74,64 91,32 105,07 368,89 453,53 581,68 4,73 3,87 3,55 1,84 4,96 3,73 5,34 4,32 4,65 5,78 4,45 5,68 95,96 96,07 98,07 100,56 96,38 97,29 93,30 91,32 87,56 92,22 90,71 96,95 %RSD ngày (n=21) 4,17 4,77 4,94 4,14 5,69 5,30 5,39 4,44 6,12 5,21 5,01 4,43 Nhận xét: Các giá trị độ thu hồi trung bình chất CIP, ENR, SAR FLU nằm khoảng 80-110% giá trị RSD < 23% đáp ứng yêu cầu EC Ứng dụng quy trình thẩm định để phân tích mẫu tơm Phân tích 10 mẫu tơm thu thập siêu thị địa bàn tỉnh Kiên Giang cho kết không phát mẫu có tồn dư dư lượng kháng sinh CIP, ENR, SAR FLU 50 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 Hình 8: Sắc ký đồ phân tích mẫu T8 IV BÀN LUẬN Điều kiện khối phổ sắc ký thích hợp Các mảnh định tính định lượng chất phân tích phù hợp với nghiên cứu cơng bố [3][6] Cấu trúc đặc trưng chất phân tích phù hợp với kiểu ion hóa dương (ES+) Các thơng số khối phổ tối ưu hóa để tín hiệu mảnh ghi nhận cao Thực nghiệm cho thấy tín hiệu chất tăng theo nhiệt độ dịng khí bay tốc độ dịng khí bay hơi, tối ưu giá trị 500oC 1000 L/giờ Do cấu trúc tương tự nhau, nên cone phù hợp để bắt ion nằm khoảng 30V đến 40V, giá trị không đủ mạnh để hướng chất vào cone sample, giá trị tín hiệu tăng cao bắt chất gây nhiễu Hệ pha động rửa giải sắc ký khảo sát Loại pha động methanol cho píc tín hiệu thấp chân píc rộng [11], với pha động nước (khơng có chất điều chỉnh pH), flumequin cho píc đẹp, cân đối, nhiên chất sarafloxacin, enrofloxacin ciprofloxacin lại kéo đuôi nhiều không chuyển dạng hồn tồn Phân tích đồng thời chất đầu dị khối phổ khơng u cầu tách chất sắc ký đồ tổng (TIC), nhiên để tăng tín hiệu chất giảm nhiễu nền, từ tăng độ nhạy phương pháp, nhóm nghiên cứu thực rửa giải gradient để tách hoàn toàn chất cột đảm bảo píc cân đối thời gian mũi tiêm không dài Quy trình xử lý mẫu Phương pháp xử lý mẫu phổ biến phân tích mẫu thực phẩm sử dụng chiết pha rắn (SPE) [6][10] Tuy nhiên, ứng dụng chiết pha rắn bị hạn chế loại chất hấp thụ đặc tính thành phần mẫu, vật liệu chiết pha rắn đóng gói chặt làm tăng thời gian chiết gây áp suất ngược [7] Để khắc phục nhược điểm thời gian chiết kéo dài dễ mẫu sử dụng SPE, nhiều nghiên cứu sử dụng chiết lỏng – lỏng với n-hexan để loại tạp phân cực [1][11] Kết phương pháp cho độ thu hồi tốt hơn, nhiên vấn đề lớn dung môi loại tạp n-hexan độc hại, ảnh hưởng sức khỏe người mơi trường Bên cạnh đó, kỹ thuật chiết lỏng – lỏng không loại bỏ n-hexan tạp phân cực gắn chặt bền mặt C18 gây tắc cột Vấn đề lớn xử lý mẫu thực phẩm nói chung mẫu tơm nói riêng loại bỏ tạp phân cực chất béo Trong thành phần đáng quan tâm mẫu tôm astaxanthin (chất tạo nên màu đỏ tơm nấu chín), carotenoid phân cực không loại bỏ tốt dễ làm dơ cột ảnh hưởng hình dạng píc chất phân tích [8] Thành phần lại dễ dàng đông đặc nhiệt độ thấp tương tự chất béo Vì nhóm nghiên cứu ứng dụng tính chất để đơng đặc tách 51 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 tạp chất khỏi mẫu phân tích Các thơng số tỷ lệ dung môi chiết, pH dung môi chiết, thời gian ngâm lạnh, khảo sát để tối ưu độ thu hồi chất Quy trình chiết làm mẫu khơng cho độ thu hồi cao mà cịn chứng tỏ ưu điểm nhanh, tiết kiệm dung môi, thân thiện với mơi trường an tồn cho người thực V KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời dư lượng kháng sinh CIP, ENR, SAR FLU tôm phương pháp LC-MS/MS Quy trình định lượng thẩm định đạt theo hướng dẫn AOAC, EC 2002 Quy trình phân tích có tính chọn lọc, xác, tin cậy cao với phương pháp xử lý mẫu nhanh, tiết kiệm, thân thiện môi trường độ thu hồi cao Quy trình ứng dụng vào thực tế để kiểm tra 10 mẫu tôm Kiên Giang Kết phân tích 10 mẫu tơm thị trường khơng phát mẫu chứa dư lượng kháng sinh CIP, ENR, SAR FLU TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thanh Trúc, Trần Thị Như Trang (2013), “Phân tích đồng thời kháng sinh quinolone thịt, tôm, cá phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ”, Tạp chí Phát triển KH&CN, 16(2), tr.39-46 AOAC International (2002), “AOAC Guidelines for Single Laborator Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals”, Section 3.3, 3.4.1, 3.4.2, 3.4.6, pp.18-22 Bortolotte, A R., Daniel, D., de Campos Braga, P A., & Reyes, F G R (2019) A simple and high-throughput method for multiresidue and multiclass quantitation of antimicrobials in pangasius (Pangasionodon hypophthalmus) fillet by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry Journal of Chromatography B, 1124, 17-25 Braun, G., Braun, M., Kruse, J., Amelung, W., Renaud, F G., Khoi, C M., Sebesvari, Z (2019) Pesticides and antibiotics in permanent rice, alternating rice-shrimp and permanent shrimp systems of the coastal Mekong Delta, Vietnam Environment international, 127, 442-451 European Union (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results Lu, Z., Deng, F., He, R., Tan, L., Luo, X., Pan, X., & Yang, Z (2019) A pass-through solidphase extraction clean-up method for the determination of 11 quinolone antibiotics in chicken meat and egg samples using ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry Microchemical Journal, 151, 104213 Saha, S., Singh, A K., Keshari, A K., Raj, V., Rai, A., & Maity, S (2018) Modern extraction techniques for drugs and medicinal agents Ingredients extraction by physicochemical methods in food, pp.65-106 Soumya, R., & Sachindra, N M (2015) Carotenoids from fishery resources Fish processing byproducts: quality assessment and applications Studium Press, Houston, 273-298 Ström, G H., Björklund, H., Barnes, A C., Da, C T., Nhi, N H Y., Lan, T T., Boqvist, S (2019) Antibiotic Use by Small‐Scale Farmers for Freshwater Aquaculture in the Upper Mekong Delta, Vietnam Journal of aquatic animal health, 31(3), 290-298 11 Priyanka, V J J., Chauhan, S L., & Garg, S R (2019) Analysis of Quinolones Residues in Milk using High Performance Liquid Chromatography Int J Curr Microbiol App Sci, 8(2), 3049-3058 12 Saxena, S K., Rangasamy, R., Krishnan, A A., Singh, D P., Uke, S P., Malekadi, P K., & Gupta, A (2018) Simultaneous determination of multi-residue and multi-class antibiotics in aquaculture shrimps by UPLC-MS/MS Food chemistry, 260, 336-343 (Ngày nhận bài: 15/8/2021 - Ngày duyệt đăng: 20/9/2021) 52 CoNG HOA XA HoICHU NGHIA VIη T BOYTE ｀ Doc lap‐ ■r do‐ Hanh phic TRIJONG DAI HOC Y DUqC NAlヽ 4〔 CAN THO ′ ′Й l■ _ S6:皮■ヽ〃QD― DHYDCT Cin Tho', ,gdyJ5 thdng 11 ndm 2(]41 QUYET DINH v/v lap IIoi d6ng dinh gね luan v】 n Thac si chuyen nganh K1611l nghielll thu6c v】 doc chat cho h9c vien IIuynh IIuynh Anh Thi HIEU TRIJ6NG TRJONG DAI HOC Y DJOC CÅ N THσ 4g″ 25`笏 賀 ′24′ ′ π 2θ θ2 ι 動 ブ 'α r″ ∂ 71g Cカ ルカ′滋 ν ινJと ′ ′ 2′ れ た′ ″ ルタう,g Dα ブカOι yD″0で C′ ″rZO丁 C″ ″ι′ ∂′g`″ S∂ ′5/2θ ア イ/r■βGDDrれ gて ′5/5/2θ ′イι′αB∂ ″勘 gβ ∂ G7i′ c′ ″ι ′ 2ク ∂ ″′力 Sδ ご∂イ″θθ2/8D― rrg `、 グレ `ν a I)′ 。 ιヵ′ o νινブ ′ιらα′ ,′,a″ ヵ?′ ′ `力 'ッ たグ iδ 7:7,α o rr,れ ia。 `′ `α ′みS∂ ノイθ2/CD― D〃yDCr7,gaッ θ5″ 9″ θ′9ι ′αルグδ g Dα ノ乃Oι `済 '0`(〕 1/ヱ フ ン ′77777σ ッιν′ ιοε∂″g′ Й′77`′ ′暉 :ッ ∂777‐ 力αC S'れ ′れ 2θ ′91 X6t dO nghi cta TlT6ng phOng Dao tao`“ Sau Dai hoc `s7「 `ブ Ca″ ι′`α2クッι r QUYETDINⅡ ″ : :、 DiOu l.Thanh lap H6i dOng danh gi`luan vttn Thac si cho hoc vien: Ho vatOn::【 Iuynh i【 Iuynhノ 生 nh′ rlll lヽTgay sinh:06/03/1994 Chuyen nganh:K16m nghiom thu6c vう doc chat iK:h6a:2019-2021 ・ Ton luan vこ n:“Ⅳgヵ ′ ι″ι′,″ χ′ y″夕 ′ ″ン rr,″ ″′ル′″ご ヵ″∂″g/ル δヴ″″′′ g ″.″″ `g夕 ・ た 滋″ gS′「 ′ Й′ ″び ″ ο ′ ′ ′ ″ι ο g/力 あ あ″,`′ `ι ″ g′ 力″ ο ο ′ ο ′ ″ ο ″g′ ″ク Z62″ ′ 'F7″ iイS,4イ iS" `″ "′ Can b6 hu61lg dan: 1.PCS.TS.D10 ChauルIinhヽ石nh Tho II)al■ l sich cac vienih6i dong g6nl: 1.PGS.TS.Duoη g Xuan Chi Chi tich PGS.TS.V6Thi Bach IIue Phan bien l 3.PGS.TS.NguyOn Thi Ngoc Van 4.GS.TS.NguyOn Dic Tuan 5.TS.Huシ nh Thi M,DuyOn Phan biOn Uy viOn Uy vien― Thu k′ I)iOu I16i d6ng c6 nhi61m_vu danh gi` luan vhn.1｀ hac si chuyOn nganh llielll ′ nghioll.thuoc va d6c cllat theo qlly cho dぅ 。ta。 hac si cta:B6(]i`。 dllc vを IDao tao va 「 tl.gi△ itin sau](lli h。 さ n tl:lanll l.1lienl vu DiOu 3.C`c Olng(Ba)Tl「 u16ng Phё ng IIanll chinh t6ng hgp,Tru:ollg Phё ng Dlao tao sau dai hoc,′ I,1 。・ ng Phも ng`rai chinh ko toin,1ヽ hi tru。 1lg cac dom_vi lien quan vさ cic thを 1lh vion I― 16i d6ng dinh gi`luan vhn Iヽ hac si chiu trach nhienl thi hanh quyet dlll:[1 1laly.ル / :ジ ノ Vο ′″Й′ ″f ―Nhtl diOu PSDH NG TRL「 む ￨ ０ ゛ -Luu:V■ U TRTIONG Ool H,C V DJCC CAN TH` y On Trung iKliOn i eQvrE rmloNc DAr Hec v urlQc cAN rHo CQNG HOA XA HQI CHU NGHIA VIET NAM DQc lflp - TU - H4nh phric Cin Tho, ngdy f thirng i& ndm 20*.1 BIEN BAN CUA HOI DONG CHAM LUAN VAN THA.C Si Hq tOn hsc vi6n: rruYNu HUVNH ANH THI pC tai: "Ngltiin ct?u xLy clltng quy trinh phA\ ilch iting thd'i efu fugrtg kltting sfult nhdm Fluoroquinolon cd tlrlt, tdm, cci bdttg pltrong pltrip LC-MS/trIS" Ngudi hucrng ddn: PGS.TS E6 Chdu Minh Vinh Thq Chuy6n ngdnh: Ki6m nghiQm thu5c vd dQc ch6t Dugc c6ng nhqn Id hgc vi6n Th4c si theo Quyi5t dinh s6 L4}21QE-EHYDCT ngdy 05/09l2)lg cira HiQu trucrng Truong D4i hgc Y Dugc CAn Tho r HQr o6xc cHANr LUaN VAN Cdn cri ciic quy dlnh ctra B0 Gi6o dpc vd Ddo t4o, B9 Y t6 vO viQc t6 chfc ch6m lufln vdn Th4c si, HiQu trucrng Truong D4i hgc Y Dugc CAn Tho dd quytlt dinh thdnh lflp HQi d6ng ch6m ludn vdn sO 2QO-DHYDCT ngity /20 ., g6m c6c thdnh vi6n sau: TT a Hg vdr t6n PGS.TS Ducrng Xudn Cht PGS.TS Vo Thi B4ch HuQ PGS.TS Nguy6n ThiNgqc V6n GS.TS Nguy6n Dric Tu6n TS Huj,nh Thi My Duy6n J Trfch nh i0m ,l HQi O0ng Chri tich Phan bi6n Phan bien Uy viOn Uy viOn - Thu ky guOi ch6m ludn vdn dugc ti6n hdnh vdo hic gid phft ngdy { l.U.l.W.l t?i W : Truong Dai hqc Y Dugc CAn Tho Vdng mat: D Cb mat: thdnh vi6n hQi II NQI DUNG BIflN gAN: d6ng Dai diQn Phdng Edo t4o sau dpi hgc dgc quytit dinh lflp HQi d6ng ch6m lu4n vdn Th4c si ctra Trudng Dai hgc Y Dugc CAn Tho, c6ng b6 phan Uqi AOng dAm bio di6u kien di5 Hgi d6ng ldm viQc Chntich HQi d6ng: PGS.TS Ducrng XuAn Chir di6u khiOn bu6i ch6m lufln v5n Uy vi6n thu ky dgc ly lich khoa hgc, bing di6m todn kh6a cria hgc vi6n vd khAng dinh hqc vi6n ddm bno dAy du chuong trinh ddo t4o Hgc vi6n trinh bdy luQn vdn thoi gian kh6ng qu6 15 phirt Phan biqn 1: PGS.TS V0 Thi Bach HuQ dgc nhQn xdt (dinh kdm bin nh4n x6t) Phan biQn 2: PGS.TS Nguy6n ThiNgqc Vdn dsc nh4n x6t (dinh kdm b6n nh4n x6t) ThAnh vion HQi d6ng P H 73., ,NA,,6X vi ngudi tham dg d{t c6u h6i hoflc phrit bi6u;f kitin: :/l* A*o* q qD r* il- * ek "qt C/"|,A di n g1 -/8 /# rhk zr^?, ,G, f{''* rte fl.1 &: Nk, sh (/ t* fy.th ,* d t.e /14.(/ t4t w :.-y.,nrZ,* ,(*e" ui dl.o { 7.f,'{r ,{r9," Aq :ffir v; d-L d; ./.6r:' *t .r.{,u ,,1o * # d :lt.,o\ ,,.,{t,,, k *" &; dy r.il* sof: .ut r*{ Aur ""L' 6e: @,d' dt tG tvt A kt il dr* ".,.c a d1 {h (t .a) .r[ *,:,.nr*:, (,; rrut {, rgo'