Nghiên cứu xây dựng và ứng dụng quy trình phân tích đồng thời một số chất bảo quản trong da bằng phương pháp LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ BĂNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT BẢO QUẢN TRONG CÁC SẢN PHẨM DA BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ BĂNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT BẢO QUẢN TRONG CÁC SẢN PHẨM DA BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC/MS/MS CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội, năm 2015 LỜI CẢM ƠN Với long biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm one PGS.TS Nguyễn Văn Ri tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành Luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Da Giầy anh chị đồng nghiệp cơng tác Trung tâm Phân tích Công nghệ Môi trƣờng – Viện Nghiên cứu Da giầy tạo điều kiện tốt cho đƣợc học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giảng dạy Khoa Hóa học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tập thể lớp cao học K24 giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu trƣờng Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè – ngƣời ln động viên, khuyến khích cổ vũ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Lê Thị Băng MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ngành thuộc da chất bảo quản sử 1.2 Tổng quan chất bảo quản 1.2.1 2-(thiocyanomethylthio)-benzothiazole (TCMTB) 1.2.2 4-chloro-3-methylphenol (PCMC) 1.2.3 2-octylisothiazol-3(2H)-one (OIT) 1.2.4 2-phenylphenol (OPP) 1.3 Tổng quan kỹ thuật phân tích chất bảo OIT OPP sản phẩm da thuộc CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích 2.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp 2.2.4 Phân tích mẫu thực 2.3 Hóa chất – Thiết bị 2.3.1 Hoá chất 2.3.2 Thiết bị phân tích 2.3.3 Thiết bị phụ trợ CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xây dựng phƣơng pháp phân tích chất bảo quản da thiết bị LCMS/MS 3.1.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu cho thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 18 3.1.2 Khảo sát điều kiện tối ƣu trình chuẩn bị mẫu 32 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng dung môi chiết 33 3.1.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng số lần chiết 34 3.1.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết 35 3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp phân tích 38 3.2.1 Độ chọn lọc 38 3.2.2 Độ thu hồi 39 3.2.3 Độ chụm 42 3.2.4 Giới hạn phát (MDL) giới hạn định lƣợng phƣơng pháp (MQL) 46 3.2.5 Khoảng tuyến tính 47 3.3 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích nghiên cứu vào phân tích số sản phẩm da lƣu hành thị trƣờng Việt Nam 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 57 PHỤ LỤC 1: ĐƢỜNG CHUẨN XÁC ĐỊNH 04 CHẤT BẢO QUẢN BẰNG HỆ THỐNG HPLC-MS/MS 58 PHỤ LỤC 2: SẮC ĐỒ TIÊU BIỂU HPLC-MS/MS CỦA 04 CHẤT BẢO QUẢN 61 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU DA TRÊN THỊ TRƢỜNG 68 PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN BẰNG HỆ HPLC – MS/MS 75 DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Tên đầy đủ Atomic Absorption Spectrophotometric Association of Official Agricultural Chemists Bureau Veritas Quality International Comité Européen de Normalisation Consumer Product Safety Improvement Act Diode Array Detector Deutsches Institut für Normung European Commission European Economic Community 10 Electron Spray Ionization 11 Gas Chromatography 12 High Performance Capillary Electrophoresis 13 High Performance Liquid Chromatography 14 Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry 15 International Standard Organization 16 International Union of Pure and Applied Chemistr 17 Limit of Detector 18 Limit of Quantitation 19 Method Detector Limit 20 Method Quantification Limit 21 Mass Spectrography 22 Organisation for Economic Co-operation and Dev 23 2-octylisothiazol-3(2H)-one 24 2-phenylphenol 25 4-chloro-3-methylphenol 26 Registration Evaluation Authorization Restriction 27 Recovery Standard Deviation 28 Shoe and Allied Trades Research Association 29 Tiêu chuẩn Việt Nam 30 Thin Layer Chromatography 31 2-(thiocyanomethylthio)-benzothiazole 32 Văn phịng Cơng nhận Chất lƣợng DANH MỤC HÌNH VẼ STT Tên hình Hình 1.1: Sơ đồ tổng qt quy trình cơng Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo TCMTB Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo PCMC Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo OIT Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo OPP 10 11 12 Hình 2.1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu phổ kép HPLC-MS/MS Hình 3.1: Phân tích sắc ký chất bảo qu Hình 3.2: Phân tích sắc ký chất bảo qu Gold aQ Hình 3.3: Phân tích sắc ký chất bảo qu Gold PFP Hình 3.4: Phân tách chât bảo quản trê pha động A-H2O (0,1% FA) B-ACN Hình 3.5: Phân tách chât bảo quản trê pha động A-H2O B-MeOH Hình 3.6: Phân tách chât bảo quản trê 13 pha động A-H2O B-ACN Hình 3.7: Các thơng số cần tối ƣu hóa ch 14 Hình 3.8: Các thơng số cần tối ƣu hóa ch 15 Hình 3.9: Phổ khối tiêu biểu TCMTB 16 Hình 3.10: Tối ƣu hóa detector MS-MS c 17 Hình 3.11: Tối ƣu hóa detector MS-MS c 18 Hình 3.12: Phổ khối tiêu biểu OPP 19 Hình 3.13: Tối ƣu hóa detector MS-MS c 20 Hình 3.14: Thời gian lƣu chất bả 21 Hình 3.15: Ảnh hƣởng dung mơi chiế 22 Hình 3.16: Ảnh hƣởng số lần chiết đế 23 Hình 3.17: Ảnh hƣởng thời gian chiế 24 25 26 27 Hình 3.18: Quy trình xử lý mẫu da phân t HPLC-MS/MS Hình 3.19: Sắc đồ mẫu da trắng m bảo quản Hình 3.20: Khoảng tuyến tính phƣơn Hình 3.21: Đƣờng chuẩn PCMC tron 10,0 mg/L mẫu da blank   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học Mẫu da Mauda6_5ul Relative Abundance RT: 0.00 - 15.02 SM: 15G 100 95 90 85 Relative Abundance 80 75 1.49 70 65 60 0.11 0.85 Relative Abundance 55 0.54 1.20 2.03 50 45 40 Mauda6_5ul #1 RT: 0.00 Relative Abundance T: + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] 100 90 80 70 60 50 40 Relative Abundance 30 20 10 101.6 Mẫu da 8: RT: 0.00 - 3.72 100 99 98 SM: 15G 80 75 70 1.29 65 60 0.58 55 1.11 0.23 50 Mau da9_5ul #1 T: 100 RT: 0.00 AV: 1 NL: 6.95 + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] 101.69 90 80 70 60 50 40 30 102.45 20 10 101.6 Time (min) M ẫ u d a : Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 71   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học 10 Mẫu da 10 Mauda_10 Relative Abundance RT: 0.00 - 15.01 SM: 15G 100 95 90 85 80 Relative Abundance 75 70 65 0.61 1.61 1.30 60 55 Relative Abundance Mauda_10 #1 T: RT: 0.01 AV: 1 NL: 5.96 + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] 101.68 100 90 80 70 60 Relative Abundance 50 40 102.38 30 20 10 101.6 11 Mẫu da 11 Mauda11_5ul RT: 0.00 - 15.01 SM: 15G Relative Abundance 100 90 80 70 60 Relative Abundance 50 40 30 20 10 0.44 Mauda11_5ul #1 T: 100 90 80 RT: 0.00 AV: NL: 7.22 + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] 101.70 0.78 1.27 70 60 50 40 30 20 10 101.6 12 M ẫ u d a M a u d a _ ul # R T: 0 A V : N L: 8 T: +c E SI S R M m s2 0 [1 01 0] 101.70 10 90 80 70 60 50 40 30 20 10 101.6 Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 72   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học 13 Mẫu da 13 Mauda13_5ul SM: 15G Relative Abundance RT: 0.00 - 15.02 100 90 80 Relative Abundance 70 60 50 40 30 20 10 0.64 0.85 Relative Abundance 1.48 Mauda13_5ul #1 RT: 0.00 AV: T: + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 101.6 14 Mẫu da 14 Mauda14_2,5ul RT: 0.00 - 15.01 SM: 15G 100 90 80 70 60 50 40 30 1.23 0.65 20 Mauda15_2,5ul #1 RT: 0.00 AV: T: + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] NL: 2.20E3 102.00 100 M a u d a _ , u l # R T : 0 A V : N L : E T : + c E S I S R M 90 Relative Abundance 80 60 50 40 30 20 10 101.6 Luận văn Thạc sỹ Băng Lê Thị 73 m s 2 0 [ 1 0 0 ] 100 70 1 70 60 50 40 30 20 Relative Abundance 10 15 M Mauda15_2,5ul   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học 16 Mẫu da 16 Mauda16_2,5ul RT: 0.00 - 15.02 SM: 15G Relative Abundance 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.16 0.44 1.25 Mauda16_2,5ul #1 RT: 0.00 AV: NL: 1.14E3 T: + c ESI SRM ms2 214.100 [101.600-102.600] 102.05 100 90 80 Relative Abundance 70 60 50 40 30 20 10 101.6 QC 5ppm QC_5ppm _5ul_151221151557 RT: 0.00 - 14.98 SM: 15G 4500 1.22 4000 3500 3000 2500 uAU Relative Abundance 2000 1500 1.09 1000 500 0.07 0.88 -500 -1000 -1500 -2000 Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 74   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN BẰNG HỆ HPLC – MS/MS Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 75   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học PHẠM VI ỨNG DỤNG Hƣớng dẫn quy định phƣơng pháp xác định chất bảo quản biết mẫu da Giới hạn định lƣợng phƣơng pháp chất bảo quản khoảng 1,0 – 2,0 mg/kg tùy thuộc chất TÀI LIỆU VIỆN DẪN - TCVN 9555:2013 (ISO 13365:2011) - Da - Phép thử hoá xác định hàm lƣợng chất bảo quản (TCMTB, PCMC, OPP, OIT) có da sắc ký lỏng - TCVN 7117:2007 (ISO 2418:2002) Da – Phép thử hóa lý, lý độ bền màu – Vị trí lấy mẫu - TCVN 7126: 2010 (ISO 4044: 2008) - Da - Chuẩn bị mẫu thử hóa - ISO 4684:2005, Leather – Chemical test – Determination of volatile matter (Da – Phép thử hóa học – Xác định chất bay NGUYÊN TẮC PHƢƠNG PHÁP Sau loại dầu, mỡ chất chống thấm n-hexan, mẫu da đƣợc chiết dung mơi thích hợp sử dụng sóng siêu âm Dịch chiết sau lọc đƣợc phân tích thiết bị sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép HPLC/MS-MS Bảng Danh sách chất chuẩn chất bảo quản STT Tên chất bảo quản 2-(thiocyanomethylthio)-benzothiazole 2-octylisothiazol-3(2H)-one 2-phenylphenol 4-chloro-3-methylphenol THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Thiết bị phân tích: - Sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò khổi phổ kép: HPLC/MS-MS Thermo TSQ Quantum Access Max 4.1.2 Bể siêu âm có điều chỉnh nhiệt: Elmasonic S300H, tần số 37 kHz 4.1.3 Màng lọc mẫu: 0,45µm 4.1.4 Cân phân tích, cân xác đến 0,0001mg 4.1.5 Dụng cụ thủy tinh - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 76   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Bình định mức với thể tích khác - Bình phản ứng thủy tinh chịu nhiệt, kín khí Khoa Hóa học 4.2 Dung mơi hố chất 4.2.1 Dung mơi - Metanol – HPLC grade - n-hexan – HPLC grade - Acetonitrile – HPLC grade - Nƣớc cất hai lần deion 4.2.2 Hoá chất Hoá chất chuẩn chất bảo quản (Bảng 1) LẤY MẪU VÀ CHUẨN BỊ MẪU Nếu lấy mẫu thử phù hợp với TCVN 7117 nghiền da theo TCVN 7126: 2002 Nếu không lấy mẫu theo TCVN 7117 (ví dụ nhƣ da lấy từ sản phẩm hoàn thiện nhƣ giầy ủng, quần áo) chi tiết trình lấy mẫu phải đƣợc ghi báo cáo thử nghiệm Đối với trình phân tích, mẫu đại diện gồm 1,0 g (± 0,10 g) da nghiền đƣợc cân xác cho vào bình phản ứng CÁCH TIẾN HÀNH 6.1 Loại chất béo Cân 1,0 g mẫu da (chính xác đến ± 0,10 g) nghiền vào bình kín 50 ml, thêm 20 ml n-hexan siêu âm 40 C 20 phút Lớp n-hexan sau đƣợc gạn khỏi mẫu da Mẫu da đƣợc xử lý nhƣ với hai lần 20 ml n-hexan Sau gạn bỏ dung mơi n-hexan, mẫu da đƣợc loại bỏ hồn toàn n-hexan cách để bay tự nhiên đến khơ bình để mở 6.2 Chuẩn bị dung dịch phân tích Dùng pipet lấy 20 ml axetonitril cho vào mẫu da Chiết mẫu da bể siêu âm ± phút (80% công suất siêu âm) nhiệt độ phịng Trong q trình chiết, nhiệt độ hỗn hợp tăng đến khoảng 35°C Sau đó, lọc phần dịch chiết qua màng lọc vào vial thích hợp Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 77   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học Dịch lọc đƣợc phân tích phƣơng pháp HPLC-MS/MS định lƣợng chất bảo quản phát đƣợc 6.3 Xây dựng đƣờng chuẩn Đƣờng chuẩn đƣợc dựng khoảng nồng độ 0,05 -10 mg/L nhƣ sau Cân 06 mẫu da trắng với khối lƣợng 1,0 g (± 0,01 g) vào 06 bình thuỷ tinh 50 ml Tiến hành loại mỡ theo bƣớc 6.1 Dùng pipet lấy xác lƣợng axetonitril hỗn hợp chuẩn theo bảng 2, cho tổng thể tích dung dịch chiết 20 ml vào mẫu da Chiết mẫu da bể siêu âm ± phút nhiệt độ phòng Tiến hành xử lý mẫu theo bƣớc từ 6.2 Phân tích dung dịch mẫu cuối HPLC/DAD HPLC-MS/MS Các chất bảo quản đƣợc xác định dựa thời gian lƣu Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa tƣơng quan diện tích pic hàm lƣợng chất bảo quản Bảng Đƣờng chuẩn xây dựng mẫu da trắng Điểm chuẩn Dun chuẩn 100 100 100 100 6.4 Điều kiện sắc ký 100 100 Các thông số thiết bị phân tích đƣợc thiết lập nhƣ Bảng 3: B Dung môi rửa giải 1: Dung môi rửa giải 2: Cột sắc ký: Nhiệt độ lò cột : Tốc độ dịng: Đẳng dịng Thể tích bơm mẫu: Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 78   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học Thiết lập thông số cho detector hai lần khối phổ MS/MS: TT Tên chất 4-chloro-3-methylphenol 2-phenylphenol 2-octylisothiazol-3(2H)-one 2-(thiocyanomethylthio)-benzothiazole Trong trƣờng hợp hàm lƣợng chất bảo quản mẫu vƣợt 10 mg/L, dung dịch mẫu đƣợc pha lỗng thích hợp axetonitril để phân tích TÍNH TỐN Tính tốn phần khối lƣợng, wi, tất chất bảo quản có da phát đƣợc, tính miligam kilơgam (mg/kg), theo cơng thức sau: w = ρ.V F i m Trong đó: wi phần khối lƣợng chất bảo quản có da, tính miligam kilơgam (mg/kg);  nồng độ khối lƣợng chất bảo quản thu đƣợc từ đƣờng chuẩn, tính miligam lít (mg/l); V thể tích dịch chiết, tính mililít (ml); Flà hệ số pha loãng; m khối lƣợng mẫu đƣợc cân, tính gam (g); Phần khối lƣợng chất bảo quản đƣợc làm tròn đến 0,1 mg, tính miligam kilơgam (mg/kg) BÁO CÁC THỬ NGHIỆM Báo cáo kết cần có thơng tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn TCVN 9555:2013/ISO 13365:2011; Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 79   Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học b) Loại, nguồn gốc mơ tả mẫu phân tích phần mẫu; c) Bất kỳ sai lệch so với quy trình phân tích, bƣớc tiến hành đặc biệt thêm vào; d) Loại phát sắc ký lỏng; Kết phân tích phần khối lƣợng chất bảo quản đƣợc làm tròn đến số thập phân, tính miligam kilơgam (mg/kg) Luận văn Thạc sỹ Lê Thị Băng 80 ... NHIÊN LÊ THỊ BĂNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT BẢO QUẢN TRONG CÁC SẢN PHẨM DA BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC/ MS/ MS CHUN NGÀNH: HĨA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 LUẬN... ? ?Nghiên cứu xây dựng ứng dụng quy trình phân tích đồng thời số chất bảo quản sản phẩm da phương pháp LC/ MS/ MS”có ý nghĩa quan trọng nhằm cung cấp phƣơng pháp xác định chất bảo quản sản phẩm da. .. (HPLC -MS/ MS) Phƣơng pháp phân tích sử dụng kỹ thuật HPLC – MS/ MS phƣơng pháp phân tích đại với ƣu điểm vƣợt trội: phân tích đồng thời dƣ lƣợng đa chất hữu cơ, độ nhạy độ chọn lọc cao, kết phân tích