Báo cáo thực tập dược lý đánh giá tác dụng hạ men gan của cây xạ đen

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM KHOA Y HỌC CỔ TRUYỀN ****** BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LÝ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ MEN GAN CỦA CÂY XẠ ĐEN Học viên: Ngô cẩm xem Lớp: Chuyên khoa Cấp I Niên khóa: 2020 – 2022 ngày 26 tháng 03 năm 2020 Tp HCM LỜI CẢM ƠN: Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Y Dược Tp.HCM, Khoa Y học cổ truyền, Bộ môn Bào Chế Đông Dược học viên lớp CKI khóa 2020 - 2022 tạo điều kiện cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành tốt khóa học thời gian thực hành Gửi lời cảm ơn quý thầy Cơ tận tình hướng dẫn nhóm chúng em để hồn thành mơn học Gửi lời cảm ơn đến anh chị hỗ trợ tơi q trình thực hành kỹ thuật liên quan đến môn học Cảm ơn đội hỗ trợ phòng chống dịch Covid-19 ngày hỗ trợ công tác học tập, đảm bảo đủ điều kiện sức khỏe để hoàn thành tốt khóa học Chân thành cảm ơn!!! CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN CÂY XẠ ĐEN Tên khoa học: - Celastrus hindsii Benth 1.2 Đặc điểm thực vật - Mô tả : Xạ đen thuộc loại dây leo thân gỗ, mọc thành búi, thân dạng dây dài từ 3-10m, cành trịn Lúc non có màu xám nhạt, sau chuyển sang màu nâu, sau có màu xanh Lá mọc so le, phiến bầu dục, hình xoan ngược, dài 7-12cm, rộng 3-5cm, dai, gân bên đôi, mép có tháp, cuống 5-7mm Chùm hoa hay nách lá, dài 5-10cm, cuống hoa 2-4mm, hoa mẫu cánh, cánh hoa trắng Hoa có bầu ô Quả hình trứng, dài 1cm, nở thành mảnh, hạt có áo hạt màu hồng - Mùa hoa: tháng 3-5, mùa quả: tháng 8-12 - Cây mọc vùng thấp với độ cao 1000-1500m Phân bố nhiều nước Trung Quốc, Việt Nam, Myanmar Ở Việt Nam, phân bố chủ yếu Hịa Bình, Hà Nam, Ninh Bình, Quảng Ninh, vườn quốc gia Cúc Phương, vườn quốc gia Ba Vì, Thừa Thiên Huế, Tây Nguyên - Cách chế biến xạ đen thành thuốc: - Làm - Cắt thành đoạn ngắn, phơi khô sấy khơ 1.3 Bộ phận dùng: - Bộ phận dùng bao gồm phần thân, cành 1.4 Tính vị: - Có tính hàn, vị đắng, chát có tác dụng trị viêm gan, bệnh u bướu, giải độc, mụn nhọt, vàng da, tiêu viêm,… 1.5 Thành phần hóa học: - Saponin, curmarin, Tanin, flavonoid, polyphenol, acid amin, triterpenoid, cyanoglycosid, đường khử CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP GÂY TĂNG MEN GAN CỦA CHUỘT - Gan quan quan trọng có vai trị chuyển hóa chất thể Chức chủ yếu gan tham gia vào trình giải độc cho thể - Để gây tổn thương gan chuột, người ta dùng nhiều loại hóa chất khác như: paracetamol, carbontetraclorid, D-galactosamin, ethanol, erythromycin estolate, aflatoxin B - Mỗi mơ hình tổn thương gan có chế đặc hiệu - Động vật thực nghiệm - Chuột nhắt trắng nuôi điều kiện tiêu chuẩn, cung cấp đầy đủ thức ăn nước uống 2.1 Phương pháp gây tăng men chuột Paracetamol - Cho chuột uống paracetamol liều từ 150- 400mg/kg, V uống 0,1ml/ 10g - Ngày ngày uống giống theo dỏi - Ngày uống paracetamol sau 30p chuột lấy máu thu huyết thanh, định lượng aminotransferase (AST, ALT) 2.2 Phương pháp gây tăng men chuột ethanol - Cho chuột uống ethanol 96% với liều hàng ngày 4ml/kg (trước uống phải hịa lỗng ethanol với nước cất) liền 45 ngày, gan bị tổn thương Lô thuốc sau cho chuột uống ethanol 30 ngày cho dùng thuốc( song cho uống ethanol tiếp) ngày 45( sau dùng thuốc) xét nghiệm 2.3 Phương pháp gây tăng men chuột Carbon tetrachlorid ( CCL4) - Favari Alvares (1997) gây tổn thương gan cách cho chuột nhắt trắng uống CCl4 đầu uống dung dịch CCl4 dầu thực vật với tỷ lệ 1:7, liều 10mg/kg ngày tiếp theo, uống dung dịch CCl4 dầu thực vật tỷ lệ 1:6, với liều 10mg/kg( tổng liều CCL4 11,188ml/kg, dùng uống) Thuốc nghiêm cứu uống hàng ngày ngày Lơ đối chứng cho uống cất với thể tích thuốc đến ngày thứ lấy máu thu huyết thanh, định lượng aminotransferase (AST, ALT) CHƯƠNG 3.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU Phương pháp chiết suất cao xạ đen 3.1.1.Chiết cao nước: - Dược liệu: 250 gram xạ đen phơi khô, cắt nhỏ - Tiến hành: Cho nước vào ngập dược liệu, mang ngâm hỗn hợp 10 phút, cho dược liệu nở Đem dược liệu nấu lần từ lúc sôi nấu thêm 45 phút lọc lâý dung dịch chiết  tiếp tục đổ nước ngập dược liệu nấu lần từ lúc sôi nấu thêm 30 phút lọc lấy dịch chiết - Trộn dung dịch lần + dung dịch lần mang cô cao - Cô cao: Mang dịch chiết cao nước lọc bỏ lên dụng cụ cô cao tiến hành theo phương pháp cô trực tiếp - Đến cao đặc sánh mang bỏ vào becher tiếp tục cô cao theo phương pháp cô cách thủy 3.1.2.Đo độ ẩm: - Mang cao cô đem đo độ ẩm máy đo độ ẩm Dụng cụ, thiết bị: - Cân sấy ẩm Mettler Toledo HB 43 Cách tiến hành: - Lấy mẫu cao cho vào đĩa cân Thiết bị xác định trọng lượng mẫu cao cần đo Sau thiết bị sấy khô xong, thiết bị tiếp tục ghi lại giá trị trọng lượng lại mẫu cao Bộ vi xử lý thiết bị tiến hành tính tốn, phân tích trả kết đo xác hiển thị hình LCD máy Ghi lại độ ẩm mẫu cao hình LCD máy 3.1.3 Phương pháp định tính hợp chất cao xạ đen: - Xác định nhóm hợp chất dịch chiết ether - Xác định nhóm hợp chất dịch chiết cồn - Xác định nhóm hợp chất dịch chiết cồn thủy phân - Xác định nhóm hợp chất dịch chiết nước - Xác định nhóm hợp chất dịch chiết nước thủy phân 3.2 Mơ hình thử nghiệm khảo sát độc tính cấp cao xạ đen men gan chuột 3.2.1.Đối tượng nghiên cứu: - Chuột nhắt trắng đực, ni ổn định mơi trường thí nghiệm - Thuốc thử nghiệm: Cao đặc Xạ đen - Hoạt chất: Nước cất - Dụng cụ: Ống tiêm ml, kim đầu tù ml, cân điện tử, cốc đựng thuốc, ly pha thuốc, becher - Cách tiến hành: Nhận 06 chuột đánh dấu cân khối lượng con, ghi nhận kết Chia thành 03 lô chuột - Lô 1,2,3 : Liều dược liệu uống tối đa cho uống - Cách pha liều dược liệu: - Bước 1( dò liều): Cân 2g cao cho vào Betcher cho thêm nước cất, khuấy (cho từ từ 0,2ml, 0,1ml, 0,1ml…) đến rút qua kim thu liều tối đa Đo lường qua ống đong để xác định thể tích dung dịch tồn phần 2,5ml - Bước 2: Cân 4g cao cho vào ống nhựa đo thể tích cho thêm nước cất, khuấy (cho từ từ 0,2ml, 0,1ml, 0,1ml…) đến rút qua kim thu liều tối đa Đo lường qua ống đong để xác định thể tích dung dịch tồn phần 5ml - Liều cho chuột uống thể tích 0,2ml/10g chuột  1000g cần 20 ml  cần lấy : 20 x : = 16g cao - Sau cho chuột uống, theo dõi ghi nhận: - Quan sát sau giờ: chuột uống lúc 10h20p sau uống chuột có biểu thở nhanh trong, động thái chậm chạp 10p, sau chuột giảm thở nhanh, động thái linh hoạt trở lại theo dỏi tiếp 11h20p, chuột khỏe mạnh bình thường - Sau 24 giờ: Xác định tỷ lệ sống – chết 3.3 Mơ hình thử nghiệm tác dụng cao xạ đen chuột gây tăng men gan paracetamol - Chuột nhắt trắng ni đủ tiêu chuẩn phịng thí nghiệm - Chuột chia làm lô: - Lô 1: gồm con, cho uống paracetamol liều 200mg/kg, Thể tích cho uống 0.1 ml/ 10 gr, (lấy 200mg paracetamol pha với 10ml nước cho chuột uống liều 0.1 ml/ 10 gr), uống ngày liên tiếp - Lô 2: gồm con, cho uống paracetamol liều 200mg/ kg, sau 60 phút, tiếp tục cho uống cao xạ đen liều 0.5gr cao/ kg , ngày liên tiếp - Trong tiến hành, liều paracetamol 200mg/kg 2con (chuột 5, 12) chết nên nhóm & giảm liều paracetamol cịn 150 mg/kg, nhóm 2: uống paracetamol, uống paracetamol+ cao xạ đen, nhóm 3: uống paracetamol+ cao xạ đen, uống paracetamol Nhóm thực Bước cho uống Chuột Nhóm L1 uống para L2 uống cao xạ đen Cân nặng (gr) 28.7 30.1 L1:0.3 L2:0.3 Sống 15 30.7 29.7 26.5 0.31 0.3 L1:0.27 L2:0.27 Sống Sống Chết sau ngày 27.4 0.27 Chết 14 30 28.5 27.6 0.3 0.29 L1:0.28 L2:0.28 Chỉ uống para Nhóm L1 uống para L2 uống cao xạ đen Chỉ uống para Nhóm L1 uống para L2 uống cao xạ đen 10 Ngày Liều uống (ml) L1:0.29 L2:0.29 Kết Sống Chết sau uống ngày Chỉ uống para 31.7 L1:0.32 L2:0.32 Chết sau uống 30 phút 13 28.4 0.28 Sống 12 35.6 0.36 Chết sau uống phút Ngày 2: Lấy máu đuôi xét nghiệm AST, ALT CHƯƠNG KẾT QUẢ 4.1 Hiệu suất chiết cao: Cơng thức tính hiệu suất chiết: m cao đặc - HS cao = m dược liệu ×100 % - Trong đó: HS (%): Hiệu suất chiết xuất  m (gam): Khối lượng 25,5 - HS cao = 250 x 100% =10,2 % 4.2 Độ ẩm cao : đo cân sấy ẩm( máy METTLER TOLEDO) = 11,45% 4.3 Kết định tính hợp chất có cao xạ đen: 11 Kết định tính dịch chiết cao xạ đen Nhóm hợp chất Dịch Dịch chiết cồn Dịch chiếtnước chiết Chưa Đã Chưa Đã ether thủy thủy thủy thủy phân phân phân phân Tinh dầu ± Triterpenoid + Alkaloid - - Coumarin + + Kết luận ± - Anthraquinon +++ - +++ - ++ ++ - - - - ++ +++ Flavonoid +++ Tannin +++ ++ +++ Saponin +++ +++ +++ Acid hữu - - - 12 Ghi chú: (-): Khơng có (+): Có (++): Có nhiều (±): Khơng rõ (+++): Có nhiều Có thể phản ứng khơng thực  Trong cao xạ đen có hợp chất: - Saponin có tác dụng: có tác dụng kháng khuẩn chống viêm, kiềm chế phát triển tế bào ung thư, tái tạo tế bào ung thư,phòng chống xâm lấn di tế bào ung thư - Flavonoid :ngăn ngừa q trình oxy hóa gốc tự gây OH, ROO, bảo vệ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, bảo vệ chức gan - Tanin : kháng viêm tác dụng chóng oxy hóa, ngăn ngừa phát triển tế bào ung thư - Courmarin: tác dụng kháng khuẩn, kháng virus HIV, kháng TB ung thư 4.4 Kết thử độc tính cấp: - Chuột cho uống với liều tối đa hút qua kim 16g/kg với thể tích cho uống 0,2ml/ 10g chuột lô thử - Sau 10phút chuột giảm động lừ đừ , thở nhanh - Sau 1h chuột hoạt động bình thường Chuột số Cân nặng(g) 17 30.1 31.9 Liều uống xạ đen(ml) 0,6 0,64 13 Kết 31.2 0,62 456 34.2 0,68 12 36.5 0,73 14 30.3 0.6 - Sau 24h có sống( 66,67 %) , chết ( 33,33%) Chết sau Chết sau - Do phương pháp gây độc tính cấp khơng thành cơng nên nhóm nghiêm cứu sữ dụng liều cao xạ đen dùng cho người 20g dược liệu/ người 50kg/ ngày → 0,4g/kg → liều cho chuột = 0,4 x 12= 4,8g dl /kg → 100g dl ─ 10,2g cao ( HS cao = 10,2%) → 4,8g dl ─ ??g cao m cao = 4,8 : 100 % = 0,4896g ≈ 0,5g cao/kg 10,2 4.4 Nghiên cứu tác dụng hạ men gan cao xạ đen chuột gây độc paracetam Lô Chuột AST đầu ALT đầu AST sau ALT sau 23,86 25,07 23,62 24,44 20,67 29,73 26,52 32,39 24,28 27,75 19,85 23,43 13 39,31 37,00 34,39 35,75 27.03 28,84 26,06 29 P= 0,722 P= 0,58 23,62 24,19 Trung bình Lơ Trung 24,05 25,19 26,16 26,67 25.105 25.93 bình 31,65 Khơng tính 27,92 P= 0,626 14  Tính SPSS 16.0  Độ tin cậy 95%  Bàn luận: - Paracetamol cho chuột uống không tăng AST ALT so với ban đầu - Dựa vào kết nghiêm cứu ta thấy cao xạ đen khơng có tác dụng hạ men gan - Mơ hình thử nghiệm thất bại - Q trình đặc cao nhóm thực đạt yêu cầu - Độ ẩm 11,4 < 20% đạt u cầu  Khó khăn: - Trong q trình tiến hành cho chuột uống với liều 200mg/kg có chuột chết nên đổi liều 150mg/kg - Chuột chết nhiều nên số liệu nghiêm cứu khơng xác - Thời gian nghiêm cứu ngắn khơng mơ hình - Số lượng chuột nghiêm cứu - Kỷ thuật cho uống + lấy máu XN học viên chưa tốt - Hòa tan 0,5g cao + 10ml nước cất hòa tan cao chậm không tan hết lượng cao  Kiến nghị: - Độc tính cấp tiến hành lô đề nghị tiến hành nhiều lô để tìm LD50, Tìm LDmax - Để tiến hành nghiêm cứu thuận lợi giảm liều 150mg/kg - Thêm số lượng chuột để thực mơ hình - Thực tập kỷ thuật thành thạo trước thực mơ hình - Để cao tan nhanh đun nóng cách thủy 15 CHƯƠNG KẾT LUẬN - Tiến hành mơ hình Paracetamol gây độc cho gan thất bại: + Không tăng men gan AST ALT + Cao có khơng có tác dụng hạ men gan hạ men gan AST ALT mơ hình bị thất bại - Tìm hợp chất thiên nhiên cao xạ đen , ứng dụng điều trị lâm sàng CHƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược điển Việt Nam V, trang 1116-1117 Đỗ Huy Bích (NXB khoa học kỹ thuật 2006), thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, t Phương pháp nghiêm cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo(NXB khoa học kỹ thuật 2006) trang 170 Kỹ thuật chiết xuất dược liệu( NXB Y học Hà Nội 2017) TS: Nguyễn Văn Hân 16 ... tăng men gan AST ALT + Cao có khơng có tác dụng hạ men gan hạ men gan AST ALT mơ hình bị thất bại - Tìm hợp chất thiên nhiên cao xạ đen , ứng dụng điều trị lâm sàng CHƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược. .. so với ban đầu - Dựa vào kết nghiêm cứu ta thấy cao xạ đen khơng có tác dụng hạ men gan - Mơ hình thử nghiệm thất bại - Q trình đặc cao nhóm thực đạt yêu cầu - Độ ẩm 11,4 < 20% đạt yêu cầu ... chiết suất cao xạ đen 3.1.1.Chiết cao nước: - Dược liệu: 250 gram xạ đen phơi khô, cắt nhỏ - Tiến hành: Cho nước vào ngập dược liệu, mang ngâm hỗn hợp 10 phút, cho dược liệu nở Đem dược liệu nấu