Microsoft Word 140 Le Huyen Tram doc Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN 978 604 82 2981 8 493 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HỢP CHẤT CARDAMONIN TRONG RỄ RIỀNG RỪNG (ALPI[.]
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN: 978-604-82-2981-8 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HỢP CHẤT CARDAMONIN TRONG RỄ RIỀNG RỪNG (ALPINIA CONCHIGERA GRIFF.) Lê Huyền Trâm, Đinh Thị Thu Hiền Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách khoa Hà Nội, email: tram.lehuyen@hust.edu.vn GIỚI THIỆU CHUNG Cây Riềng rừng có tên khoa học Alpinia conchigera Griff., thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Cây phân bố nước châu Á Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Thái Lan Ở nước ta, thường gặp mọc số tỉnh Nam Bộ từ Đồng Nai tới An Giang Rễ Riềng rừng thu hái quanh năm chủ yếu để dùng làm thuốc, làm gia vị làm men rượu Ở Trung Quốc, thân rễ sử dụng để chữa bệnh đau bụng, ngực bụng trướng đau, tiêu hoá khơng bình thường Ở Malaysia, dùng riêng phối hợp với rễ làm thuốc chuyền máu; hơ nóng lên dùng đắp đau thấp khớp, giã dùng đắp sau sinh đẻ, nước hãm dùng để tắm rửa Ở Campuchia, Riềng rừng dùng làm thuốc kích thích, trị ho, làm mồ điều chỉnh xuất huyết tử cung; phối hợp với thuốc khác để chữa ho mãn tính, bệnh đau đầu, chóng mặt, viêm tử cung, chữa bệnh gan, đau dây thần kinh thấp khớp Nghiên cứu hành phần hóa học rễ Alpinia conchigera Griff cho thấy có mặt nhiều nhóm hợp chất thiên nhiên carbohydrate, diarylheptanoid, phenylpropanoid flavonoid Hợp chất cardamonin, gọi cardamomin, có tên IUPAC (E)-1-(2,4dihydroxy-6-methoxyphenyl)-3-phenylprop2-en-1-one (Hình 1) Đây hợp chất chalcone có tự nhiên, phân lập lần vào năm 1976 từ hạt Amomum subulatum, sau từ số lồi khác thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Boesenbergia pandurata, Alpinia rafflesiana [1], có Riềng rừng (Alpinia conchigera Griff.) Các nghiên cứu hoạt tính cho thấy hợp chất có số tác dụng sinh học thú vị chống đột biến hoạt hóa amin dị vòng, làm hồi phục động mạch màng treo ruột chuột qua trình trung gian NO ức chế hoạt động nhân tố phiên mã NF-kB (nuclear factor-kB), ức chế sản sinh TNF- (tumor necrosis factor-) nitơ oxit (NO) Trong khuôn khổ báo này, công bố nghiên cứu việc phân lập xác định hàm lượng hợp chất cardamonin rễ Riềng rừng Việt Nam Hình Cấu trúc hợp chất cardamonin PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thực vật Mẫu nghiên cứu rễ Riềng rừng thu hái Đại Từ, Thái Nguyên, vào tháng 10/2018 Mẫu TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật giám định tên khoa học Alpinia conchigera Griff., mẫu tiêu lưu giữ trường Đại học Bách khoa Hà Nội 493 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN: 978-604-82-2981-8 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp phân lập phân tích: Sắc ký lớp mỏng (TLC) tiến hành mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck) độ dày 0,2mm, phát vệt chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254 365 nm, màu vệt chất thuốc thử vanilin/H2SO4 thuốc thử FeCl3 5% ethanol Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel cỡ hạt 0,04-0,063mm (Merck) Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) tiến hành thiết bị HPLC AGILENT TECHNOLOGY 1100 DAD với detector UV, kích thước cột: (250 x 4,6) mm; Chất nhồi cột: ODS - C18 Các phương pháp xác định cấu trúc: Điểm nóng chảy (đnc) đo thiết bị Boetius (Đức) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D NMR) ghi máy Bruker AM500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội tetramethylsilane Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) ghi dung mơi thích hợp máy Hewlett Packard 5989B MS, Varian MAT 44S KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập hợp chất cardamonin Mẫu rễ Riềng rừng tươi (18kg) Riềng rừng sau thu hái rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khơ giịn nhiệt độ khoảng nhiệt độ 40-50oC Sau mẫu khơ hồn tồn, đem xay thành bột mịn (1,3 kg) Bột khô rễ Riềng rừng ngâm chiết lần với dung mơi methanol nhiệt độ phịng Sau đó, dịch chiết methanol gộp lại, loại bớt dung môi, phần dịch pha lỗng với nước cất Dịch metanol-nước phân bố dung môi nhexane, ethyl acetate Các dịch chiết nhexane ethyl acetate cô quay áp suất giảm nhằm loại kiệt dung môi, thu phần chiết n-hexane (ACH, 22,4g) ethyl acetate (ACE, 31,7g) Phần chiết ACE (31,7g) tiến hành phân tách cột sắc ký silica gel, rửa giải hệ dung môi CHCl3/acetone theo tỷ lệ gradient từ 20/1 đến 1/1 (v/v) thu phân đoạn từ ACE1 đến ACE4 Nhóm phân đoạn ACE2 phân tách tinh chế cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CHCl3/EtOAc (5/1, v/v), thu 760 mg hợp chất có màu vàng Cardamonin (1): tinh thể hình kim, màu vàng, đnc: 203-205oC; Rf 0,52 (TLC, silica gel, n-hexane/EtOAc (5/1, v/v)), phát vệt TLC ánh sáng thường: màu vàng; UV: phát quang nâu; thuốc thử vanilin/H2SO4: màu vàng; thuốc thử FeCl3 5%/ethanol: màu nâu vàng 1H-NMR (DMSO-d6): 3,88 (3H, s, 2’OCH3), 5,93 (1H, d, J=2,5 Hz, H-5’), 6,02 (1H, d, J=2,5 Hz, H-3’), 7,43-7,47 (3H, m, H3, H-4, H-5), 7,70 (2H, d, J=7,5 Hz, 2,0 Hz, H-2, H-6), 7,65 (1H, d, J=16,0 Hz, H-), 7,82 (1H, d, J=16,0 Hz, H-), 10,7 (1H, br s, 4’OH), 13,7 (1H, s, 6’-OH) 13C-NMR (DMSOd6): 55,9 (q, 2’-OCH3), 91,7 (d, C-3’), 95,8 (d, C-5’), 105,1 (s, C-1’), 127,5 (d, C-), 128,3 (d, C-2, C-6), 128,9 (d, C-3, C-5), 130,2 (d, C-4), 134,9 (s, C-1), 141,7 (s, C-), 162,7 (s, C-6’), 165,0 (s, C-4’), 166,3 (s, C-2’), 191,7 (s, CO) EI-MS m/z (%): 270 (C16H14O4, M+, 66), 269 (63), 193 (100), 167 (35), 139 (6), 138 (17), 131 (8), 103 (24), 77 (33) Bằng phương pháp phổ phổ khối lượng (EI-MS) phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) kết hợp với việc so sánh liệu phổ tài liệu tham khảo xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ rễ Riềng rừng 4’,6’-dihydroxy-2’methoxychalcone hay cardamonin Đây hợp chất chalcone thuộc nhóm flavonoid thiên nhiên có cơng thức nêu Hình 3.2 Xác định hàm lượng hợp chất cardamonin Cardamonin hoạt chất chủ yếu rễ Riềng rừng với nhiều hoạt tính có giá trị Vì thế, việc phân tích phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao nhằm đánh giá hàm lượng cardamonin (1) rễ Riềng rừng Việt Nam Điều kiện phân tích HPLC: Nhiệt độ cột: 45oC; Pha động: MeOH/H2O (80/20, v/v); Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút; detector UV có bước sóng phân tích: 214,8 nm 494 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN: 978-604-82-2981-8 Xây dựng đồ thị đường chuẩn: Pha dãy mẫu chuẩn có nồng độ khác Trên sắc ký đồ xuất pic với thời gian lưu tương ứng 3,547; 4,676; 5,725; 6,914 7,997 phút, số pic có thời gian lưu 6,914 phút ứng với chất cardamonin phân lập Mối quan hệ diện tích pic nồng độ cardamonin mẫu chuẩn nêu Bảng Bảng Kết phân tích dãy mẫu chuẩn Mẫu Nồng độ (mg/ml) 5,0 10,0 20,0 30,0 40,0 Diện tích pic 319,62897 549,80000 1114,80000 1630,50000 2118,30000 Từ kết Bảng 1, xây dựng đồ đường ngoại chuẩn biểu diễn mối quan hệ diện tích pic nồng độ cardamonin mẫu chuẩn (Hình 2) DiƯn tÝch pic 2500 2000 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 Nång ®é ( g/ml) Hình Mối quan hệ diện tích pic nồng độ cardamonin mẫu chuẩn Phương trình tuyến tính đường chuẩn thu là: y = 52,80938x + 31,34069 (r2 = 0,99951) đó: x nồng độ cardamonin (g/ml); y diện tích pic tương ứng Dựa vào đường chuẩn xác định hàm lượng cardamonin phần chiết mẫu nguyên liệu khô ban đầu Phần chiết n-hexane (ACH): Chuẩn bị dung dịch 2,1 mg phần chiết nhexane (ACH) 1ml methanol (ứng với nồng độ 2,1.10-3 g/ml) Mẫu phân tích lọc qua lọc dung dịch phân tích HPLC với điều kiện phân tích Với dung dịch đem phân tích, diện tích pic thu 92,40665 (Hình 2) Dựa vào phương trình đường chuẩn tính nồng độ cardamonin dung dịch mẫu phân tích 1,15635 g/ml Từ đó, tính hàm lượng cardamonin phần chiết n-hexane (ACH) 5,5064.10-2% hay 5,51.10-2% Phần chiết ethyl acetate (ACE): Chuẩn bị dung dịch 2,0 mg phần chiết ethyl acetate (ACE) 1ml methanol (ứng với nồng độ 2,0.10-3 g/ml) Tiến hành tương tự với việc chuẩn bị dung dịch phần chiết ACH Kết với dung dịch phân tích diện tích pic thu 14135,45 Dựa vào phương trình đường chuẩn tính nồng độ cardamonin dung dịch mẫu phân tích 267,07577 g/ml Từ tính hàm lượng cardamonin phần chiết ethyl acetate (ACE) 13,353% hay 13,35% Mẫu nguyên liệu khô: hàm lượng cardamonin mẫu bột rễ khô Riềng rừng ban đầu xác định dựa vào phương trình đường chuẩn 0,29646% hay 2,97.10-1% KẾT LUẬN Bằng phương pháp chiết ngâm sắc ký phân lập hợp chất cardamonin từ rễ Riềng rừng Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D NMR) phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) Kết phân tích HPLC cho thấy hàm lượng cardamonin phần chiết nhexane, ethyl acetate mẫu nguyên liệu khô ban đầu tương ứng 5,51.10-2%, 13,35% 2,97.10-1% Từ kết nghiên cứu báo, nhận thấy sử dụng Riềng rừng làm dược liệu để thu nhận hoạt chất cardamonin Từ đó, nghiên cứu tạo chế phẩm dược phẩm thực phẩm chức từ rễ Riềng rừng Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ahmad S., Israf D A., Lajis N H., Shaari K., Mohamed H., Wahab A A., Ariffin K T., Hoo W Y., Aziz N A., Kadir A A., Sulaiman M R., Somchit M N (2006), Cardamonin, inhibits pro-inflammatory mediators in activated RAW 264.7 cells and whole blood, Eur J Pharmacol., 538, 188-194 495 ... 3.2 Xác định hàm lượng hợp chất cardamonin Cardamonin hoạt chất chủ yếu rễ Riềng rừng với nhiều hoạt tính có giá trị Vì thế, việc phân tích phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao nhằm đánh giá hàm lượng. .. khô: hàm lượng cardamonin mẫu bột rễ khô Riềng rừng ban đầu xác định dựa vào phương trình đường chuẩn 0,29646% hay 2,97.10-1% KẾT LUẬN Bằng phương pháp chiết ngâm sắc ký phân lập hợp chất cardamonin. .. cardamonin từ rễ Riềng rừng Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D NMR) phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) Kết phân tích HPLC cho thấy hàm lượng cardamonin