324 Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học Tập 20, số 3/2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1 VÀ B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU[.]
Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học - Tập 20, số 3/2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1 VÀ B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Đến tòa soạn 16 - - 2015 Đinh Thị Trường Giang Đại học Vinh SUMMARY RESEARCH TO DETERMINE THE AMOUNT OF VITAMINS B1 AND B6 IN LARGE FUNGUS FROM NORTH CENTRAL REGION OF VIETNAM BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Measured parameters and optimum conditions to determine the content of vitamins B1 and B6 were researched including wavelength, flow rate and mobile phase The linear range was from 0.5-5.0 ppm with B1 and was from 1.0- 5.0ppm with B6.The amount of vitamin B1 and B6 in large fungus has been determined by HPLC using the calibration curve The detection limits for B1 and B6 obtained were 0.069ppm and 0.13ppm; the quantification limits for B1 and B6 were 0.232 ppm and 0.42 ppm, respectively The relative standard deviations for the determination of three levels of concentration of the standard solution were less than 1%, whereas the relative standard deviations for the determination of sample were less than 2.5%.The recovery of vitamins B1 and B6 was 82.3% and 83.3%, respectively MỞ ĐẦU Nấm lớn chia năng, xuất tiêu chảy ung thư, ức nhiều chi, họ, lồi, chế kìm hãm phát triển khối u Thành loại khác có nhiều loại phần hóa học dược tính loại sử dụng làm dược liệu nấm linh chi, nấm lớn khác khác nấm thượng hoàng, nấm lỗ, nấm đen Đặc phụ thuộc vào vị trí địa lý, khí hậu nơi biệt, nấm linh chi loại thuốc q có tác nấm sinh trưởng Ngồi hợp chất có dụng bảo vệ gan, giải độc, tiêu đờm, lợi hoạt tính sinh học cao polisacarit, tiểu, bổ dày; nấm thượng hồng tritecpenoit loại nấm lớn nói ngăn ngừa bệnh rối loạn chức chung, cịn có thành phần có giá trị 324 dinh dưỡng khác vitamin, axit thuộc loại tinh khiết phân tích sử dụng cho amin, lipit[1] Cho đến nay, nghiên cứu HPLC loài nấm lớn vùng Bắc Trung chủ yếu Chất chuẩn B1 (thiamine hyđrochloride, điều tra đa dạng sinh học, mà chưa hãng Sigma - Mỹ) có độ tinh khiết cao nghiên cứu mặt hóa học, hoạt tính sinh 99%; học thành phần dinh dưỡng Trong đihyđrochlorua, hãng Sigma - Mỹ) có độ cơng bố trước đây, tiến tinh khiết cao 98% hành phân tích, đánh giá hàm lượng 2.3 Chuẩn bị mẫu nấm phân tích nguyên tố vi lượng, cơng trình này, Mẫu nấm lớn sau thu hái về, đem rửa tiến hành phân tích, đánh giá hàm sạch, phơi khơ tự nhiên, sau bảo quản lượng vitamin B1 (thiamin) B6 túi nilon Ký hiệu thứ tự MN 201- (pyridoxan dạng nó) MN 211, tên khoa học mẫu nấm tương loại nấm lớn nhằm góp phần xác định, đánh ứng ghi bảng 3.1 Dùng dao cắt giá thành phần dinh dưỡng loại phần mũ nấm thành miếng (không lấy nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ nói riêng phần cuống nấm) cỡ 3-5cm Lấy mẫu Việt Nam nói chung khoảng 30g, nghiền mịn trộn cho THỰC NGHIỆM mẫu đồng Làm lạnh sơ để tránh 2.1 Thiết bị dụng cụ mẫu tiếp xúc với nhiệt độ cao thời Hệ thiết bị sắc ký Alliance, bơm 2690, gian dài đưa phân tích detector huỳnh quang 2475 (Hãng Waters, 2.3.1 Xử lý mẫu nấm xác định vitamin B1 Mỹ), cột C18 (250 4,6 mm, μm I.D); nồi Cân gam mẫu thử cho vào bình nón 250 cách thủy 06 chỗ (hãng Memmer); thiết bị ml, thêm khoảng 100ml dung dịch HCl 1N lọc dung môi (hãng Gast - Mỹ); máy rung cho pH = Thủy phân mẫu nồi siêu âm (hãng Elma - Đức); máy li tâm cách thủy 1h kể từ lúc nước sơi Sau 5702R, tốc độ tối đa 3000 vịng/phút (hãng thủy phân xong, để nguội, chỉnh pH đến Eppendorf - Mỹ); máy nghiền mẫu Retsch khoảng 3,75 - 4,75 dung dịch GM 200 (Đức), máy lắc vontex Velp (Ý) CH3COONa 2,5N Chuyển tồn dung Cân phân tích có độ xác đến 0,0001 dịch vào bình định mức 250ml định Mettler Toledo (Đức), giấy lọc dung mức vừa đủ tới vạch nước cất Lọc mơi 47mm; 0,45µm Các dụng cụ như: bình qua giấy lọc Hút ml dung dịch lọc vào định mức 10ml, 100ml, 250ml; cốc có mỏ bình định mức 10ml, thêm vào bình 100ml, 250ml; giấy lọc whatman định mức ml dung dịch NaOH 15% 2.2 Hóa chất K3Fe (CN)6 1% pha Lắc máy Các hóa chất: mêtanol, iso butanol, axit lắc phút, thêm isobutanol đến vạch định glyocylic, axit axêtic, axit 1-heptansulfunic, mức lắc 30 giây Để yên bóng tối CH3COONa.3H2O, HCl đ, K3Fe(CN)6, 20 phút để tách lớp Tách chiết dung dịch NaOH, Fe(SO4).7H2O, NaBH4, H3PO4 để bơm vào HPLC[2] chất chuẩn B6 (pyridoxamin 325 2.3.2 Xử lý mẫu nấm xác định vitamin B6 hiệu cao (HPLC), detector huỳnh Chúng tiến hành xử lý mẫu nấm quang Những điều kiện thông số cần lớn xác định vitamin B6 theo quy trình: thiết cho phép ghi đo HPLC tối ưu, khoảng Quy trình 1: Theo TCVN 9513: 2012 [3] nồng độ tuyến tính đường chuẩn xác Cân g mẫu đồng cho vào bình nón định hàm lượng B1 B6 nghiên 150ml, thêm 50ml HCl 0,1M (pH=1) làm cứu, xác lập xây dựng Đánh giá o nóng thiết bị áp lực 30 phút 120 C, phương pháp tiến hành thơng qua sau làm nguội tới nhiệt độ phịng, tính tốn giới hạn phát (LOD), giới chuyển sang bình định mức 100ml pha hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại phép loãng nước đến vạch, lọc ly tâm ghi đo hiệu suất thu hồi 50ml dung dịch mẫu xử lý axit, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chuyển lớp phía sang chai thủy tinh 3.1.Nghiên cứu điều kiện phân tích đậy kín, dung dịch chiết mẫu tối ưu Quy trình 2: Với ký hiệu dạng tồn 3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn bước sóng kích chuyển hóa cho B6 thích phát xạ PN(Pyridoxine); PL(Pyridoxal); Thực phép đo sử dụng detector PM(Pyridoxamine) Nguyên tắc trình huỳnh quang, cần lựa chọn bước sóng xử lý mẫu nấm sau: Bước 1: PM kích thích tối ưu để chất phân tích phát thực phản ứng với axit glyoxylic tạo xạ huỳnh quang tối ưu tương ứng PL, Bước 2: PL bị khử quay trở lại PN Bằng cách thay đổi bước sóng kích NaBH4 dung dịch axit yếu thích phát xạ phép đo vitamin B1, Cân gam mẫu đồng hóa cho vào B6 chúng tơi lựa chọn bước sóng bình nón 50ml Thêm 2ml dung dịch kích thích λkt = 365nm, bước sóng phát xạ natriaxetat 0,625M; 2,5ml axit glyoxylic huỳnh quang λpx = 435nm dối với B1và 1M 0,8ml sắt (II) sulfate 10g/l Lắc qua bước sóng kích thích λkt = 290nm, bước đêm máy lắc ngang (ít 12h) sóng phát xạ huỳnh quang λpx = 395nm với 37 C Để nguội, chuyển vào bình định mức vitamin B6 50ml định mức đến vạch nước cất, 3.1.2 Nghiên cứu lựa chọn pha động tỷ lọc qua giấy lọc Dịch lọc sau lọc, thêm lệ pha động tiếp 4,5ml dung dịch NaBH4 0,1M 0,5 Các phép nghiên cứu thực với ml axit acetic tinh khiết Lắc nhẹ 30 giây dung dịch chuẩn vitamin B1, B6 có Sau sủi hết bọt, lọc qua màng lọc nồng độ 2ppm, cột sắc ký lựa chọn cột 0,45µm, bơm vào HPLC [4] C18 Bằng cách lựa chọn số hệ dung 2.4 Phương pháp phân tích mơi có độ phân cực tương đương với dung Hàm lượng vitamin B1 B6 môi mêtanol (mêtanol, mêtanol: KH2PO4, mẫu nấm lớn nghiên cứu mêtanol: acetonitrin, mêtanol: H3PO4+ axit xác định phương pháp sắc ký lỏng 1- heptane sulfonic), thay đổi tỷ lệ pha 326 động đo sắc ký Lựa chọn pha động Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn tỷ lệ pha động tối ưu thu nhận vitamin B1 có nồng độ 0,2-6,5 ppm từ dung diện tích pic sắc lý lớn độ lặp dịch chuẩn gốc thiamin clorua hyđroclorua lại phép đo tốt Chúng 100 ppm HCl 1N dãy dung dịch lựa chọn pha động để xác định vitamin B1 chuẩn vitamin B6 có nồng độ 0,2-6,5ppm mêtanol; vitamin B6 hệ mêtanol: từ dung dịch chuẩn gốc B6 500 ppm H3PO4 0,01M axit 1- heptane sulfonic pyidoxamin đihiđroclorua nước cất, 0,05% (w/v) pH=2,5 theo tỷ lệ 26:74 tiến hành ghi đo sắc đồ dung dịch 3.1.3 Nghiên cứu lựa chọn tốc độ dòng chuẩn vừa pha Kết nghiên cứu thu Các phép nghiên cứu thực cho thấy khoảng nồng độ tuyến tính dung dịch chuẩn vitamin B1, B6 nồng độ đạt cho phép đo HPLC với vitamin 2ppm Thay đổi tốc độ dòng từ 0,8- B1 từ 0,5-5 ppm vitamin B6 từ 1,0- 1,3ml/phút phép phân tích B1, 5,0 ppm Trong khoảng tuyến tính thu B6 Tốc độ dịng tối ưu lựa chọn tiến hành xây dựng đường chuẩn 1,0ml/phút diện tích pic sắc ký thể phụ thuộc diện tích pic sắc ký lớn độ lặp phép đo tốt vào nồng độ vitamin B1, B6 hình 3.2 Nghiên cứu khoảng tuyến tính 3.1; 3.2 xây dựng đường chuẩn xác định vitamin B1, B6 6000000 4000000 y = 977121x + 113434 R2 = 0.9997 2000000 0.0 Hình 3.1.Đường chuẩn xác định vitamin B1 3.3 Xác định hàm lượng B1, B6 mẫu nấm lớn Hàm lượng B1 B6 mẫu nấm xác định với điều kiện ghi 2.0 4.0 6.0 Hình 3.2 Đường chuẩn xác định Vitamin B6 mục 3.1, theo phương pháp đường chuẩn trình bày mục 3.2 Hàm lượng B1 B6 giá trị trung bình cộng lần thí nghiệm song song ghi lại bảng 3.1 hình 3.3 327 Bảng 3.1 Hàm lượng vitamin B1, B6 mẫu nấm thực STT Ký hiệu mẫu MN201 Hexagonia apiaria (Nấm lỗ) Hàm lượng TB Hàm vitamin B6 (mg/kg) lượng TB Theo Theo quy trình quy vitamin xử lý trình xử B1 mẫu lý mẫu (mg/kg) 3,4954 KPH KPH MN202 Ganodema applanatum (linh chi) 2,5355 KPH KPH MN203 Ganoderma lucidum (linh chi) 3,3234 KPH KPH MN204 Ganoderma philippii (linh chi) 2,9103 KPH KPH MN205 Phellinusmelanodermus (thượng hoàng) 0,9194 KPH KPH MN206 Ganoderma triangulatum (linh chi) 1,7056 KPH KPH MN207 Nigrofomes melanporus (nấm đen) 1,4382 KPH KPH MN209 Ganoderma fulvellum (linh chi) 2,8457 KPH KPH MN210 Phellinus setulosus (thượng hoàng) 0,8144 KPH KPH 10 MN211 Ganoderma lobatum (linh chi) 1,2553 KPH KPH Tên khoa học nấm lớn Hình 3.3 Sắc ký đồ số mẫu chuẩn mẫu nấm lớn Kết phân tích thu cho thầy hàm lượng B1 tất 10 mẫu nấm mẫu nấm lớn nằm ngưỡng phát phương pháp lớn lớn, dao động từ 0,8144 đến 3,4954 mg/kg hàm lượng B6 10 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 3.4.1.Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOD) 328 Căn vào kết xây dựng đường chuẩn Tính tốn LOD, LOQ vitamin B6 theo xác định vitamin B1 có độ lệch chuẩn Sy1=31468 phương trình đường chuẩn quy tắc 3σ vitamin B1 giá trị LODB6= 0,13ppm, LOQB6= 0,42ppm vitamin B1 Y = AX+B = 1,355.106x + 145612 3.4.2 Độ lặp lại phép ghi đo dung dịch chuẩn B1,B6 Tính tốn LOD, LOQ vitamin B1 theo quy tắc 3σ thu được: LODB1 = (3SY1)/A = Phép đánh giá tiến hành giá trị nồng độ đầu, nằm cuối khoảng 0,069ppm; LOQB1 = (10SY1)/A = 0,232ppm Căn vào kết xây dựng đường chuẩn tuyến tính, tiến hành đo lặp lại lần giá trị nồng độ Độ lặp lại thể qua độ xác định vitamin B6 có độ lệch chuẩn Sy2= 41114 phương trình đường chuẩn lệch chuẩn tương đối Stđ% Kết phân tích tính tốn thể bảng 3.2 vitamin B6 Y = AX+B = 977121x + 113434 Bảng 3.2.Kết tính tốn độ lặp lại phép ghi đo dung dịch chuẩn vitamin B1, B6 Vitamin B1 B6 Nồng độ chuẩn bị (ppm) 1,000 3,000 5,000 1,000 3,000 5,000 Nồng độ TB phát 1,0066 3,0252 5,0142 1,0096 3,0088 5,0128 Std% 0,533 0,923 0,168 0,648 0,223 0,244 Dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối nhỏ, chứng tỏ phép đo có độ lặp lại tốt 3.4.3 Dộ lặp lại mẫu nấm lớn định vitamin B1, B6, kết thể Lấy mẫu nấm song song 202-1, 202-2, 202-3, tiến hành phân tích mục 3.3, xác bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết phân tích độ lặp lại mẫu thử song song Mẫu 201-1 201-2 201-3 Trung bình Std % Vitamin B1(mg/kg) 2,567 2,548 2,491 2,535 2,2091 Vitamin B6 (mg/kg) KPH KPH KPH KPH Từ giá trị phân tích, tính tốn thể nấm có thêm chuẩn lượng xác bảng 3.3 cho thấy phép phân tích HPLC xác định vitamin B1, B6 có độ lặp lại cao B1 hay B6 Tiến hành phân tích HPLC loại mẫu theo quy trình phân giá trị Std % bé 3.4.4.Hiệu suất thu hồi tích mục 3.3 Kết phân tích tính tốn cho thấy: Để đánh giá độ phương pháp Hàm lượng B1 mẫu thử 2,5355 phân tích, chúng tơi tiến hành thực nghiệm tính tốn hiệu suất thu hồi qua việc phân mg/kg, thêm chuẩn 2,5205mg/kg, hàm lượng phân tích HPLC tích mẫu thử mẫu nấm MN201 mẫu 329 4,6812mg/kg, hiệu suất thu hồi H = 92,59 thực nghiệm tính tốn độ lặp lại, giới % với Std = 0,691 % Hàm lượng B6 hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu suất thu hồi Kết tính tốn cho thấy độ 0,000mg/kg, thêm chuẩn 2,8358mg/kg, hàm lượng phân tích HPLC lặp lại tốt (độ lệch chuẩn tương đối bé 0,25%), giới hạn phát giới hạn 2,3622mg/kg, hiệu suất thu hồi H = 83,3% với Std = 1,112 % định lượng thấp (ngưỡng ppm), hiệu suất thu hồi cao (đều lớn 80%) Từ kết tính tốn hiệu suất thu hồi theo AOAC, với ngưỡng hàm lượng ppm, TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] R P Z Furlani, H T Godoy (2008) hiệu suất thu hồi từ 80-120%, nhận thấy phép phân tích HPLC với vitamin B1, "Analytical, Nutritional and Clinical Methods Vitamins B1 and B2 contents in B6 có hiệu suất thu hồi thỏa mãn với độ lệch chuẩn tương đối thấp, nên phép phân cultivated mushrooms", Food Chemistry,106, 816-819 tích có độ tốt KẾT LUẬN [2].AOAC 941.15: "Vitamin B1 (Thiamine)" Đã nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích tối ưu cho phép ghi đo HPLC để [3].TCVN 9513 :2012 -"Thực phẩm-xác định B6 phương pháp sắc ký lỏng xác định vitamin B1, B6 bước sóng hiệu cao" kích thích phát xạ, tốc độ dịng, pha động, tỷ lệ pha động Đã tiến hành nghiên [4].Hung Khiem Trang, (2013) "Development of HPLC method for the determination of cứu khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn xác định vitamin B1, B6 Đã tiến water-soluble vitamins in pharmaceutical and fortified food products", A thesis, Tiger hành xử lý 10 mẫu nấm lớn xác định hàm lượng vitamin B1và B6 mẫu prints, Clemson University, pp.1745 mẫu thử nấm phương pháp HPLC Đã tiến hành đánh giá phương pháp phân tích qua 330