T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 1 2022 36 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DO ECHINOCOCCUS Ở QUY MÔ PHÒNG XÉT NGHIỆM Nguyn Thu Hương1, Nguyn Th Anh Vân1, Nguyn Phương Thoa1 Phí Th Hươn[.]
Tạp chí y dợc học quân số - 2022 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DO ECHINOCOCCUS Ở QUY MƠ PHỊNG XÉT NGHIỆM Nguyn Thu Hương1, Nguyn Th Anh Vân1, Nguyn Phương Thoa1 Phí Th Hương Liên1, Nguyn Minh Toàn1, Nguyn Ngc Hương Ly2 Đng Anh Sơn3, Nguyn Th Hương Bình4 TĨM TẮT Mc tiêu: Hồn thiện quy trình kỹ thuật phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhiễm Echinococcus người Việt Nam (ECHO-LAMP) Đi tưng phương pháp: Các hoạt động thực nghiệm phịng thí nghiệm gồm: 1) Thiết kế sinh phẩm dựa nguyên lý phản ứng LAMP để chẩn đoán trường hợp nhiễm Echinococcus, 2) Khảo sát khả phát trường hợp nhiễm Echinococcus sinh phẩm chế tạo Kt qu: Bộ sinh phẩm LAMP chẩn đốn Echinococcus có khả phát trường hợp nhiễm lâm sàng Bộ sản phẩm khuếch đại LAMP chế tạo gồm thành phần, đó, cặp mồi thiết kế có kích thước 228bp, chứng dương tạo Kít có nồng độ 100 ng/µL Phản ứng LAMP chế tạo có nồng độ MG 0,004% MgSO4 mM, phản ứng khuếch đại gen mồi 63 C 60 phút, ngưỡng -8 phát Kít 10 ng/µL tương đương với 2,82 x 10 gen/µL Khả phát ca nhiễm Echinococcus sinh phẩm với độ nhạy 93% độ đặc hiệu 98% Kt lun: Bộ kít LAMP chế tạo thực phịng thí nghiệm mà không cần trang thiết bị đặc biệt phù hợp với việc phát tác nhân gây bệnh lây truyền từ động vật sang người * Từ khóa: Echinococcus; Gen 18SrRNA; LAMP Development of LAMP Technique in the Detection of Human Echinococcosis at the Laboratory Scale Summary Objectives: To perfect the technical process in developing the Echinococcus diagnostic kit and evaluate the sensitivity and specificity of the biological kit in the laboratory Subjects and methods: The study was carried out on the experimental activities in the laboratory, including 1) Designing a biological kit based on the LAMP reaction principle to diagnose Echinococcus infections, 2) Surveying the ability of the preparation kit to detect human Echinococcus infections Results: The performance of the Echinococcus-LAMP test (ECHO-LAMP) was found to be stable includes components In which the designed primer pair was 228 bp in size, Trường Đại học Y tế Công cộng Trường PTTH Chuyên Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Bệnh viện Đa khoa Vinmec Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương Ngưi phn hi: Nguyn Thu Hương (nth14@huph.edu.vn) Ngày nhn bài: 19/11/2021 Ngày đưc chp nhn đăng: 16/12/2021 36 Tạp chí y dợc học quân số - 2022 the positive control was created with the kit with a concentration of 100 ng/µL The fabricated LAMP reaction has MG concentration of 0.004% and MgSO4 mM, primer gene detection -8 reaction at 63 C for 60 minutes, the detection threshold of the kit is 10 ng/µL corresponding to 2.82x10 gene copies/µL The sensitivity and specificity were high above 95% for humane Echinococcus Conclusion: The developed ECHO-LAMP test does not require a cold chain or a sophisticated laboratory It holds promise for use as a routine simple molecular tool for point-of-care Echinococcosis diagnosis in zoonotic endemic diseases areas * Keywords: Human Echinococcus; Gen 18S rRNA; LAMP ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh nang nước (hydatid disease) hay gọi bệnh hydatidosis Echinococcosis bệnh nhiễm ký sinh trùng lây truyền từ chó sang người Người nhiễm bệnh nuốt trứng sán thức ăn, nước uống đất bị ô nhiễm, sau tiếp xúc trực tiếp với động vật Trên giới, có triệu người bị nhiễm Echinococcus với tỷ lệ tử vong sau phẫu thuật 2,2% khoảng 6,5% tái phát sau can thiệp [6] Việc chẩn đoán bệnh chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng xét nghiệm miễn dịch phát kháng nguyên kháng thể lưu hành máu Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng thường không đặc hiệu, thời gian ủ bệnh dài có biểu bệnh vào giai đoạn muộn khó điều trị Việc phát nhanh Echinococcus để có biện pháp điều trị hiệu quan trọng Hiện nay, kỹ thuật xét nghiệm Echinococcus chủ yếu dựa vào xét nghiệm tìm nang ấu trùng sán thể Xét nghiệm xem phương pháp chuẩn vàng chẩn đoán xác định ca bệnh Một số kỹ thuật sử dụng phổ biến phòng xét nghiệm gồm kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp, nhuộm soi mô bệnh học, kỹ thuật miễn dịch phát kháng nguyên, kháng thể [4, 7, 8, 9, 10] Tuy nhiên, xét nghiệm huyết học xét nghiệm hữu ích giai đoạn người nhiễm sán trường hợp bệnh mạn tính khơng tìm thấy trứng phân Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào loại test, có tượng dương tính kéo dài phản ứng chéo lồi, khó triển khai thực địa Xét nghiệm sinh học phân tử PCR, Real-time PCR hay giải trình tự phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, song địi hỏi phải có trang thiết bị đại kỹ thuật viên có trình độ đào tạo cao Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP nghiên cứu phát triển Công ty Eiken Chemical (Nhật Bản) phương pháp nhân gen đẳng nhiệt ứng dụng nhiều Kết phản ứng LAMP quan sát trực tiếp mắt thường, thời gian xét nghiệm nhanh (khoảng 45 - 60 phút), xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu Trên giới Việt Nam chưa có nghiên cứu cơng bố để ứng dụng kỹ thuật LAMP vào chẩn đoán nhiễm Echinococcus Trong nghiên cứu này, phát triển kít đánh giá kỹ thuật LAMP để phát Echinococcus, hướng tới phát triển thành kít dùng cho chẩn đốn nhanh từ mẫu bệnh phẩm 37 T¹p chí y dợc học quân số - 2022 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Mẫu chứng chuẩn: Sán nang Echinococcus định loại hình thái khẳng định kỹ thuật PCR - Mẫu nghiên cứu: Mẫu thu thập từ phòng khám chuyên ngành Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương lưu trữ Khoa Sinh học phân tử; mẫu huyết người không nhiễm Echinococcus số ký sinh trùng khác thu từ xã Mai Trung, huyện Bắc Giang - Hóa chất dùng cho LAMP Bst DNA polymerase mua Hãng New England Biolabs, Mỹ Kit tách chiết ADN từ mẫu mô, mẫu phân Hãng Qiagen, Đức Các trình tự mồi thiết kế đặt tổng hợp Hãng IDT, Mỹ * Thời gian địa điểm nghiên cứu: - Thời gian: tháng 01/2021 - 9/2021 - Địa điểm: Phòng Xét nghiệm Sinh học phân tử Trường Đại học Y tế Công cộng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Phương pháp nghiên cứu * Cỡ mẫu chọn mẫu: - Mẫu chuẩn sử dụng cho thiết kế đánh giá hoạt động mồi LAMP: + Mẫu chuẩn dương để chuẩn kỹ thuật: 03 mẫu giai đoạn (ấu trùng sán trưởng thành) thu linh trưởng chó Bộ mơn Ký sinh trùng, Học viện Nông nghiệp cung cấp Các mẫu thẩm định loài qPCR trước đưa vào nghiên cứu, mẫu tiến hành xét nghiệm lặp lại lần 38 + Mẫu chứng âm: Ấu trùng trưởng thành: Giun chó mèo, sán gan lớn Fasciola, Giun móc/mỏ, Teania solium, Strongyloides stercoralis nước cất khử ion - Mẫu sử dụng cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kít ECHO-LAMP: + Mẫu dùng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm: Mẫu lựa chọn có chủ đích thực với quy mơ nhỏ phịng thí nghiệm dựa vào lượng mẫu dương tính tập hợp mẫu lâm sàng thử nghiệm với giả định tỷ lệ nhiễm (P) 5% Độ nhạy đặc hiệu mong đợi kít ECHO-LAMP khoảng 95%, sai số ước tính hai xác suất 5% với độ tin cậy (giá trị α = 0,05) 95% Số mẫu cần có để ước tính độ nhạy độ đặc hiệu xác định công thức hai tỷ lệ Tính nse = 3,46 làm trịn mẫu dương tính nsp = 76,83 làm trịn 77 mẫu âm tính Trên thực tế, nghiên cứu mẫu huyết dương tính lưu trữ phịng thí nghiệm (1 mẫu thu linh trưởng mẫu bệnh nhân) 88 mẫu âm tính thu từ người khoẻ mạnh, khẳng định âm tính loại ký sinh trùng ELISA PCR - Mẫu sử dụng đánh giá phản ứng chéo loại giun sán 19 mẫu, Toxocara sp (8 mẫu), ấu trùng sán lợn (2 mẫu); sán gan lớn Fasciola (5 mẫu), sán gan nhỏ (2 mẫu), giun Strongyloides stercoralis (2 mẫu) Các mẫu thẩm định qPCR - Mẫu sử dụng cho xác định ngưỡng phát kít ECHO-LAMP: T¹p chÝ y dợc học quân số - 2022 Trờn vựng trình tự bảo tồn gen 18s rRNA sán dây Echinococcus sp có kích thước 596 bp chèn vào vector pUC19 nhân dòng Sản phẩm thu plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA đặc trưng cho sán dây Echinococcus sp có kích thước 3282 bp Lượng plasmid thu hồi µg hịa tan 50 µL nước cất để thu nồng độ 100 ng/µL - Mẫu DNA phân tích: DNA tổng số phân tách từ sán trưởng thành mẫu bệnh phẩm thu từ bệnh nhân tách chiết DNA micro kit QIAamp DNA stool mini kit Qiagen (Germany) Quy trình tách chiết thực theo hướng dẫn nhà sản xuất - Thiết kế mồi: Mồi cho phản ứng LAMP thiết kế vùng gen đặc hiệu cao Cox1 theo nghiên cứu trước công bố giới (2,3) Phần mềm chuyên dụng thiết kế mồi cho phản ứng LAMP sử dụng phần mềm Primer Explorer v.5 (https://primerexplorer.jp/e/) Các trình tự gen 18s rRNA lồi sán dây Echinococcus sp ngân hàng liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) tải sử dụng phần mềm MEGA với tính chức Clustal W để gióng trình tự bảo tồn gen Echinococcus spp Kết thu đoạn trình tự bảo tồn cho Echinococcus spp có kích thước 596 bp sản phẩm sau phản ứng LAMP cặp mồi F3-B3 có kích thước theo lý thuyết 228bp < 280 bp Bảng 1: Trình tự mồi LAMP thiết kế vùng gen 18s rRNA phát Echinococcus sp Tên mồi Vị trí 5’ Vị trí 3’ Chiều dài (nu) Tm o ( C) Tỷ lệ GC Trình tự mồi F3 283 303 21 56,60 0,38 AGAGGGTTTAAACCAGACATT B3 489 510 22 57,89 0,41 CTTCGAACCTCTAACTTTCGTT FIP 45 GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCAGGTCTAGCATGGAATAACACT BIP 50 TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGACCTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC F2 316 336 21 56,79 0,43 GGTCTAGCATGGAATAACACT F1c 373 396 24 63,00 0,46 GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCA B2 464 488 25 57,47 0,32 CTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC B1c 408 432 25 60,49 0,40 TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGAC LB 437 457 21 64,14 0,57 GCGAGACGTCCTACTGCGAAA - Khảo sát tối ưu hóa phản ứng ECHO-LAMP: Các thông số cần khảo sát tối ưu hóa phản ứng LAMP nồng độ Mg2+, nhiệt độ hoạt động mồi, thời gian phản ứng, chất thị màu dùng để quan sát phát sản phẩm LAMP độ nhạy (ngưỡng phát hiện) hệ mồi thiết kế sở kết chế tạo kít LAMP chẩn đốn số loài ký sinh trùng đề tài cấp Nhà nước KC10/10.16-20 MgSO4 khảo sát nồng độ 4, mM Phản ứng LAMP thực dải nhiệt độ từ 60 - 65oC, 39 Tạp chí y dợc học quân số - 2022 sử dụng chất thỉ màu MG với nồng độ 0,012, 0,008, 0,004 0,001% [5] Thời gian thực phản ứng LAMP khảo sát 40 60 phút Tiêu chí đánh giá lựa chọn thông số dựa vào việc quan sát sản phẩm LAMP gel agarose 2% chuyển màu dung dịch ống mẫu âm dương sau phản ứng Đọc kết quan sát tổng số 12 lần xét nghiệm thông qua lặp lại lần, với mẫu chứng đánh giá kỹ thuật viên quan sát độc lập thời điểm xét nghiệm - Độ nhạy (Se) độ đặc hiệu (Sp) ECHO-LAMP: Bộ mẫu dùng đánh giá Se Sp kít LAMP chẩn đốn Echinococcus mẫu dương tính lưu phịng thí nghiệm mẫu thu thực địa Tất mẫu xét nghiệm khẳng định qPCR trước thử nghiệm Hiện chưa có kít LAMP chẩn đốn Echinococcus thương mại hóa Do vậy, chúng tơi sử dụng kít có điều kiện phản ứng mồi công bố Salant CS, 2012 [12] để so sánh với kít ECHO-LAMP chế tạo trình tự đích, sau biến nạp vào E coli DH5α, theo hướng dẫn sử dụng sinh phẩm - Kỹ thuật giải trình tự máy giải trình tự tự động 3500 * Phương pháp phân tích xử lý số liệu: - Phân tích số liệu phần mềm kèm với máy phần mềm tin sinh: AB7500 version 2.06, Primer Explorer v.5, Primer Blast, Mega - Tính độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số tương đồng Kappa phần mềm Medcalc * Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu thông qua Hội đồng Đạo đức NCYSH Trường Đại học Y tế Công cộng theo Quyết định số 191/2021/YTCC-HD3, ngày 26/4/ 2021 Những quy định đạo đức nghiên cứu thực nghiêm túc suốt trình nghiên cứu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chế tạo Kít LAMP chẩn đốn Echinococcus * Khảo sát khả hoạt động mồi LAMP: Se = Số mẫu dương thật/(số mẫu dương thật + số mẫu âm giả) x 100% Sp = Số mẫu âm thật/(số mẫu âm thật + số mẫu dương giả) x 100% * Các kỹ thuật khác sử dụng nghiên cứu: - Thu thập bảo quản mẫu theo quy trình thu mẫu - Xử lý mẫu tách chiết DNA theo phương pháp tủa cồn - Kỹ thuật qPCR xác định Echinococcus - Phương pháp tạo dịng: Trình tự DNA đích cần tạo dịng chuyển vào plasmid tạo dịng Plasmid tái tổ hợp mang đoạn 40 Hình 1: Sản phẩm LAMP sử dụng mồi tự thiết k c hiu cho Echinococcus sp Tạp chí y dợc häc qu©n sù sè - 2022 Để đánh giá khả hoạt động mồi thiết kế, kết điện di gel agarose 2% cho thấy, sản phẩm sau phản ứng (cột 1-8) mẫu dương chuẩn có dạng dải băng dài tương đương thang chuẩn DNA (M), hình ảnh đặc trưng sản phẩm LAMP Bảng 2: Kết hoạt động cặp mồi đặc hiệu Echinococcus sp ADN Mồi F3-B3 Sán dây nhỏ chó Echinococcus sp + Giun móc/mỏ - Giun đũa chó mèo Toxocara - Sán gan lớn Fasciola - Sán dây Teania solium - Giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis - Nước cất khử ion - Bảng cho thấy khả hoạt động cặp mồi thiết kế phát mẫu tách ADN Echinococcus sp, không phản ứng với mẫu ADN tách từ giun chó mèo, sán gan lớn Fasciola, giun móc/mỏ, Teania solium, Strongyloides stercoralis nước cất khử ion * Kết khảo sát chất thị màu cho phản ứng LAMP: Bảng 3: Kết quan sát chất thị màu MG nồng độ khác Nồng độ MG Mẫu 0,001% 0,004% 0,008% 0,012% Màu xanh lam % Dương tính % Âm tính 36 100 36 100 Chứng dương 36 100 Chứng âm 36 100 Chứng dương 36 100 Chứng âm 27 75 25 Chứng dương 36 100 100 Chứng âm 31 86,1 13,8 Có Khơng Chứng dương Chng õm 41 Tạp chí y dợc học quân sù sè - 2022 A B Hình 2: Phản ứng màu mẫu chứng dương âm A Hình ảnh ống trước phản ứng; B Hình ảnh màu ống sau phản ứng: Mẫu dương có màu xanh nhạt, mẫu âm không màu Các nồng độ MG khảo sát 0,012%, 0,008%, 0,004% 0,001% Kết biểu diễn bảng 1, hình 2, cho thấy nồng độ MG 0,004% nồng độ tối ưu phân biệt mẫu dương tính âm tính * Kết khảo sát thời gian thực phản ứng: Hình 3: Sản phẩm LAMP sau thời gian phản ứng 40 phút (Làn - 16) 60 phút (Làn - 8) Khảo sát thời gian tối thiểu thực phản ứng LAMP 40 60 phút, thành phần phản ứng: DNA khuôn, mồi, đệm phản ứng, nồng độ Mg2+ mM điều kiện khác giữ nguyên đồng nhất, thay đổi thời gian thực phản ứng Do mong muốn giảm thiểu thời gian phản ứng nên nghiên cứu này, không tiến hành thực nghiệm khoảng thời gian dài 60 phút Kết cho thấy thời gian tối thiểu để khuếch đại DNA phản ứng LAMP 60 phút 42 ... sán thể Xét nghiệm xem phương pháp chuẩn vàng chẩn đoán xác định ca bệnh Một số kỹ thuật sử dụng phổ biến phòng xét nghiệm gồm kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp, nhuộm soi mô bệnh học, kỹ thuật miễn... ủ bệnh dài có biểu bệnh vào giai đoạn muộn khó điều trị Việc phát nhanh Echinococcus để có biện pháp điều trị hiệu quan trọng Hiện nay, kỹ thuật xét nghiệm Echinococcus chủ yếu dựa vào xét nghiệm. .. thời gian xét nghiệm nhanh (khoảng 45 - 60 phút), xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu Trên giới Việt Nam chưa có nghiên cứu cơng bố để ứng dụng kỹ thuật LAMP vào chẩn đoán nhiễm Echinococcus Trong nghiên