Phân tích thực phẩm GVHD TS Trần Bích Lam MỤC LỤC I LỜI MỞ ĐẦU 2 II PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU 3 1 Mục đích và yêu cầu 3 2 Thủ tục lấy mẫu và quản lý mẫu 3 2 1 Trách nhiệm của người phụ trách phòng thí nghiệ[.]
Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích MỤC LỤC I.LỜI MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………….2 II.PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU ………………………………………………… ……… 1.Mục đích yêu cầu ……………………………………………………………………….……… 2.Thủ tục lấy mẫu quản lý mẫu ………………………………………………………………… 2.1 Trách nhiệm người phụ trách phịng thí nghiệm…………………………………………… 2.2 Trách nhiệm người lấy mẫu………………………………………………………………… 2.3 Quy định lấy mẫu……………………………………………………… ……………………… III PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA NHANH………………………………………………………… 1.Kiểm tra hàm lượng Urê thủy sản…………………………………………………………… 2.Kiểm nhanh dư lượng Chloramphenicol……………………………………………………………8 3.Phân tích thủy ngân phương pháp CV-AAS…………………………………………… Nguyên tắc kỹ thuật nguyên hóa khơng lửa…………………………………………… 11 IV CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ……………………………………………………… 14 Phương pháp định lượng Sulfit sản phẩm thủy sản …………………………………… 14 Phương pháp định tính axit boric muối borat sảm phẩm thủy sản………………… 15 Phương pháp định tính Urê sản phẩm thủy sản……………………………………… 16 Phương pháp định lượng sắc ký ion muối Polyphosphat sản phẩm thủy sản… 16 Phương pháp định lượng sắc ký khí hàm lượng………………………………………… 18 Ứng dụng phương pháp nguyên tử hóa lửa………………………………… 23 Salmonella sản phẩm thuỷ sản 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………………… 26 Page Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích I LỜI MỞ ĐẦU Ngành thủy sản giới nước ta có bước phát triển nhanh chóng nhiều lĩnh vực kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, kỹ thuật khai thác thủy sản, quản lý môi trường - nguồn lợi thủy sản, quản lý dịch bệnh thủy sản, công nghệ sinh học ứng dụng thủy sản chế biến thủy sản Ngành thủy sản trở thành ngành kinh tế mũi nhọn nhiều quốc gia, có Việt Nam Ở nước ta, Đồng Bằng Sơng Cửu Long (ĐBSCL) có vị trí vai trò quan trọng phát triển thủy sản nước, chiếm 80% tổng diện tích ni sản lượng ni nước Vệ sinh an tồn thực phẩm nước nói chung TP nói riêng tạo nhiều lo lắng cho người dân Thực chất, nhiều kiện việc tiếp tục sử dụng hoá chất cấm dùng nuôi trồng, chế biến, bảo quản sản phẩm thủy sản,và việc sản xuất số sản phẩm chất lượng Gần số vấn đề liên quan đến quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm, khác biệt kết phân tích kiểm tra chất lượng sản phẩm vừa gây khơng khó khăn cho người sản xuất vừa tạo thêm lo lắng cho người tiêu dùng cố gắng tạo ưu nhiều mặt để có nhiều lợi với cương vị l thành viên bình đẳng WTO Theo hệ thống cảnh báo thông báo Châu Âu, năm 2004, số hàng thực phẩm Việt Nam xuất sang châu Âu, có 59 lơ không đạt chất lượng (Việt Nam xếp thứ 13 trongsố nước bị cảnh báo), số nầy 124 vàViệt Nam xếp thứ năm 2005 Trong tháng đầu năm 2007, nhiều lô hàng nông thủy sản xuất bị Hoa kỳ, Canada, Nhật, Nga, Singapore từ chối Những kiện phản ánh phần tồn đọng, bất cập sản xuất doanh nghiệp Việt Nam vào WTO phải chấp nhận cạnh tranh khốc liệt chất lượng sân nhà Đặc biệt phía người tiêu dùng, nước phát triển, họ quan tâm đến chất lượng hàng hóa, đặc biệt chất lượng thực phẩm, tạo sức ép lớn nhà sản xuất nhà quản lý Người tiêu dùng Việt Nam chắn có yêu cầu xúc chất lượng hàng hóa, nhiên sống nói chung cịn khơng khó khăn yêu cầu chất lượng chưa đủ mạnh để tạo sức ép hữu hiệu sản xuất quản lý Tuy nhiên quan tâm hang đầu bà nội trợ Vấn đề then chốt làm quản lý tốt chất lượng nông thủy sản thực phẩm Việt Nam khơng nhiễm vi sinh, khơng chứa hóa chất bị cấm, hóa chất ngồi danh mục cho phép, hay bị nhiễm hóa chất giới hạn cho phép hầu nâng cao lực cạnh tranh doanh nghiệp, bảo đảm an tồn cho người tiêu dùng, đóng góp phần quan trọng vào phát triển kinh tế-xã hội đất nước Việc kiểm tra chất lượng thủy sản gặp nhiều hạn chế số phòng thử nghiệm có trình độ kinh nghiệm cịn việc mở rộng hoạt động kiểm nghiệm đánh giá, chứng nhận chất lượng sản phẩm hàng hóa cho tổ chức, cá nhân nước chưa thật phổ biến Page Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích II PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU Mục đích yêu cầu: - Trong kiểm nghiệm vi sinh, công đoạn lấy mẫu dù thực bên ngồi phịng thí nghiệm lại công đoạn quan trọng kiểm định chất lượng thủy sản Mọi sai sót cơng đoạn ( Ví dụ: Lượng mẫu khơng đủ, mẫu bị nhiễm bẩn từ mơi trường ngồi, bị nhiễm bẩn từ dụng cụ, bị biến đổi trình lý, hóa, sinh học bảo quản) dẫn đến sai lệch nghiêm trọng kết phân tích.Vì vậy, thực cơng đoạn nghiêm túc quy cách góp phần khơng nhỏ vào xác kết phân tích - Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau: Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng nơi lấy mẫu ( kiểm tra vệ sinh công nghiệp) nhận dạng rõ ràng Hàm lượng chất hay VSV cần xác định không biến đổi kể từ lấy mẫu đến phân tích - Để đáp ứng hai điều kiện trên, ngồi việc xây dựng kế hoạch, chương trình lấy mẫu cho thơng tin cần thiết, phịng kiểm nghiệm cịn phải thiết lập tuân thủ nghiêm ngặt quy định thủ tục lấy quản lý mẫu, thành viên có liên quan cần phải đảm bảo di trì ổn định đặc tính mẫu trước đưa vào thử nghiệm Thủ tục lấy mẫu quản lý mẫu: 2.1 Trách nhiệm người phụ trách phòng kiểm nghiệm: - Chỉ định người lấy mẫu cụ thể: người đào tạo hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu - Đảm bảo mẫu lấy theo u cầu:có đầy đủ chương trình/kế hoạch, phương pháp lấy mẫu thích hợp 2.2.Trách nhiệm người lấy mẫu: - Đọc kỹ tài liệu làm lấy mẫu tương ứng - Chuẩn bị đủ trang bị, dụng cụ lấy mẫu bảo quản mẫu phù hợp - Chuẩn bị biên lấy mẫu, nhãn mẫu 2.3.Quy định lấy mẫu: a Kế hoạch lấy mẫu: Page Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích - Lượng mẫu để kiểm tra lô hàng tùy thuộc vào sản phẩm cụ thể, khơng u cầu kiểm nghiệm.Theo quy định tiêu chuẩn Việt Nam lượng mẫu lấy khơng lớn 0.1% lơ hàng, lô hàng lớn, tỷ lệ lấy mẫu thấpnhưng khơng đơn vị sản phẩm - Tùy vào mục đích kiểm tra tiêu chất lượng thủy sản có phương pháp lấy mẫu cách lấy mẫu khác Và chọn thiết bị phân tích tối ưu cho lợi tiêu - Mật độ VSV thực phẩm giới hạn số lượng định tùy thuộc vào: nhóm VSV cần phân tích (tổng số tạp khuẩn hiếu khí, tổng số coliforms ), đối tượng thực phẩm (hàng đông, hàng luộc) luật vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia nhập Việc xác định số l ượng VSV thực phẩm khơng phản ánh xác số lượng VSVthực tế có mẫu, theo quy ước, khoảng giới hạn tính theo cấp độ thiết lập để nhận biết mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu: Cấp 1: Là cách lấy mẫu cổ điển, trogn việc đánh giá kết kiểm nghiệm dựa giá trị mẫu, vd: tiêu chuẩn VN số nước châu Á …cho phép tổng số vi khuẩn hiếu khí mặt hàng thủy sản đông lạnh 450 nm Một kĩ thuật hiệu chỉnh cản nhiễu matrix hiệu chình dựa hiệu ứng Zeeman Nguyên tắc theo sơ đồ trên: Bức xạ phát từ đèn HCL EDL xạ không phân cực sau khi qua phân kính cực quay xạ tách thành thành phần phân cực mà mặt phẳng phân cực trực giao với từ trường mạnh áp vào nguyên tử lò graphite Từ trường tách mức lượng điện nguyên tử thành vài vạch hấp sít ( gần 0.1 nm) Bức xạ phân cực qua nguyên tử đặt từ trường Ở nửa chu kì quay, thành phần phân cực có mặt phẳng song song với trường ngồi ta đo tín hiệu Vmẫu + matrix chu khì quay thành phần phân cực trực giao với từ trường ta đo tín hiệu Vmatrix Vậy : Vmẫu = Vmatrix - Vmẫu + matrix Các ứng dụng: Xác định Pb Nhiệt độ tro hóa 8000C Nhiệt độ nguyên tử hóa 12000C Các chất modifier thường dùng là: 50 µg NH4NO3,hoặc 50 µg La(NO3)2,hoặc 50 µg Mg(NO3)2,hoặc 50 µg ascorbic acid Tín hiệu hấp thụ: 20µL 1.7 µg/L dung dịch Pb cho tín hiệu 0.1A Xác định Cd: + Khi khơng có modifier : Page 12 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Nhiệt độ tro hóa 3000C Nhiệt độ nguyên tử hóa 9000C + Khi có modifier 10 µg Pd(NO3)2 20 µg NH4NO3 20 µg Mg(NO3)2: Nhiệt độ tro hóa 8000C Nhiệt độ ngun tử hố 10000C Tín hiệu hấp thu : 20µL 0.6 µg/L dung dịch Cd cho tín hiệu khoảng 0.1A Xác định As : + Khơng có modifier nhiệt độ tro hóa 4000C: Nhiệt độ nguyên tử hóa 21000C + Khi có modifier 20 µg Ni(NO3)2 Nhiệt độ tro hóa 12000C Nhiệt độ ngun tử hóa 26000C Tín hiệu hấp thu: 20 µL 0.6 µg/L dung dịch As cho tín hiệu khoảng 0.1A Xác định thủy ngân : + Khi khơng có modifier Nhiệt độ tro hóa 2000C Nhiệt độ nguyên tử hóa 7500C + Có modifier 50 µg (NH4)2Cr2O7 500 µg vàng 500 µg Pd Nhiệt độ tro hóa 5000C Nhiệt độ nguyên tử hóa 7500C Tín hiệu hấp thu 20µL 60 µg/L dung dịch Hg cho tín hiệu cỡ 0.1A Ưu nhược điểm phương pháp GF-AAS - Ưu điểm: Có độ nhạy cao cỡ ppb, có gấp hàng trăm đến hàng ngàn lần phép đo F-AAS Do phân tích hàm lượng vết kim loại mẫu thực phẩm không cần phải làm giàu mẫu Phép đo đòi hỏi lượng mẫu nhỏ lần đo cần từ 20 µL - 50 µL dung dịch mẫu Do khơng cần lượng lớn mẫu phân tích tốn hóa chất dung mơi tinh khiết cao, đắt tiền.Thao tác đo dễ dàng xác định liên tiếp nhiều nguyên tố mẫu Kết phân tích ổn định, sai số nhỏ - Nhược điểm: Do có độ nhạy cao nên tránh nhiễm bẩn, dụng cụ hóa chất phải có độ tinh khiết cao Ảnh hưởng phổ lớn khắc phục hệ thống bổ để đảm bảo độ nhạy cỡ ppb nhiều nguyên tố IV CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THEO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG Phương pháp định lượng Sulfit sản phẩm thủy sản 1.1 Phạm vi áp dụng Page 13 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng sulfit thủy sản sản phẩm thủy sản Giới hạn phát phương pháp 10 mg/g 1.2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp Ủy ban Phân tích thực phẩm khối Bắc Âu NMKL số 132 - 1989 (NODISK METODIKKOMMITTE FOR LIVSMEDEL Nordic committee on food analysis - Sulphite Spectrophotometric determination in foods) 1.3.Nguyên tắc Mẫu sản phẩm axit hóa axit sulfuric H2SO4 chưng cất thiết bị Kjeldahl bán vi lượng Hơi SO2 tạo thành phản ứng với 2,2'- đinitro-5,5'-đithiobenzoic axit (DTNB) cốc nhận để hình thành phức axit 5-mercapto-2- nitrobenzoic có mầu vàng chanh đậm Cường độ mầu phức axit đọc máy quang phổ bước sóng l 412 nm Nồng độ SO2 mẫu tính tốn theo cường độ mầu phức axit theo phương pháp ngoại chuẩn 1.4 Phương pháp tiến hành - Chuẩn bị mẫu - Chuẩn bị mẫu thử: đồng mẫu thử máy nghiền đồng thể Cân mẫu, mẫu 5,00 g cốc có mỏ 100 ml Trộn mẫu cân với 15 ml nước cất - Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng mẫu xác định trước không chứa sulfit Chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị mẫu thử quy định - Lập đường chuẩn - Cho vào bình tam giác dung tích 250 ml, bình ml dung dịch chuẩn Iot - Chuẩn độ với dung dịch chuẩn đisulfit (0,0005 M) (0,064mg SO2/ml) đến mầu vàng nhạt - Thêm dung dịch hồ tinh bột tiếp tục chuẩn độ dung dịch đổi mầu - Dùng pipette nhỏ 0,1, 2, 3, 4, ml dung dịch đisufit chuẩn độ vào bình định mức 50 ml có chứa 25 ml dung dịch thuốc thử 2,2'-đinitro-5,5'-đithiobenzoic axit (DTNB) Sau đó, pha lỗng đến vạch với dung dịch đệm phosphat pH=8 để yên 10 phút - Hiệu chỉnh máy quang phổ UV-VIS với nước cất 412 nm (độ hấp thu nước cất) Xác định độ hấp thụ dung dịch chuẩn bị máy quang phổ - Thành lập đồ thị theo giá trị độ hấp thu nồng độ sulfit dãy chuẩn theo mg/ml Hàm lượng SO2 dịch mẫu tính theo đường hồi quy tuyến tính đồ thị thu sau hiệu chỉnh với giá trị hấp thu mẫu trắng - Tiến hành thực nghiệm - Chuyển mẫu trắng mẫu thử chuẩn bị theo Điều 5.1 vào bình chưng cất Tráng rửa cốc đựng mẫu với 10 ml nước cất cho hết vào bình chưng cất Lắp đặt bình vào chưng cất Kjeldahl bán vi lượng, dung tích 100 ml - Đặt bình tam giác thu hồi chứa 50 ml DTNB đầu ống ngưng tụ Nối đường dẫn khí nitơ nước làm nguội vào thiết bị chưng cất - Cho vào bình chưng cất 20 ml axit sulfuric 10 N qua phễu gắn phía chưng cất nhanh chóng đóng kín hệ thống lại.Chưng cất vịng phút - Lấy bình hứng khỏi chưng cất Rửa bình ngưng ống nối với dung dịch đệm phosphat pH = 8, chuyển dịch rửa vào bình thu hồi - Chuyển tồn dịch cất vào bình định mức dung tích 50ml rửa bình thu hồi với dung dịch đệm phosphat Chuyển dịch rửa vào bình định mức định mức với dung dịch đệm - Đọc số ABS sau 10 phút với bước sóng 412 nm dùng nước cất dung dịch so sánh Nếu trị số ABS > 1,5, phải pha loãng dung dịch với hỗn hợp với tỷ lệ 1:1 dung dịch đệm phosphat dung dịch thuốc thử DTNB tiến hành đọc lại 1.5 Tính kết - Tính nồng độ dung dịch gốc đisulfua theo cơng thức sau: Page 14 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Trong đó: V0 số ml dung dịch iot 0.05M sử dụng Điều 5.2.1 VSO2 số ml dung dịch gốc đisulfit 0.0005M dùng cho chuẩn độ, C0 nồng độ dung dịch iot , tính theo mol/1, MV phân tử gam SO2 (64,06 g/mol) - Tính hàm lượng SO2 mẫu - Tính lượng SO2 dung dịch mẫu từ đường chuẩn - Tính nồng độ SO2 mẫu theo cơng thức sau: Trong đó: A nồng độ SO2 tìm thấy từ đường chuẩn, tính theo mg/ml, V thể tích dịch cất , tính theo ml, g hệ số pha lỗng , g = khơng pha lỗng, m khối lượng mẫu cân, tính theo g 1.6.Báo cáo kết Hàm lượng sufit giá trị trung bình lần thử song song tính theo mg/kg Phương pháp định tính axit boric muối borat sảm phẩm thủy sản 2.1 Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn quy định phương pháp định tính axit boric muối borat sản phẩm thủy sản Giới hạn phát phương pháp 0,1 % 2.2 Phương pháp tham chiếu: Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp thức Hiệp hội nhà hóa học phân tích quốc tế AOAC 970.33 -1995 (AOAC official method 970.33 - Boric acid and borates in food) Thường quy kỹ thuật định tính bán định lượng xít boric natri borat thực phẩm (Quyết định số 3390/QĐ-BYT ngày 28/91/2000 Bộ Y tế) 2.3 Nguyên tắc Mẫu sản phẩm chiết thử sơ dung dịch nước cất thử xác nhận than hóa trước chiết Axit boric muối có dịch chiết xít hóa tác dụng với curcumin giấy nghệ tạo thành phức mầu cam đỏ Trong môi trường amoniac (NH 3) mầu cam đỏ chuyển thành mầu xanh lục trở lại mầu đỏ axit clohyđric (HC1) 2.4 Phương pháp tiến hành: - Thử sơ - Dùng đũa thủy tinh khuấy trộn 25 g mẫu xay nghiền với 10 ml nước cất bình tam giác 125 ml đậy miệng bình mặt kính đồng hồ - Đun từ từ bình tam giác bếp điện sôi dung dịch Chú ý phải lắc đun Làm nguội mẫu lọc dịch giấy lọc whatman số 02 - Axit hóa dịch lọc axit HCl đậm đặc tới pH = rót dịch vào ống nghiệm 15 ml - Nhúng đầu giấy nghệ vào ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng 1/2 chiều dài tờ giấy Lấy giấy để khô tự nhiên Quan sát mẫu giấy thử, tiến hành đọc kết Page 15 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích - Thử xác nhận: Tiến hành thử khẳng định mẫu cho kết dương tính phép thử sơ theo quy trình sau: Kiểm hóa 25 g mẫu với nước vôi sữa vôi chén sứ Đun từ từ mẫu chén sứ bếp điện cho bay đến khô Đặt chén sứ vào lò nung nhiệt độ 3500c chất hữu cháy thành than hồn tồn Sau đó, để nguội hòa tan cặn với ml nước cất thêm giọt axit HCl đậm đặc dung dịch có tính axit rõ rệt (pH = 5) Lọc dung dịch vào ống nghiệm Nhúng đầu giấy nghệ vào ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng 1/2 chiều dài tờ giấy Lấy giấy để khô tự nhiên Quan sát mầu giấy thử, tiến hành đọc kết 2.5 Đọc kết quả: Nếu có borat mẫu giấy nghệ chuyển sang mầu cam đỏ đặc trưng Đặt giấy nghệ lên miệng ống nghiệm chứa dung dịch amoni hyđroxit NH4OH đậm đặc Giấy nghệ phải chuyển sang mầu xanh lục trở lại mầu đỏ đặt giấy ống nghiệm chứa axit HCl Phương pháp định tính Urê sản phẩm thủy sản 3.1 Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn quy định phương pháp định tính urê sản phẩm thủy sản Giới hạn phát phương pháp 0,5 % 3.2 Nguyên tắc : Mẫu sản phẩm chiết với dung dịch nước Urê có dịch chiết phản ứng với thuốc thử p đimetylaminobenzalđehyt tạo phức mầu vàng chanh đặc trưng 3.3 Phương pháp tiến hành: - Chuẩn bị mẫu - Đồng khoảng 200 g mẫu thủy sản máy nghiền đồng thể - Cân 25 g mẫu xay nghiền đưa vào bình tam giác dung tích 50 ml Thêm 25 ml nước cất khuấy trộn đũa thủy tinh Sau đó, đậy miệng bình mặt kính đồng hồ - Đun từ từ bình tam giác bếp điện sôi Chú ý, đun phải lắc Làm nguội mẫu dùng giấy lọc Whatman để lọc lấy dịch - Tiến hành: Nhỏ - giọt dịch mẫu vào ống nghiệm chứa ml dung dịch thuốc thử urê Đun nóng dung dịch phút Quan sát mầu dung dịch Tiến hành đọc kết 3.4 Đọc kết quả: - Kết luận mẫu có Urê mầu dung dịch ống nghiệm chuyển sang mầu vàng chanh đậm - Nồng độ Urê mẫu cao mầu vàng dung dịch đậm Phương pháp định lượng sắc ký ion muối Polyphosphat sản phẩm thủy sản 4.1.Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng muối polyphosphat bao gồm ortophosphat (monophosphat), pyrophosphat (điphosphat), tripolyphosphat thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký ion 4.2 Phương pháp tham chiếu: Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp Trung tâm Hóa học tư pháp quốc gia Cục Thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (National Forensic Chemistry Center, U.S Food and Drug Page 16 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Administration, Cincinnati, Ohio: De- termination of tripolyphosphate and related hydrolysis products in processed shrimp) 4.3 Nguyên tắc: Polyphosphat mẫu thủy sản chiết tách nước cất khử ion Dịch chiết làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) cột chiết pha rắn C18 Hàm lượng polyphosphat có dịch chiết xác định máy sắc ký ion sử dụng hệ thống phản ứng sau cột với tác chất phản ứng sắt nitrate axit percloric đầu dị UV bước sóng 330 cm theo phương pháp ngoại chuẩn 4.4 Phương pháp tiến hành: - Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác 0,5 g mẫu thủy sản (ký hiệu m) đồng vào chai nhựa dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất khử ion vào chai lắc mạnh 30 phút máy lắc mẫu Sau đó, ly tâm chai 10 phút tốc độ 3000 vòng/phút máy ly tâm Lọc dịch chiết qua màng lọc mẫu 0,45 âm - Chuẩn bị mẫu trắng: Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị mẫu thử thay 0,5 g thủy sản 0,5 ml nước cất khử ion - Làm dịch chiết: Chuẩn bị cột: Nối cột chiết pha rắn C18 vào đầu xilanh thủy tinh 100 ml Thêm 10 ml metanol, 10 ml nước cất khử ion vào xanh thủy tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột Làm dịch chiết: Cho dịch chiết thu vào cột C18 chuẩn bị Sau cho dịch chiết vào cột, thu dịch khỏi cột vào bình định mức 100 ml (đã bỏ ml đầu) Sau đó, tráng rửa bình chứa lần, lần ml nước cất khử ion Cho nước tráng qua cột gom dịch qua cột vào bình định mức Định mức tới vạch nước cất (ký hiệu v) Tiến hành phân tích dịch thu máy sắc ký ion - Tiến hành phân tích máy sắc ký ion : Điều kiện phân tích +Đặt chế độ làm việc cho máy sắc ký ion sau: Cột sắc ký ion: Dionex IonPac (L x ID: 250 x mm, tiền cột IonPac NG1 (L x ID: x 50mm) Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng Pha động: Dung dịch axit Nitric 70 mm Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút Bước sóng cài đặt cho đầu dị UV 330 nm Thể tích tiêm: 100 m l +Điều kiện hệ thống phản ứng sau cột: Tác nhân: 1g/l sắt nitrat axit Percloric % Tốc độ dòng 0,5 ml/phút: Nhiệt độ phản ứng ống teflon nhiệt độ phòng Ổn định cột sắc ký 30 phút pha động Tiêm dung dịch chuẩn vào máy sắc ký Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ loại phosphat theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) Tiêm dung dịch mẫu thử dung dịch mẫu trắng làm vào hệ thống sắc ký, mẫu lần Tính kết thu - Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích : Độ lặp lại lần tiêm: Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn pyrophosphat 10 m g/ml 25m g/ml phải nhỏ 1,2 % Đường chuẩn loại phosphat phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn 0,99 Khoảng tuyến tính: Page 17 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Ortophosphat: 10 - 100 m g/ml Pyrophosphat: 0,5 - 50 m g/ml Tripolyphosphat: 10 - 500 m g/ml 4.5 Tính kết quả: Hàm lượng phosphat có mẫu tính sở đường chuẩn thu (5.4.3) Với đường chuẩn dạng y = ax + b, hàm lượng phosphat có mẫu tính theo cơng thức sau: Trong đó: C nồng độ phosphat có mẫu, tính theo m g/g Y hiệu số diện tích pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào máy, tính theo đơn vị diện tích a, b thông số đường chuẩn xác định F hệ số pha lỗng mẫu có giá trị tỷ số thể tích dịch chiết thu sau làm khoa lượng mẫu m sử dụng Phương pháp định lượng sắc ký khí hàm lượng Cloramphenicol sản phẩm thủy sản 5.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol (sau gọi tắt CAP) thủy sản sản phẩm thủy sản hệ thống sắc ký khí (sau gọi tắt GC) Giới hạn phát phương pháp 0,3 m g/kg 5.2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo phương pháp cơng bố tạp chí Hiệp hội nhà hóa học phân tích; tập 77, số 3, năm 1994 (Journal of AOAC intemational; Voi 77, No 3, 1994: Gas chromatographic determination of chloramphenicol residues in shrimp) 5.3 Nguyên tắc CAP mẫu thủy sản chiết tách etyl axetat Dịch chiết sau cạn, cặn xử lý với sylon (chất tạo dẫn xuất trimetylsylyl), để tạo dẫn xuất trimetylsylyl CAP Hàm lượng dẫn xuất CAP xác định hệ thống GC với đầu dò bắt giữ điện tử (sau gọi tắt ECD) theo phương pháp nội chuẩn HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ : Page 18 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Hình 1: Hệ thống sắc ký khí a Nguyên tắc hoạt động: Mẫu khảo sát dạng lỏng hay khí bơm vào nạp mẫu (nếu mẫu lỏng gia nhiệt để chuyển sang dạng khí), khí mang cung cấp từ hệ thống (bao gồm bình khí điều chỉnh lưu lượng) dẫn vào hệ thống cột tách nằm buồng điều nhiệt Sau tách, cấu tử vào detector chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu khuếch đại chuyển sang ghi Ở máy đại, thay chuyển sang ghi, tín hiệu chuyển sang tích phân kế máy tính Tại đây, tín hiệu xử lý chuyển sang phận in kết Trên sắc đồ nhận phận in kết ta thu tín hiệu ứng với cấu tử gọi peak với thời gian lưu t R peak đại lượng dùng để định tính, diện tích peak sử dụng để định lượng tR(A) tR(B) t 5.4 Phương pháp tiến hành - Chuẩn bị mẫu thử Cân 10,0 g mẫu thủy sản nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml Thêm 100 ml dung dịch M - CAP làm việc 20 ml etyl axetat vào ống nghiền máy nghiền đồng thể khoảng 10-15 giây Sau đó, ly tâm phút tốc độ 3000 vịng/phút Gạn dịch vào bình lê 100 ml Page 19 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Cho thêm 20 ml etyl axetat vào phần cặn ống ly tâm trộn Sau đó, ly tâm phút tốc độ 3000 vịng/phút Gạn dịch vào bình lê Có dịch bình lê máy quay chân khơng cịn khoảng 2,0 - 4,0 ml dung dịch nhiệt độ 500c Chuyển dịch lại sang ống ly tâm 50 ml pipet Pasteur Rửa bình lê lần, lần 2,0 ml etyl axetat Tất dịch rửa cho vào ống ly tâm Cô cạn dung dịch ống ly tâm dịng khí nitơ nhiệt độ 50 0C Thêm 25 ml dung dịch muối NaCl % , ml methanol 15 ml hexan vào ống ly tâm Đậy nắp ống ly tâm lắc thật mạnh phút Sau đó, ly tâm phút tốc độ 800 vòng/phút Loại bỏ lớp hexan pipet Pasteur Lặp lại trình thêm lần, lần 15 ml hexan CAP pha nước chuyển sang pha hữu cách lắc mạnh với 15 ml etyl axetat 30 giây Ly tâm hỗn hợp phút tốc độ 800 vòng/phút Dùng pipet Pasteur chuyển lớp etyl axetat vào bình lê 100 ml Lặp lại trình lần với 15 ml etyl axetat Dịch chiết đưa vào bình lê Cơ hỗn hợp dịch chiết lại khoảng - ml máy quay chân không nhiệt độ 55 0c Chuyển lượng dịch lại vào ống ly tâm 15 ml Rửa bình lê lần, lần với ml etyl axetat Cơ cạn dịch thu dịng nitơ nhiệt độ 500c Chuyển tiếp sang bước tạo dẫn xuất Sylyl - Chuẩn bị mẫu trắng: Mẫu trắng định nghĩa mẫu thủy sản xác định khơng có cloramphenicol Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị mẫu thử quy định - Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi : Cho thêm 30,0 ml dung dịch chuẩn CAP 0,1m g/ml 30 m l dung dịch chuẩn M-CAP 0,1 m g/ml vào 10,0g mẫu trắng tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị mẫu thử quy định - Tạo dẫn xuất Sylyl: Thêm 100 m l Sylon vào cặn ống ly tâm, đóng nắp lắc mạnh máy rung trộn mẫu Đặt ống ly tâm vào bể điều nhiệt nhiệt độ 55 0c 40 phút: Làm bay dung dịch ống gần khô (lưu ý khơng để khơ hồn tồn) dịng nitơ nhiệt độ phòng Thêm 500ml toluen lắc mạnh cho tan cặn hoàn toàn - Tiến hành phân tích hệ thống GC Điều kiện phân tích: Đặt chế độ làm việc cho hệ thống GC sau: +Chương trình nhiệt độ cột: Tăng từ nhiệt độ 1500C lên nhiệt độ 2700C Với tốc độ 200 C/phút, giữ 8,5 phút Tăng từ nhiệt độ 2700C lên nhiệt độ 2900C Với tốc độ 200C/phút, giữ 2,0 phút + Nhiệt độ đầu tiêm: 2700C: + Nhiệt độ detector: 3400C + Tốc độ dịng khí mang He: ml/phút + Khí bổ trợ: N2 theo điều kiện GC + Thể tích tiêm: m l Ổn định cột sắc ký chế độ làm việc Tiêm dung dịch chuẩn tạo dẫn xuất trước sau dung dịch thử Xác định tỷ số diện tích pic (CAP/M-CAP) Tiêm dung dịch tạo dẫn xuất mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi vào hệ thống GC mẫu lần Tính kết thu theo Điều - Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích Độ lặp lại lần tiêm: Độ lệch chuẩn (CV S) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5 % Độ thu hồi (R): Độ thu hồi xác định cho lần chạy mẫu Độ thu hồi tính phải lớn 80% Kiểm tra xác nhận (confirmatory test) : Đối với mẫu phát Cloramphenicol phương pháp GC-ECD này, phải kiểm tra xác nhận kết GC-MS Page 20 ... hố chất cấm dùng ni trồng, chế biến, bảo quản sản phẩm thủy sản, và việc sản xuất số sản phẩm chất lượng Gần số vấn đề liên quan đến quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm, khác biệt kết phân tích kiểm. .. lượng Sulfit sản phẩm thủy sản 1.1 Phạm vi áp dụng Page 13 Phân tích thực phẩm Lam GVHD: TS.Trần Bích Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng sulfit thủy sản sản phẩm thủy sản Giới hạn... hàm lượng Cloramphenicol sản phẩm thủy sản 5.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol (sau gọi tắt CAP) thủy sản sản phẩm thủy sản hệ thống sắc ký khí