Xây dựng quy trình hplc pda phân tích đồng thời dư lượng kháng sinh chloramphenicol enrofloxacin metronidazol và cancomycin trong nước thái nuôi trồng thuỷ sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ CAO NGUYỄN HỒNG KHANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH HPLC/PDA PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL, ENROFLOXACIN, METRONIDAZOL VÀ VANCOMYCIN TRONG NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỂ ỨNG DỤNG KIỂM TRA DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ QUANG XÚC TÁC PHÂN HỦY CÁC KHÁNG SINH BẰNG VẬT LIỆU NANO Bi2Se2Te/TiO2 LUẬN VĂN THẠC SĨ Cần Thơ, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ CAO NGUYỄN HỒNG KHANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH HPLC/PDA PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL, ENROFLOXACIN, METRONIDAZOL VÀ VANCOMYCIN TRONG NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỂ ỨNG DỤNG KIỂM TRA DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ QUANG XÚC TÁC PHÂN HỦY CÁC KHÁNG SINH BẰNG VẬT LIỆU NANO Bi2Se2Te/TiO2 Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ Người hướng dẫn khoa học PGS.TS LÊ HỮU PHƯỚC ThS.DS DƯƠNG THỊ TRÚC LY Cần Thơ, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học PGS.TS Lê Hữu Phước, ThS.DS Dương Thị Trúc Ly Các số liệu, kết luận văn chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giữ bí mật kết nghiên cứu thực nghiệm từ mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản địa bàn Tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu Cần Thơ, ngày 20 tháng 12 năm 2021 Học viên Cao Nguyễn Hồng Khanh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin trân trọng bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu trường Thầy PGS.TS Lê Hữu Phước, Thầy PGS.TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Cô ThS.DS Dương Thị Trúc Ly người hướng dẫn khoa học truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, kỹ q báu, góp ý cho tơi suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi học nhiều từ điều dẫn, buổi thảo luận từ nhân cách Thầy Cô Tôi cảm phục hiểu biết sâu sắc chuyên môn, khả tận tình Thầy Cơ Tơi biết ơn kiên trì Thầy, Cơ đọc cẩn thận góp ý kiến cho thảo Luận văn Quý Thầy, Cô Liên mơn Hóa Phân Tích - Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất, môn Vật Lý - Lý Sinh, Khoa Khoa học Cơ tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân yêu gia đình, bạn bè thân thiết, đặc biệt chị, em học viên sau đại học Kiểm nghiệm thuốc khóa 2019 hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình khích lệ to lớn giúp tơi nỗ lực học tập, vượt qua khó khăn suốt thời gian thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 20 tháng 12 năm 2021 Học viên Cao Nguyễn Hồng Khanh i MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục… …………………………………………………………………….i Danh mục chữ viết tắt ……………………………………………… … iv Danh mục bảng, biểu đồ v Danh mục hình vii Danh mục sơ đồ……………………………………………………………x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng sử dụng lạm dụng chất kháng sinh nuôi trồng thủy sản 1.2 Kiểm sốt dư lượng kháng sinh nơng nghiệp môi trường 1.3 Tổng quan chất kháng sinh nghiên cứu ………………… 11 1.4 Tổng quan vật liệu nano TiO2 Bi2Se2Te………………………… 14 1.5 Các cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 27 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 27 2.1.4 Nguyên vật liệu - hóa chất, dung môi - trang thiết bị 27 2.1.5 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.2.2 Cỡ mẫu 29 2.2.3 Phương pháp lấy mẫu nước nuôi trồng thủy sản 30 2.2.4 Phương pháp bảo quản mẫu 31 ii 2.2.5 Các đặc tính kỹ thuật vật liệu nano TiO2 Bi2Se2Te-TiO2 31 2.2.6 Nội dung nghiên cứu 33 2.2.7 Phương pháp thu thập đánh giá số liệu 42 2.2.8 Phương pháp kiểm soát sai số 43 2.2.9 Xử lý thống kê kết phân tích 43 2.3 Đạo đức nghiên cứu 43 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 44 3.1 Xây dựng quy trình HPLC/PDA phân tích đồng thời chất cấm chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin nuôi trồng thủy sản theo hướng dẫn ICH AOAC 44 3.2 Thẩm định quy trình HPLC/PDA phân tích đồng thời chất cấm chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản theo hướng dẫn ICH AOAC 54 3.3 Ứng dụng quy trình thẩm định để kiểm tra dư lượng kháng sinh đánh giá hiệu quang xúc tác phân hủy kháng sinh vật liệu nano Bi2Se2Te/TiO2 68 3.3.1 Ứng dụng quy trình phân tích HPLC/PDA thẩm định xác định chất cấm chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản 68 3.3.2 Ứng dụng quy trình phân tích HPLC/PDA thẩm định đánh giá hiệu quang xúc tác phân hủy kháng sinh cấm mẫu thử giả lập vật liệu nano TiO2 Bi2Se2Te/TiO2 69 Chương BÀN LUẬN 76 4.1 Xây dựng quy trình HPLC/PDA phân tích đồng thời chất cấm chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin nuôi trồng thủy sản theo hướng dẫn ICH AOAC…………………………………….76 iii 4.2 Thẩm định quy trình HPLC/PDA phân tích đồng thời chất cấm chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin nuôi trồng thủy sản theo hướng dẫn ICH AOAC 83 4.3 Ứng dụng quy trình thẩm định để kiểm tra dư lượng kháng sinh đánh giá hiệu quang xúc tác phân hủy kháng sinh vật liệu nano Bi2Se2Te/TiO2 ……………………………………………………………….87 4.3.1 Ứng dụng quy trình phân tích HPLC/PDA thẩm định xác định chất cấm chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản 87 4.3.2 Ứng dụng quy trình phân tích HPLC/PDA thẩm định đánh giá hiệu quang xúc tác phân hủy kháng sinh cấm mẫu thử giả lập vật liệu nano TiO2 Bi2Se2Te-TiO2 88 KẾT LUẬN 91 KIẾN NGHỊ……………………………………………………………… 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO xiii PHỤ LỤC .- - iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ĐBSCL CB VB MET CAP VCM ENX SPE eh+ Eg Nghĩa tiếng Việt Đồng Bằng Sông Cửu Long Vùng dẫn Vùng hóa trị LOD LOQ PDA ppb ppm RSD R Từ tiếng Anh The Mekong Delta Conduction band Valence band Metronidazol Chloramphenicol Vancomycin Enrofloxacin Dispersive solid phase extraction Electron Hole Energy band gap High Performance Liquid Chromatography Limit of Detection Limit of Quantification Photodiode Array Detector Parts per billion Parts per million Relative Standar Deviation Recovery S/N Signal/Noise Tín hiệu/Nhiễu SKĐ Chromatography spectrum Sắc ký đồ SD Standard deviation Độ lệch chuẩn UV Ultra Violet Tử ngoại HPLC Chiết pha rắn Điện tử vùng dẫn Lỗ trống Năng lượng vùng cấm Sắc ký lỏng hiệu cao Giới hạn phát Giới hạn định lượng Đầu dò dãy diod quang Phần tỷ Phần triệu Độ lệch chuẩn tương đối Độ thu hồi v DANH MỤC CÁC BẢNG - BIỂU ĐỒ Bảng 1.1 Danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng sản xuất kinh doanh thủy sản ……………………………………………………………… Bảng 1.2 Danh mục hóa chất, kháng sinh sử dụng có giới hạn sản xuất kinh doanh thủy sản ………………………………………………………….10 Bảng 2.1 Mẫu nước thu thập Cà Mau, Bạc Liêu………………………….29 Bảng 3.1 Kết khảo sát pha tĩnh, dung môi pha mẫu 44 Bảng 3.2 Kết khảo sát pH pha động……………………………………45 Bảng 3.3 Khảo sát tốc độ dòng pha động……………………………….45 Bảng 3.4 Kết khảo sát chương trình pha động………………………….46 Bảng 3.5 Chương trình gradient pha động thích hợp phân tích đồng thời chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin .47 Bảng 3.6 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi quy trình xử lý mẫu…… 49 Bảng 3.7 Kết xác định hiệu suất chiết thu hồi kháng sinh phân tích với QT-2 sử dụng thể tích nước 10 mL, 25 mL, 50 mL………………………… 50 Bảng 3.8 Phương trình hồi qui xây dựng mẫu trắng dung môi 52 Bảng 3.9 Kết khảo sát tương thích hệ thống hỗn hợp mẫu thử giả lập (n = 6)…………………………………………………………………………… 55 Bảng 3.10 Độ tinh khiết MET, VCM, ENX, CAP mẫu thử giả lập……………………………………………………………………………57 Bảng 3.11 Khoảng tuyến tính, phương trình hồi quy hệ số tương quan kháng sinh phân tích……………………………………………………….61 Bảng 3.12 LOD LOQ kháng sinh phân tích……………………… 63 Bảng 3.13 Độ chính xác ngày kháng sinh MET, CAP, VCM, ENX………………………………………………………………………….66 Bảng 3.14 Độ chính xác liên ngày kháng sinh MET, CAP, VCM, ENX ……………………………………………………………………………….67 Bảng 3.15 Mẫu thực tế thu thập Cà Mau, Bạc Liêu…………………… 68 vi Bảng 3.16 Sự thay đổi diện tích đỉnh đặc trưng (MET), (ENX), (VCM), (CAP) mẫu thử giả lập phản ứng quang phân (UV-Vis) quang xác tác với TNWs/TNAs Bi2Se2Te-TNWs/TNAs thời gian phản ứng khác từ - 20 phút………………………………………………………… 71 - 39 - PL 3.6 Độ ổn định mẫu thử sau giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giá trị bảng % nồng độ giảm theo khoảng thời gian khác kể từ thời điểm tiêm mẫu Mẫu Sau Sau 12 Sau 24 Sau 36 Sau 48 (50 ppm) 6giờ giờ giờ Metronidazol T1 0,02 0,1 0,4 0,49 5,09 Metronidazol T2 0,02 0,04 0,06 0,95 5,97 Metronidazol T3 0,13 0,17 0,49 0,98 6,19 Vancomycin T1 0,25 0,5 1,25 1,94 2,22 Vancomycin T2 0,74 0,95 1,71 1,86 5,11 Vancomycin T3 0,28 0,86 1,19 1,46 3,3 Enrofloxacin T1 0,87 0,89 1,09 1,34 1,42 Enrofloxacin T2 0,73 1,83 1,84 1,98 5,91 Enrofloxacin T3 0,31 0,35 0,46 0,54 0,65 Chloramphenicol T1 0,93 1,28 1,78 1,19 2,13 Chloramphenicol T2 0,08 0,27 0,78 0,8 0,86 Chloramphenicol T3 1,1 1,7 1,72 1,99 2,23 Tên Kháng sinh Hình PL3.6 SKĐ hỗn hợp mẫu thử tiêm hàm lượng chất phân tích giảm < 2% ( Mẫu T1= 50 ppm) - 40 - Hình PL3.6 SKĐ hỗn hợp mẫu thử tiêm hàm lượng chất phân tích giảm < 2% ( Mẫu T2 = 50 ppm) Hình PL3.6 SKĐ hỗn hợp mẫu thử tiêm hàm lượng chất phân tích giảm < 2% ( Mẫu T3 = 50 ppm) - 41 - PHỤ LỤC ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU ỨNG DỤNG PL 4.1 Ứng dụng quy trình phân tích - Sắc ký đồ mẫu giả lập phân tích trước qua vật liệu Hình PL4.1 SKĐ mẫu giả lập phân tích trước qua vật liệu Hình PL4.1 Overlay SKĐ kháng sinh chiếu tia UV- Vis - 42 - Hình PL4.1 Overlay SKĐ kháng sinh chiếu tia UV-Vis vật liệu TNWs/TNAs Hình PL4.1 Overlay SKĐ kháng sinh chiếu tia UV vật liệu đính Bi2Se2Te-TNWs/TNAs - 43 - PL 4.2 Sắc ký đồ mẫu thực tế thu thập Hình PL4.2 SKĐ mẫu thực tế thu thập phát dư lượng kháng sinh MET, ENX PL 4.3 Cơ chế tăng cường hoạt tính quang xúc tác Hình PL4.3 Lược đồ giải thích chế giúp tăng cường hoạt tính quang xúc tác Bi2Se2Te-TiO2 - 44 - PHỤ LỤC QUY TRÌNH DỰ THẢO XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL, ENROFLOXACIN, METRONIDAZOL VÀ VANCOMYCIN TRONG NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỂ ỨNG DỤNG KIỂM TRA DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ QUANG XÚC TÁC PHÂN HỦY CÁC KHÁNG SINH PHÂN HỦY CÁC KHÁNG SINH BẰNG VẬT LIỆU NANO Bi2Se2Te/TiO2 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng để xác định dư lượng chất chloramphenicol, enroflocaxin, metronidazol vancomycin nước thải nuôi trồng thủy sản HPLC/PDA Giới hạn phát phương pháp là: Cloramphenicol: 39 ppb Enrofloxacin: 0.625 ppb Metronidazol: 39 ppb Vancomycin: 39 ppb Nguyên tắc Dư lượng kháng sinh chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mẫu thử điều chỉnh đến pH = 2,5 H3PO4 chiết 0,5 mL EDTA 5% lắc mạnh Mẫu phân tích lọc qua màng lọc 0.45 µm Phân tích kỹ thuật HPLC/PDA định lượng chất có mẫu thử Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước cất lần đạt tiêu chuẩn HPLC 3.1 Chất chuẩn chloramphenicol: tinh khiết lớn 99,6% - 45 - 3.2 Chất chuẩn enrofloxacin: tinh khiết lớn 98% 3.3 Chất chuẩn metronidazol: tinh khiết lớn 99,7% 3.4 Chất chuẩn vancomycin: tinh khiết lớn 98% 3.5 Axetonitril (CH3CN): loại dùng cho HPLC 3.6 Nước (H2O): loại dùng cho HPLC 3.7 Metanol (CH3OH): loại dùng cho HPLC 3.8 EDTA hàm lượng lớn 99% 3.9 Acid phosphoric (H3PO4): tinh khiết lớn 99 % 3.10 Acid formic (HCOOH): tinh khiết lớn 99 % 3.11 Hỗn hợp A1 Lấy 25 mL mẫu thử lọc thô lần giấy lọc, điều chỉnh pH = 2,5 acid H3PO4 (3.9) cho vào ống ly tâm nhựa 25 mL (4.7) thêm 0,5 mL EDTA 5% (3.8) lắc mạnh (4.5) 3.12 Hỗn hợp A2 Lấy 50 mL mẫu thử lọc thô lần giấy lọc, điều chỉnh pH = 2,5 acid H3PO4 (3.9) cho vào ống ly tâm 50 mL (4.7) thêm 0,5 mL EDTA 5% (3.8) lắc mạnh (4.5) 3.13 Dung dịch chuẩn gốc các kháng sinh chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin 500 mg/L (500ppm) Cân khoảng 10 mg chuẩn đơn kháng sinh chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin vào bình định mức 20 mL hòa tan với methanol nước acid formic 0,1% tỷ lệ 10: 90, lắc kỹ siêu âm 10 phút, để nhiệt độ phòng, bổ sung dung môi đến vạch, trộn Dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc thu chất chuẩn 500 ppm bảo quản chai thủy tinh tối màu 20 mL (4.20) nhiệt độ nhỏ âm 18oC, dung dịch bền năm, thường xuyên kiểm tra độ bền dung dịch chuẩn CHÚ THÍCH: - 46 - Tùy thuộc vào lượng cân, độ tinh khiết gốc liên kết chuẩn, tính tốn lại nồng độ chuẩn thực tế 3.14 Dung dịch chuẩn hỗn hợp chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin 50 mg/L Lấy mL dung dịch chuẩn hỗn hợp chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin 500 ppm (3.13) vào bình định mức 20 ml 50 ppm (4.12), thêm metanol nước (3.7), (3.6) đến vạch Trộn đều, bảo quản chai thủy tinh tối màu 20 ml (4.14) nhiệt độ nhỏ âm 18°C, dung dịch bền tháng, thường xuyên kiểm tra độ bền dung dịch chuẩn CHÚ THÍCH: Tùy thuộc vào nồng độ chuẩn thực tế chuẩn đơn, điều chỉnh thể tích lấy cho phù hợp 3.15 Dung dịch chuẩn hỗn hợp chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mg/L Lấy ml dung dịch chuẩn hỗn hợp chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin trung gian 50 mg/L (3.14) vào bình định mức 10 ml (4.12) thêm metanol nước (3.6), (3.7) đến vạch Trộn đều, bảo quản chai thủy tinh tối màu 10 mL (4.14) nhiệt độ từ 2°C đến 8°C, dung dịch bền tháng 3.16 Dung dịch chuẩn hỗn hợp chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin 0,5 mg/L Lấy ml dung dịch chuẩn hỗn hợp chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin trung gian mg/L (3.15) vào bình định mức 10 mL (4.12) thêm metanol nước tỷ lệ (10: 90) (3.6), (3.7) đến vạch Trộn đều, bảo quản chai thủy tinh tối màu 10 mL (4.14) nhiệt độ từ 2°C đến 8°C, dung dịch bền tháng CHÚ THÍCH: - 47 - Tùy thuộc vào lượng cân, độ tinh khiết gốc liên kết chuẩn, tính toán lại nồng độ chuẩn thực tế 3.17 Dung dịch acid phosphoric pH = 2,2 (pha động B) Lấy ml acid phosphoric (3.9) vào bình định mức 1000 ml (4.12) chứa sẵn 900 ml nước (3.6) lắc Định mức tới vạch nước (3.6) đo Ph = 2,2 (4.19), lọc lọc dung môi thủy tinh (4.10) đuổi khí cách siêu âm dung dịch bể siêu âm (4.4) phút trước sử dụng 3.18 Dung mơi hịa tan C Lấy 10 ml metanol (3.7) 90 nước acid formic 0,1% (3.10) cho vào bình định mức 100 ml (4.12) định mức tới vạch Trộn đều, bảo quản chai thủy tinh tối màu 100 ml (4.14) nhiệt độ phòng, dung dịch bền tuần 3.19 Dung dịch để dựng đường chuẩn Pha hỗn hợp chuẩn chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin nồng độ: 20,0; 30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 100,0; 500 μg/L kháng sinh enrofloxacin 200,0; 300,0; 400,0; 500,0; 600,0; 700,0 μg/L kháng sinh chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin cụ thể sau: - Pha bình hỗn hợp chuẩn kháng sinh chloramphenicol, metronidazol vancomycin có nồng độ 50 ppm enrofloxacin ppm vào bình 20 mL bình A (4.12) - Từ bình A (4.12) hút chất metronidazol, chloramphenicol vancomycin có nồng độ ppm enrofloxacin 0,5 ppm vào bình 50 mL (bình B) (4.12) - Lấy bình định mức 25 mL (4.12) ký hiệu S1, S2, S3, S4, S5, S6 thêm mL; 1.5 mL; mL; 2.5 mL; mL; 3.5 mL bình (B) vào bình S1, S2, S3, S4, S5, S6 Định mức tới vạch bình S1, S2, S3, S4, S5, S6 mẫu trắng (6.2.1) - 48 - -Bảo quản chai thủy tinh tối màu 25 mL (4.14) nhiệt độ nhỏ 4°C, dung dịch bền tuần 4.Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường phòng thử nghiệm thiết bị sau: 4.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Đầu dò L 2455 - Máy tính phần mềm phân tích; - Cột sắc ký pha đảo Fusion C18 (4 μm, 4.6 × 250 mm) có gắn cột bảo vệ loại 4.2 Cân kỹ thuật có độ chính xác đến 0,01 g 4.3 Tủ lạnh đông hoạt động liên tục nhiệt độ thấp âm 18 oC 4.4 Bể siêu âm 4.5 Máy lắc mẫu: tốc độ tối thiểu 3000 r/min 4.6 Pipet pasteur: 150 mm, mL 4.7 Ống ly tâm nhựa: dung tích 25, 50 mL có nắp 4.8 Lọ đựng mẫu: dung tích 1,5 mL có nắp đệm PTFE 4.9 Đầu tip: dung tích 100; 200; 1000; 5000 μL; 4.10 Bộ lọc dung môi thủy tinh 4.11 Micropipet: dung tích 100; 200; 1000; 5000 μL; 4.12 Bình định mức thủy tinh: cấp chính xác loại A, dung tích 10; 20; 25; 1000 mL; 4.13 Cốc thủy tinh: dung tích 100; 250; 500; 1000 mL 4.14 Chai thủy tinh tối màu: dung tích 15; 20; 25; 100; 250; 500; 1000 mL 4.15 Chai nhựa tối màu: dung tích 500 mL 4.16 Màng lọc dung mơi: đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,45 μm PTFE - 49 - 4.17 Đầu lọc mẫu dùng ngay: đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,45 μm, làm PTFE 4.18 Xylanh tiêm: mL 4.19 Máy đo pH consort Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Mẫu phân tích phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị hư hỏng biến đổi trình vận chuyển, bảo quản Mẫu bảo quản tủ đông nhiệt độ nhỏ âm 18 oC xử lý Cách tiến hành 6.1 Yêu cầu chung Tồn quy trình phân tích cần thực ngày 6.2 Chuẩn bị mẫu thử Mẫu trước thực phải rã đông (4.15): Chuyển mẫu từ tủ đông để rã đông tự nhiên nhiệt độ phòng khoảng 30 phút giữ nguyên bao gói kín xả vòi nước 10 phút Mẫu đưa nhiệt độ phòng Mẫu thử lọc thô lần giấy lọc, điều chỉnh pH = 2,5 acid H3PO4 (3.9) sau cho vào ống ly tâm nhựa 25 mL (4.7) thêm 0,5 mL EDTA 5% (3.8), lắc mạnh (4.5), lọc qua màng lọc 0,45 µm chuyên dùng cho HPLC (4.8) 6.2.1 Chuẩn bị mẫu trắng mẫu dựng đường chuẩn Mẫu lọc thô lần giấy lọc, sau điều chỉnh pH = 2,5 acid H3PO4 (3.9) cho vào ống ly tâm nhựa 25 mL (4.7) thêm 0,5 ml EDTA 5% (3.8), lắc mạnh (4.5) 6.2.2 Chuẩn bị mẫu kiểm soát 50 mg/L ( 50 ppm) Mẫu trắng đồng điều chỉnh pH = 2,5 H3PO4 (3.9) vào ống ly tâm nhựa 25 mL (4.7) cho 1mL dung dịch chuẩn hỗn hợp kháng sinh - 50 - chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin (3.20) 0,5 mL dung dịch EDTA 5% (3.8) trộn máy lắc mẫu phút Thực tối thiểu mẫu kiểm soát lơ mẫu Độ thu hồi mẫu kiểm sốt tham khảo phụ lục A 6.3 Chiết tách 6.3.1 Chiết mẫu Lấy 25 mL mẫu thử lọc lần giấy lọc thô điều chỉnh pH = 2,5 H3PO4 (3.9) cho ống ly tâm nhựa tích 25 mL (4.7) thêm vào 0.5 ml EDTA 5% (3.8) trộn phút máy lắc mẫu 6.3.2 Xử lý dịch chiết Lọc qua đầu lọc mẫu dùng 0,45 μm (4.16) xylanh tiêm mL (4.18) vào lọ đựng mẫu 1.5 mL (4.8), đậy kín nắp, phân tích HPLC/PDA 6.4 Điều kiện phân tích HPLC 6.4.1 Yêu cầu chung Đảm bảo píc sắc ký, đảm bảo tín hiệu nhiễu S/N =3/1 Khơng có píc nhiễu vị trí píc phân tích 6.4.2 Trình tự bơm mẫu (tham khảo) Dung môi (pha động); dung dịch chuẩn; mẫu trắng; mẫu kiểm soát; mẫu thử Sau 10 mẫu phải bơm lại điểm chuẩn mẫu kiểm soát (6.2.2) 6.5 Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng dạng y = ax + b tỉ lệ diện tích kháng sinh với nồng độ kháng sinh tương ứng từ tính hệ số tương quan r2 Giá trị hệ số chặn nên gần giá trị hệ số tương quan hồi quy (r2) phải lớn 0,995 Tính kết 7.1 Nồng độ chất kháng sinh cloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mẫu thử - 51 - Nồng độ kháng sinh cloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin ( X), biểu thị microgam lít (μg/L), tính theo công thức: X = X0  F đó: X0 nồng độ chất cloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin mẫu thử xác định theo đường chuẩn (6.5), tính microgam lít (μg/L); F hệ số pha loãng mẫu (nếu cần) 7.2 Biểu diễn kết Kết thử nghiệm báo cáo với chữ số thập phân, đơn vị tính μg/L Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử - Kết thử nghiệm - Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết - Phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn - Tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng đến kết - 52 - PHỤ LỤC A (Tham khảo) Kiểm soát chất lượng kết thử nghiệm Hệ số hồi quy tuyến tính (r2) đường chuẩn: Phải lớn 0,995 Độ thu hồi mẫu kiểm soát: Độ thu hồi mẫu kiểm soát phải nằm khoảng quy định Bảng 2.1 Bảng 2.1 - Quy định độ thu hồi Nồng độ Độ thu hồi (%) 0,1% 95 - 105 100 ppm 90 - 107 10 ppm 80 -110 ppm 80 -110 100 ppb 80 -110 10 ppb 60 - 115 ppb 40 - 120 - 53 - PHỤ LỤC B (Tham khảo) Điều kiện phân tích HPLC Thiết bị HPLC: HPLC hai kênh dung mơi, chạy gradient Cột phân tích: Cột sắc ký pha đảo C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt nhồi μm Nhiệt độ cột: Thể tích bơm mẫu: Nhiệt độ phòng 25°C 40 μL Pha động: Gradient hai kênh Bảng PL B Kênh A: Dung dịch pha động Acetonitril (3.5) Kênh B: Nước acid phosphoric pH = 2,2 (3.9) Bảng PL B - Điều kiện gradient cho hệ thống HPLC Thời gian Kênh A (%) Kênh B (%) Tốc độ dòng (Phút) ( Acetonitril) ( Nước acid phosphoric (mL/phút) pH = 2,2) 95 1.00 95 1.00 7.5 20 80 1.00 16.0 20 80 1.00 16.1 95 1.00 17.0 95 1.00 ... quy trình HPLC/ PDA phân tích đồng thời dư lượng kháng sinh chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol vancomycin nước thải nuôi trồng thủy sản để ứng dụng kiểm tra dư lượng kháng sinh đánh giá... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ CAO NGUYỄN HỒNG KHANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH HPLC/ PDA PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL, ENROFLOXACIN, METRONIDAZOL VÀ VANCOMYCIN... đồng thời dư lượng kháng sinh chloramphenicol, enrofloxacin, metronidazol, vancomycin nước thải nuôi trồng thủy sản phương pháp HPLC/ PDA chưa phát triển báo cáo đầy đủ Từ lý đề tài? ?Xây dựng quy trình