Đang tải... (xem toàn văn)
CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SẢN PHẨM CHẨN ĐOÁN Đề tài tiểu luận: CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM QUE THỬ Miếng thấm mẫu: khu vực mẫu rơi xuống Miếng cộng hợp: các vật liệu khác nhau (hạt nano vàng, liposome, carbon,…) được liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể Màng phản ứng: thường là màng nitrocellulose: có chứa vạch kiểm tra và vạch kiểm soát Miếng thấm hút: làm sạch thuốc thử dư thừa và ngăn chặn sự chảy ngược của chất lỏng 1.1. Màng Nitrocellulose (NC) Được coi là yếu tố quan trọng nhất, NC là vật liệu được dùng phổ biến nhất Các thông số quan trọng đặc trưng cho 1 vật liệu màng tốt là lực mao dẫn, tính dễ liên kết và cố định của các protein. Có các loại kích thước lỗ xốp nitrocellulose từ 0,05 đến 12 μm (nhưng được phân bố ko đều do quá trình sản xuất), nên thường dựa vào thời gian chảy của mao quan để lựa chọn vật liệu màng phù hợp. Thời gian chảy của mao quản là thời gian cần thiết để chất lỏng đi đến và lấp đầy hoàn toàn dải màng. Ví dụ: NC 140: 140s chạy hết 4cm màng Liên kết giữa màng và kháng thể: liên kết tĩnh điện và liên kết kỵ nước
CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SẢN PHẨM CHẨN ĐỐN Đề tài tiểu luận: CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM QUE THỬ Cấu tạo Miếng thấm mẫu Thanh nhựa đỡ Miếng cộng hợp Màng Nitrocellulose Vạch Kiểm tra Miếng thấm hút Vạch đối chứng Hình 1: Cấu tạo que thử - Miếng thấm mẫu: khu vực mẫu rơi xuống - Miếng cộng hợp: vật liệu khác (hạt nano vàng, liposome, carbon,…) liên kết với kháng nguyên kháng thể - Màng phản ứng: thường màng nitrocellulose: có chứa vạch kiểm tra vạch kiểm soát - Miếng thấm hút: làm thuốc thử dư thừa ngăn chặn chảy ngược chất lỏng 1.1 Màng Nitrocellulose (NC) - Được coi yếu tố quan trọng nhất, NC vật liệu dùng phổ biến - Các thông số quan trọng đặc trưng cho vật liệu màng tốt lực mao dẫn, tính dễ liên kết cố định protein - Có loại kích thước lỗ xốp nitrocellulose từ 0,05 đến 12 μm (nhưng phân bố ko trình sản xuất), nên thường dựa vào thời gian chảy mao quan để lựa chọn vật liệu màng phù hợp Thời gian chảy mao quản thời gian cần thiết để chất lỏng đến lấp đầy hồn tồn dải màng Ví dụ: NC 140: 140s chạy hết 4cm màng - Liên kết màng kháng thể: liên kết tĩnh điện liên kết kỵ nước Bảng 1: Một số ví dụ màng có sẵn từ nhà sản xuất liên quan đến đặc tính màng khác 1.2 Miếng thấm mẫu: - Thường làm cellulose acetate sợi thủy tinh màng cellulose acetate cho thấy lực thấp protein màng sợi thủy tinh cho thấy khơng có lực với protein - Đệm mẫu thường ngâm tẩm với muối đệm, protein, chất hoạt động bề mặt chất lỏng khác để kiểm soát tốc độ dòng chảy mẫu để phù hợp với tương tác với hệ thống phát Hơn nữa, lỗ xốp miếng đệm mẫu hoạt động lọc để loại bỏ vật liệu dư thừa, ví dụ tế bào hồng cầu Hình 2: 1.3 Miếng cộng hợp (conjugate pad) - Miếng cộng hợp (conjugate pad) thành phần quan trọng que thử, đặt vị trí cầu nối miếng thấm mẫu màng nitrocellulose sử dụng để cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng Vật liệu làm miếng cộng hợp phải đảm bảo yêu cầu sau: không làm hỏng hay làm bất hoạt kháng thể, không làm thay đổi liên kết cộng hợp sấy khơ, có độ thấm ướt phù hợp ổn định đặc điểm dòng chảy, có khả nhả phức cộng hợp kháng thể-hạt nano vàng hồn tồn - Miếng cộng hợp có ảnh hưởng lớn đến độ nhạy độ đặc hiệu que thử Các vật liệu thường dùng để làm miếng cộng hợp bao gồm: sợi thủy tinh, sợi cellulose, polyester polypropylene đặc trưng kích thước lỗ màng, độ dày trọng lượng 1.4 Hạt nano vàng 1.4.1 Đặc điểm Hình 3: Hình ảnh hạt vàng chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) - Ưu điểm: tính ổn định hóa học cao, diện tích riêng lớn, dễ tổng hợp, chi phí thấp bước chuẩn bị dễ dàng Các đặc tính làm cho thời gian phân tích ngắn cung cấp phân tích đáng tin cậy chỗ - Hình dạng, kích thước độ ổn định AuNPs thông số quan trọng ảnh hưởng đến thành công LFA Kích thước màu sắc AuNPs phụ thuộc vào lượng natri citrat sử dụng để khử vàng AuNPs có đường kính nhỏ 15 nm nhỏ để tạo màu sắc mạnh; nhiên, vàng keo nano có đường kính 20 nm sử dụng làm thuốc thử dị Các AuNP có đường kính lớn 60–70 nm tự kết tụ dễ dàng không ổn định - Liên kết hạt vàng kháng thể: tương tác khơng cộng hóa trị, chẳng hạn lực London-Van der Waals tương tác kỵ nước - yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất cộng hợp KT lên hạt vàng pH lượng kháng thể 1.4.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng Hiện nay, hai phương pháp cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng liên kết khơng cộng hóa trị (hấp phụ) liên kết cộng hóa trị với ưu nhược điểm riêng: - Hấp phụ vật lý: kháng thể hấp phụ lên bề mặt hạt nano vàng nhờ tương tác vật lý gồm: tương tác kỵ nước, tương tác ion lực Van der Waals Liên kết có độ bền khơng cao kháng thể hấp phụ lên bề mặt hạt nano vàng thông qua lớp citrate, phụ thuộc lớn vào pH, áp suất, nhiệt độ, điều kiện khuấy trộn, … có khả nhả hấp phụ điều kiện mơi trường khơng trì ổn định Tuy nhiên, thao tác tạo cộng hợp lại đơn giản tốn kém, dễ dàng điều khiển - Liên kết cộng hóa trị: Ở phương pháp này, kháng thể gắn lên bề mặt vàng liên kết cộng hóa trị Để làm việc đó, hạt nano vàng gắn sẵn lớp polyethylene glycol (PEG) với đầu hướng ngồi nhóm cacboxyl Nhóm sau xúc tác tác nhân EDC/NHS hình thành liên kết cộng hóa trị với kháng thể Đây liên kết bền vững, khó bị phá vỡ Tuy nhiên, cần nhiều hóa chất thời gian 1.5 Một số vật liệu thay hạt nano vàng Hình 4: 1.5.1 Ống nano carbon hạt nano carbon Diện tích bề mặt lớn tính điện quang học tốt làm cho chúng trở thành vật liệu hỗ trợ thích hợp cảm biến sinh học vật liệu tín hiệu dải sắc ký miễn dịch Các hạt nano carbon cho thấy cường độ màu cao hạt vàng dải sắc ký miễn dịch Các ưu điểm khác chi phí thấp, dễ dàng chuẩn bị ổn định liên hợp Bảng 2: Một số nghiên cứu sử dụng ống carbon hạt nano carbon (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 1.5.2 Các vật liệu nano khác Các vật liệu dùng để thay khác hạt nano silika, hạt latex, hạt nano platinium, hạt nano seradyn, hạt nano lưỡng kim platinium-vàng Các hạt nano phát quang: chấm lượng tử, Lanthanide 1.6 Miếng thấm hút: Miếng thấm hút liên kết với màng vị trí cuối que thử, có chức tăng tổng thể tích mẫu vào que thử, đồng thời tham gia vào việc trì tốc độ dịng chảy chất lỏng qua màng, khơng cho dịng chảy quay ngược trở lại Do tổng thể tích mẫu tạo thành tín hiệu điều khiển thể tích hịa tan hạt đánh dấu vạch kiểm tra vạch đối chứng, thể tích mẫu vào que thử nên miếng thấm hút tác động đến độ nhạy phép thử Vật liệu làm miếng thấm hút đặc trưng thơng số kỹ thuật là: kích thước, độ bền học, độ dày … 1.7 Một số dạng que (B’) Hình 5: Dạng que thử (A) Dòng chảy ngang; Que nhúng (B) cộng hợp ống epp (B’) cộng hợp que Nguyên lý xét nghiệm dòng chảy bên dựa kháng thể - Kháng thể chính: liên kết cụ thể với số kháng nguyên định nó: vạch kiểm tra - Kháng thể thứ cấp: Kháng thể liên kết với kháng nguyên chứa kháng thể, kháng thể khác: Vạch kiểm sốt - Có dạng: dạng sandwich dạng cạnh tranh 2.1 Định dạng sandwich (hình a) - kháng thể khác sử dụng: Kháng thể 1: đặc hiệu cho Epitope kháng nguyên mẫu, ghép với hạt nano vàng (hoặc hạt nano carbn,…) cố định miếng cộng hợp Kháng thể 2: gọi kháng thể phát hiện, đặc hiệu cho vị trí Epitope thứ kháng nguyên mẫu, làm khô màng vạch kiểm tra Kháng thể 3: loại kháng thể kháng globulin miễn dịch đặc hiệu cho loài, cố định màng vạch kiểm soát tương tác với kháng thể - Khi dung dịch mẫu có kháng ngun đích thêm vào miếng đệm mẫu, chất phân tích đích kháng thể tạo thành phức hợp miếng đệm liên hợp di chuyển đến đệm hấp phụ nhờ lực mao dẫn Liên hợp kháng thể đánh dấu chất phân tích đích phản ứng với kháng thể phát đường thử nghiệm bánh sandwich hình thành Kháng thể gắn nhãn, khơng chứa chất phân tích vượt q vạch thử nghiệm, liên kết với kháng thể tạo thành vạch kiểm sốt Khi có chất phân tích mẫu, hai vạch đỏ xuất vạch kiểm tra vạch chứng, khơng có chất phân tích mẫu - Thường dùng thử nghiệm phát chất phân tích lớn, có nhiều vị trí kháng nguyên 2.2 Định dạng cạnh tranh thử nghiệm dịng chảy bên (hình b) - Để thử nghiệm chất phân tích nhỏ, có trọng lượng phân tử thấp chất định kháng nguyên đơn lẻ Các phân tử nhỏ liên kết đồng thời với hai kháng thể - Hai kháng thể khác sử dụng định dạng Kháng thể 1, đặc hiệu cho kháng nguyên mẫu, ghép với hạt nano (vàng, carbon,…) Kháng thể loại globulin chống miễn dịch đặc hiệu cho lồi làm khơ vạch đối chứng - Liên hợp phân tử mang kháng nguyên (thường albumin huyết bò (BSA)) cố định màng vạch thử nghiệm - Khi có chất phân tích mẫu, vạch đỏ xuất vạch kiểm soát, khơng có chất phân tích mẫu, hai vạch đỏ xuất vạch kiểm tra đối chứng - Định dạng cạnh tranh có hai cách xếp Trong xếp đầu tiên, chất phân tích đích gắn với hạt nano gắn vào miếng đệm liên hợp Đối với mẫu âm tính, chất phân tích đánh dấu di chuyển qua dải liên kết với kháng thể sơ cấp vạch thử nghiệm kháng thể thứ cấp vạch chứng Màu đỏ giám sát đường thử nghiệm đường kiểm sốt Đối với mẫu dương tính, chất phân tích khơng dán nhãn mẫu chất phân tích dán nhãn cạnh tranh chất phân tích khơng dán nhãn liên kết với đường thử nghiệm Chất phân tích gắn nhãn liên kết với kháng thể thứ cấp dịng đối chứng Chỉ có đường màu đỏ hình thành đường kiểm sốt Theo cách xếp thứ 2, kháng thể đánh dấu làm khô đệm liên hợp Vạch thử nghiệm vạch kiểm soát chứa liên hợp phân tử mang chất phân tích mục tiêu kháng thể thứ cấp Chất phân tích mục tiêu mẫu phân tử chất mang chất phân tích mục tiêu đường thử nghiệm cạnh tranh để liên kết với kháng thể đánh dấu (kháng thể 1) Khi có mặt chất phân tích đích mẫu, liên kết với kháng thể đánh dấu di chuyển đến vạch kiểm soát Một vạch đỏ giám sát vạch kiểm soát que Hình 6: Nguyên lý que thử a) Dạng sandwich b) Dạng cạnh tranh Ưu điểm, nhược điểm Ưu điểm Thời gian phân tích nhanh, thể tích mẫu phân tích nhỏ Dễ chế tạo, chi phí chế tạo rẻ Ổn định với điều kiện môi trường khác nhau, thời gian bán hủy lâu Dễ sử dụng, linh hoạt, khơng cần phịng thí nghiệm Phân tích chỗ (on-site), khơng Nhược điểm Chủ yếu phân tích định tính/bán định lượng Dạng que cạnh tranh, kết tương quan với nồng độ chất phân tích Tốc độ dịch chuyển mẫu que thử khó điều khiển Khó để thiết kế que thử để phân tích nhiều đối tượng lúc cần chuẩn bị trước Tiềm thương mại cao Dễ tích hợp với hệ điện tử Dải ứng dụng rộng Khơng, tiêu tốn lượng Thời gian phân tích phụ thuộc vào chất mẫu phân tích Ứng dụng Phát hiện: - Protein - Tác nhân truyền nhiêm - Kháng nguyên - Axit nucleic - Kháng thể: IgG, IgM - Hoocmon - Độc tố - Kháng sinh - Hợp chất hữu Ứng dụng: - Chẩn đốn y khoa: rối loạn chuyển hóa, tác nhân lây nhiễm - Khoa học pháp y - Theo dõi điều trị - Môi trường - Nuôi trồng thủy sản - Nơng nghiệp - Thú y - Chẩn đốn tiêu dùng - An toàn thực phẩm Cơ hội thách thức Cơ hội - Ứng dụng chất sinh học khác: nước mắt, nước bọt, mồ hôi - Tỷ lệ ứng dụng thương mại cao: đặc biệt lâm sàng thú y - Các ứng dụng trước cơng nghệ khác phát triển nhanh Thách thức - Cạnh tranh thị trường - Cơng nghệ lab-on-chip Ví dụ: Que thử nhanh SARS-COV2 Hình 7: Que thử nhanh SARS-CoV-2 hãng Kyvobio chẩn đoán xét nghiệm nhanh IgG / IgM TÀI LIỆU THAM KHẢO [1–6] Que thử: https://www.kyvobio.com/en/read/newsletter-26/sars-cov-2-covid-19- diagnosis-by-2264.html flow Sajid M, Kawde AN, Daud M (2015) Designs, formats and applications of lateral assay: A literature review J Saudi Chem Soc 19:689–705 https://doi.org/10.1016/j.jscs.2014.09.001 Huang Y, Xu T, Wang W, et al (2020) Lateral flow biosensors based on the use of micro- and nanomaterials: a review on recent developments Microchim Acta 187: https://doi.org/10.1007/s00604-019-3822-x Bahadır EB, Sezgintürk MK (2016) Lateral flow assays: Principles, designs and labels TrAC - Trends Anal Chem 82:286–306 https://doi.org/10.1016/j.trac.2016.06.006 de Puig H, Bosch I, Gehrke L, Hamad-Schifferli K (2017) Challenges of the Nano–Bio Interface in Lateral Flow and Dipstick Immunoassays Trends Biotechnol 35:1169–1180 https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2017.09.001 Wong RC, Tse HY (2009) Lateral Flow Immunoassay Posthuma-Trumpie GA, Korf J, Van Amerongen A (2009) Lateral flow (immuno)assay: Its strengths, weaknesses, opportunities and threats A literature survey Anal Bioanal Chem 393:569–582 https://doi.org/10.1007/s00216-008-2287-2 ... thị trường - Công nghệ lab-on-chip Ví dụ: Que thử nhanh SARS-COV2 Hình 7: Que thử nhanh SARS-CoV-2 hãng Kyvobio chẩn đoán xét nghiệm nhanh IgG / IgM TÀI LIỆU THAM KHẢO [1–6] Que thử: https://www.kyvobio.com/en/read/newsletter-26/sars-cov-2-covid-19-... vạch kiểm sốt que Hình 6: Ngun lý que thử a) Dạng sandwich b) Dạng cạnh tranh Ưu điểm, nhược điểm Ưu điểm Thời gian phân tích nhanh, thể tích mẫu phân tích nhỏ Dễ chế tạo, chi phí chế tạo rẻ Ổn định... cuối que thử, có chức tăng tổng thể tích mẫu vào que thử, đồng thời tham gia vào việc trì tốc độ dịng chảy chất lỏng qua màng, khơng cho dịng chảy quay ngược trở lại Do tổng thể tích mẫu tạo thành