Lời cảm ơn Lời cảm ơn Trước hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt[.]
Lời cảm ơn Trước hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cán công nhân viên phòng tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian thực tập vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội cô giáo hướng dẫn tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật Lời mở đầu Viện Di truyền nông nghiệp thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân Viện Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984) Hiện nay, Viện nằm địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội Chức Viện : -Nghiên cứu, ứng dúng phương pháp di truyền học đại công nghệ sinh học để chọn tạo giống trồng có suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu sâu bệnh điều kiện bất lợi môt trường -Tạo chủng vi sinh vật phục vụ bảo quản chế biến lương thựcthực phẩm, sản xuất loại chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp bền vững bảo vệ môi trường -Tăng cường hợp tác quốc tế tham gia đào tạo cán lĩnh vự Di truyền Công nghệ sinh học Để thực chức trên, Viện tổ chức thành 10 đơn vị nghiên cứu chuyển giao công nghệ với tổng số cán 116 người có tiến sĩ , phó giáo sư, 16 phó tiến sĩ thạc sĩ Trong năm qua, Viện đạt nhiều thành tựu, thực chủ trì 18 đề tài nhà nước, 42 đề tài cấp ngành, dự án sản xuất thử, tạo nhiều giống lúa chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo quy trình tiến kỹ thuật cơng nhận Ngồi ra, Viện cịn thực dự án hợp tác quốc tế với tổ chức UNDP, FAO Nhờ thành tự mà Viện nhận nhiều giải thưởng có giá trị ngồi nước: Giải thưởng quốc tế đóng góp phát triển nơng nghiêph Châu Thái Bình Dương, hn chương lao động hạng Giới thiệu chung bệnh học thực vật I Quan niệm bệnh hại thực vật Việc xác lúc bị bệnh ln vấn đề khó khăn nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Người ta cho coi khoẻ mạnh phát triển bình thường biểu chức sinh lý mức tối đa tiềm di truyền Các tế bào mơ phân sinh khoẻ mạnh thực chức phân chia chun hố thể địi hỏi cần thiết Các kiểu tế bào chuyên hoá khác hấp thụ nước dinh dưỡng từ đất, đưa nước dinh dưỡng đến tất phận cây, tiến hành trình quang tổng hợp, q trình chuyển hố trao đổi chất, lưu giữ sản phẩm trình quang tổng hợp tạo hạt quan tái tạo khắc cho khả sinh tồn phát triển Bất tế bào hay phận có khả thực hay nhiều chức đặc biệt bị can thiệp vi sinh vật yếu tố mơt trường bất lợi hoạt động tế bào bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế bị chết trồng trở nên bị bệnh Đầu tiên bệnh xảy vài tế bào chưa biểu thời gian ngắn, bệnh lan rộng phận bị bệnh bắt đầu thay đổi biểu triệu chứng bệnh mà mắt thường thấy Dựa vào thay đổi mà thể phản ứng lại xâm nhiễm vi sinh vật hay ảnh hưởng yếu tố môi trường bất lợi mà biết mức độ bệnh Từ bệnh định nghĩa : chuỗi phản ứng tế bào mô thực vật với vi sinh vật gây bệnh với yếu tố môi trường mà ta nhìn thấy khơng nhìn thấy được, dẫn đến thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, tình trạng nguyên vẹn trồng dẫn đến suy yếu gây chết tồn phần phần Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thường gây bệnh cách can thiệp vào trình trao đổi chất tế bào thơng qua enzyme, chất độc tố, chất điều hoà sinh trưởng loại chất khác mà chúng tiết tiếp xúc với chủ, hấp thụ dinh dưỡng tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng chúng Một số sinh vật khác lại gây bệnh cách sống ký sinh phát triển, sinh sản hệ thống bó mạch mơ gỗ hay bó mạch libe hậu tất yếu làm tắc nghẽn đường vận chuyển lên xuống nước đường Ngồi ra, yếu tố mơi trường gây bệnh thực vật tác động với mức ngồi ngưỡng chống chịu Có nhiều loại bệnh hại trồng, chúng phân nhóm theo nhiều tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo phận bị bệnh, theo loại bị bệnh Hiện nay, phổ biến người ta phân loại bệnh dựa vào loại tác nhân gây bệnh Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật chia làm loại: bệnh gây yếu tố sinh học bệnh gây yếu tố không sinh học Theo tiêu chuẩn này, ta nguyên nhân gây bệnh, trình tiến triển cách lan truyền bệnh từ suy biện pháp phịng trừ bệnh Phần i: Ni cấy mơ tế bào thực vật I Khái niệm chung: Nuôi cấy mô tế bào phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện vô trùng Bao gồm: - Nuôi cấy thể thực vật hồn chỉnh - Ni cấy quan, phận tách rời thực vật mẩu lá, mẩu rễ, đoạn thân, phận hoa, - Nuôi cấy phôi non (phôi chưa phân hố hồn tồn), phơi trưởng thành - Ni cấy mơ sẹo (callus) - Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào trần Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa tính tồn tế bào Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào thể đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh điều kiện phù hợp Cơ sở vật chất tính tồn tế bào thể đa bào chứa đầy đủ vật chất thông tin di truyền Khi tạo môi trường nuôi cấy phù hợp, sử dụng chất điều khiển sinh trưởng thực vật, ta hoạt hoá gen cần thiết để bắt tế bào thể thực vật phát triển thành hồn chỉnh Phân hố phản phân hố tế bào sở lý thuyết công nghệ Trong đó, phân hố việc chuyển tế bào phôi sinh trở thành tế bào chuyên hoá để thực chức khác sinh lý, sinh hố; cịn phản phân hố chuyển tế bào chuyên hoá trở lại trạng thái phơi sinh, có khả phân chia tế bào Điều kiện để tế bào thể tính tồn qua đường phân hố phản phân hố mơi trường ni cấy II.Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường nuôi cấy yếu tố quan trọng, định cho thành cơng việc ni cấy mô tế bào thực vật tách rời Thành phần bao gồm: Ngun tố khống đa lượng: Là nguyên tố N, P, K, Mg, S, Ca ,chiếm nhiều môi trường nuôi cấy với hàm lượng nguyên tố thường lớn 30mg/l Chúng nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc Các nguyên tố khoáng vi lượng: Là nguyên tố Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn, Co với hàm lượng nguyên tố nhỏ 30mg/l Chúng thành phần coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn tế bào sống Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, mô tế bào chuyển sang phương thức sống dị dưỡng nên cần phải cung cấp cho chúng nguồn cacbon hữu cơ, thường đường mía saccaroza (trong số trường hợp cịn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza ) Ngoài ra, manitol, sorbitol sử dụng rộng rãi nuôi cấy huyền phù tế bào trần với chức ổn định áp suất thẩm thấu Vitamin: Tế bào mô thực vật điều kiện in vitro có khả tổng hợp vitamin lượng tổng hợp không đủ nên phải bổ sung vitamin ngoại sinh vào môi trường cấy Vitamin thường dùng nhóm B dễ hồ tan vào nước B1, B2, B3, B5, B6 với hàm lượng từ đến vài mg/l Chúng thành phần coenzim hàng loạt enzim xúc tác cho phản ứng hố sinh, khơng thể thiếu môi trường nuôi cấy *Myo-Inositol hợp chất thứ cấp có vịng thơm (chưa xếp vào vitamin), tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có tác động kích thích mạnh mẽ phân chia tế bào, sử dụng với lượng lớn ~ 100 mg/l Chất điều khiển sinh trưởng: Là thành phần quan trọng môi trường ni cấy, giúp điều khiển q trình phân hoá phản phân hoá tế bào, thể tính tồn tế bào ni cấy tế bào mô thực vật tách rời Người ta thường sử dụng chủ yếu hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng thực vật sau: - Auxin: kích thích q trình tăng trưởng tế bào, kích thích hình thành mô sẹo rễ bất định Các loại thường dùng IAA(axit indolaxetic), ỏNAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lượng dùng nhỏ 10-5-10-7 mol/l - Xytokinin: kích thích phân chia tế bào tạo chồi bất định Các loại thường dùng Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin), Zeatin, TDZ(Thidiazuron) với hàm lượng 10-5-10-7 mol/l Người ta sử dụng phối hợp auxin cytokinin với tỷ lệ hàm lượng phù hợp để đạt mục đích mong muốn Quy luật tương đối: tỷ lệ auxin xytokinin lớn mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình mẫu cấy tạo mơ sẹo, cịn tỷ lệ thấp tạo chồi Ngồi hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng sinh lý ngủ nghỉ hạt, chồi, phát triển hoa, tăng tưởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều nuôi cấy mô phân sinh; hợp chất ức chế sinh trưởng: axit absisic (ABA), CCC… sử dụng bảo quản nguồn gen invitro thành phần thường dùng không bắt buộc môi trường nuôi cấy Bao gồm nước dừa, dịch nghiền số rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt dịch chiết nấm men, hợp chất cazein, pepton để gia tăng chất dinh dưỡng, chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng phát triển mẫu cấy Chất làm đông cứng môi trường: Là giá thể cho mẫu cấy Thường dùng Agar agar Đây polysaccarit tảo biển, hoà tan với nước nhiệt độ lớn 800C dạng lỏng cịn nhiệt độ nhỏ 400C lại dạng rắn(gel) Agar có khả ngậm nước cao, cần 6-12 g làm đông đặc 1l nước trạng thái rắn tế bào mơ thực vật dễ dàng hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường III Nguyên tắc, kỹ thuật chung nuôi cấy mô tế bào: Ngày nay, hầu hết nhà nghiên cứu khoa học thống thành công nuôi cấy mơ tế bào đạt trải qua bước sau: Bước 0: Bước chuẩn bị Chọn lọc mẹ đạt tiêu chuẩn sau: - Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nơng, sinh học quý ta cần - Có khả sinh trưởng phát triển tốt - Sạch bệnh, đặc biệt virus - Nếu tự nhiên khơng có đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng mẹ điều kiện cách ly với nguồn bệnh tối ưu điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật… để có mẹ đạt tiêu chuẩn Bước 1: Ni cấy khởi động Mục đích giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy thường sử dụng phịng thí nghiệm chồi đỉnh, chồi nách mẹ Ngoài ra, tuỳ thuộc đối tượng ni cấy người ta cịn sử dụng mẫu nuôi cấy mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước tiến hành để đảm bảo mẫu vi sinh vật tỉ lệ sống cao Hiện sử dụng chủ yếu phương pháp sát trùng bề mặt chất hoá học, thường HgCl 0,1% sát trùng 5-10 phút phổ biến dung dịch hypoclorit NaOCl, Ca(OCl) 5% 20-30 phút Ngồi cịn dùng H2O2 15%,dung dịch Brom 5-10% hiệu không cao Sau khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào mơi trường thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm phơi vơ tính Việc lựa chọn mơi trường thích hợp khó khăn, cần phải đặc biệt ý đến tỷ lệ, hàm lượng chất điều khiển sinh trưởng môi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh hình thái Bước 2: Nhân nhanh mẫu Tồn q trình ni cấy mô tế bào xét cho nhằm mục đích tạo hệ số nhân chồi cao Chính giai đoạn coi giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay khơng ưu việt phương pháp nuôi cấy mô tế bào giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi cấy thường đưa thêm vào chất điều khiển sinh trưởng, chất bổ sung khác nước dừa, nước chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein kết hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt hệ số nhân chồi cao mà đảm bảo sức sống, chất di truyền, tạo thành hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn giống giai đoạn sau Tuy nhiên, tuỳ đối tượng ni cấy, người ta đạt hệ số nhân cao việc kích thích hình thành cụm chồi hay kích thích phát triển chồi nách thông qua việc tạo từ phôi vơ tính Bước 3: Tạo hồn chỉnh Khi đạt kích thước định, chồi chuyển từ môi trường bước vào môi trường tạo rễ Thường sau 2-3 tuần, từ chồi riêng lẻ xuất rễ giai đoạn này, người ta bổ sung vào mơi trường auxin auxin nhóm hormon thực vật quan trọng có chức tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Tuy nhiên, số loài chuối ngái hình thành rễ tốt đạt mơi trường khơng có chất điều hồ sinh trưởng Bước 4: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Giai đoạn đưa hoàn chỉnh từ ống nghiệm đất bước cuối quy trình ni cấy mô tế bào Cây lấy ống nghiệm phải rửa agar bám bề mặt rễ để tránh xâm nhập côn trùng nấm mốc.Theo Bhojwani Razdan(1983), quy trình thành cơng trước đưa đất ta ươm cát có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày Trong khoảng thời gian này, rễ đượcc sinh bắt đầu hình thành Sau chuyển đất với chế độ chăm sóc bình thường Tuy nhiên cịn số vấn đề tồn việc ni cấy mơ tế bào.Đó là: - Sự bất định di truyền + Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy tượng biến dị soma: sai khác hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá, di truyền tái sinh nhận giai đoạn invitro giai đoạn exvitro + Khắc phục: Chọn mẫu cấy mơ non chun hố để dễ điều khiển phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh trưởng sử dụng, từ giảm ảnh hưởng chúng Đồng thời, 10 ... mở đầu Viện Di truyền nông nghiệp thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân Viện Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984) Hiện nay, Viện nằm địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội Chức Viện : -Nghiên... lương thựcthực phẩm, sản xuất loại chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp bền vững bảo vệ môi trường -Tăng cường hợp tác quốc tế tham gia đào tạo cán lĩnh vự Di truyền Công nghệ sinh học Để thực. .. bào thực vật đưa vào chương trình chọn giống nhân giống đại, góp phần tích cực vào lý luận sinh học trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở hướng cho nghiên cứu di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực