Thực tập vi sinh vật học phần 1 đàm sao mai

L A IN IG R O ĐÀM SAO MAI, TRỊNH NGỌC NAM, BÙI HỒNG QUÂN LÊ HỒNG THÍA, ĐÀO HỒNG HÀ L A IN IG R O NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH Viện Cơng nghệ sinh học & Thực phẩm LỜI NHÀ XUẤT BẢN Là khoa học nghiên cứu đặc điểm sinh học vi sinh vật - sinh vật có kích thước hiển vi siêu hiển vi, Vi sinh vật học có nhiệm vụ nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo, di truyền hoạt động sinh vật hóa học; nghiên cứu phân bố vi sinh vật tự nhiên mối quan hệ chúng với môi trường sinh vật khác; nghiên cứu biện pháp thích hợp để sử dụng hiệu vi sinh vật có lợi biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa vi sinh vật có hại IN IG R O Cuốn sách “Thực tập Vi sinh vật học” nhóm tác giả: TS Đàm Sao Mai (chủ biên), Trịnh Ngọc Nam, Lê Hồng Thía, Đào Hồng Hà, Bùi Hồng Quân biên soạn công phu, nỗ lực đáng trân trọng việc giới thiệu phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập trung vào thí nghiệm nghiên cứu, xác định vi sinh vật dùng công nghiệp thực phẩm phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm Sách cung cấp cho người đọc kiến thức thực hành vi sinh học thực phẩm cách tồn diện thơng qua việc trình bày kĩ thuật kinh điển Bên cạnh đó, sách cịn trình bày số kĩ thuật phân tích đại dựa nguyên tắc sinh học phân tử PCR sử dụng test thử nhanh hệ thống API Hệ thống thí nghiệm bố trí hợp lí, kiến thức trước làm cho sau Trong có phần nhắc lại lí thuyết trọng tâm, giúp người đọc nắm sở lí thuyết thí nghiệm Trình tự thao tác trình bày cặn kẽ, hợp lí minh họa rõ ràng Các thí nghiệm thực qua nhiều cơng đoạn có sơ đồ trình tự thí nghiệm, giúp người đọc hình dung rõ ràng tiến trình thí nghiệm Ngồi ra, phần Phụ lục có tiêu vi sinh số sản phẩm thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam giúp người đọc thông tin giới hạn an toàn vi sinh thực phẩm Sách đáp ứng địi hỏi cơng tác hướng dẫn thực hành: cung cấp sở lí thuyết bản, dự trù nguyên liệu, hóa chất, chuẩn bị dụng cụ, hướng dẫn trình tự tiến hành thao tác chun mơn đặc biệt thí nghiệm, thí nghiệm vi sinh thí nghiệm tinh tế, nhạy cảm, địi hỏi cẩn trọng độ xác cao L A Trên sở kế thừa, nâng cao, đổi nội dung kiến thức, sách thể kết tinh thần làm việc khoa học nghiêm túc tác giả Trong trình biên soạn, tác giả tham khảo, chọn lọc nhiều tài liệu, tuân thủ nguyên tắc trình bày rõ ràng, lơgích Vì vậy, sách tài liệu khoa học, hệ thống bản, có ích cho giáo viên hướng dẫn thực hành sinh viên ngành công nghệ thực phẩm Nhà xuất Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trân trọng giới thiệu sách “Thực tập Vi sinh vật học” đến đơng đảo bạn đọc NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Thực tập Vi sinh vật học LỜI MỞ ĐẦU Xung quanh chúng ta, ngồi sinh vật lớn mà nhìn thấy được, cịn có vơ vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng rãi tự nhiên ảnh hưởng lớn đến đời sống người sinh vật khác Ngành khoa học nghiên cứu hoạt động sống vi sinh vật gọi Vi sinh vật học Vi sinh vật học phát triển nhanh, với nhiều lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học, nấm học, tảo học, virus học hay y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh công nghiệp, vi sinh nơng nghiệp, vi sinh mơi trường… Mỗi lĩnh vực có đối tượng riêng, cần sâu nghiên cứu; song mức độ định, chuyên ngành có điểm giống Quyển sách giúp sinh viên hiểu rõ số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật; đó, tập trung chủ yếu Vi sinh đại cương Vi sinh công nghiệp thực phẩm IG R O Tuy cố gắng q trình biên soạn song khơng thể tránh khỏi nhiều khiếm khuyết, mong nhận góp ý quý độc giả để nội dung sách ngày nâng cao Các tác giả L A IN Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm MỤC LỤC Trang Lời nhà xuất Lời mở đầu Những quy tắc an tồn phịng thí nghiệm vi sinh vật Bài L A IN IG R O Thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm phương pháp tiệt trùng vi sinh vật Bài Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18 Bài Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 25 Bài Phương pháp quan sát vi sinh vật kính hiển vi quang học 33 Bài Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 42 Bài Phương pháp phân lập vi sinh vật 53 Bài Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 60 Bài Khảo sát sinh trưởng vi sinh vật – Đường cong sinh trưởng vi sinh vật 64 Bài Khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng vi sinh vật 71 Bài 10 Khảo sát đặc tính sinh hóa vi sinh vật 75 Bài 11 Kiểm soát sinh trưởng vi sinh vật 91 Bài 12 Xác định khả phân giải cellulose hoạt tính enzyme cellulase vi sinh vật 95 Bài 13 Định lượng vi sinh vật phương pháp đếm trực tiếp 101 Bài 14 Định lượng tổng VK hiếu khí thực phẩm phương pháp đếm khuẩn lạc 107 Bài 15 Định lượng Coliform phương pháp MPN (Most probable number) 115 Bài 16 Định lượng vi sinh vật phương pháp dùng petrifilm 121 Bài 17 Ứng dụng vi sinh vật sản xuất thực phẩm – Làm tương đậu 126 Bài 18 Ứng dụng vi sinh vật sản xuất thực phẩm – Làm rượu vang 129 Bài 19 Phương pháp phân tích định lượng Escherichia coli thực phẩm 132 Bài 20 Phương pháp phân tích Salmonella spp thực phẩm 141 Bài 21 Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus thực phẩm 149 Bài 22 Phương pháp phân tích định lượng Staphylococcus aureus thực phẩm 157 Bài 23 Phương pháp phân tích Vibrio cholerae thực phẩm 163 Bài 24 Phương pháp phân tích Clostridium perfringens thực phẩm 175 Bài 25 Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm phương pháp PCR 180 Bài 26 Xác định nhanh vi sinh vật thực phẩm hệ thống Multitest API 20E 186 Thực tập Vi sinh vật học Phụ lục L A IN IG R O Các tiêu vi sinh vật sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002 192 Thường quy kỹ thuật định tính bán định lượng độc tố vi nấm aflatoxin 194 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus niger, aspergillus fumigatus thực phẩm 201 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7042:2002 Bia – quy định kỹ thuật Draught beer – Specification 206 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7041:2002 Đồ uống pha chế sẵn không cồn – quy định kỹ thuật Soft drinks – Specification 210 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7044:2002 Rượu mùi – quy định kỹ thuật Liqueur – Specification 214 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7043:2002 Rượu trắng – quy định kỹ thuật Distilled alcoholic beverages – specification 218 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:2002 Rượu vang – quy định kỹ thuật Wine – Specification 221 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7108:2002 Sản phẩm sữa bột dành cho trẻ đến 12 tháng tuổi – quy định kỹ thuật Dried milk for infants up-to 12 months age – Specification 224 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5538:2002 (Soát xét lần 1) Sữa bột – quy định kỹ thuật Milk powder – Specification 230 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7030:2002 Sữa chua – quy định kỹ thuật Yoghurt – Specification 235 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5539:2002 (Sốt xét lần 1) Sữa đặc có đường – quy định kỹ thuật Sweetened condensed milk – Specification 240 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7029:2002 Sữa hoàn nguyên tiệt trùng – quy định kỹ thuật Sterilized reconstituted milk – Specification 244 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7028:2002 Sữa tươi tiệt trùng – quy định kỹ thuật Sterilized fresh milk – Specification 248 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7049:2002 Thịt chế biến có xử lý nhiệt – quy định kỹ thuật heat Treated processed meat – Specification 252 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7050:2002 Thịt chế biến không qua xử lý nhiệt - quy định kỹ thuật Non – heat treated processed meat – Specification 257 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7048:2002 Thịt hộp - quy định kỹ thuật Canned meat Specification 262 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2002 Thịt tươi – quy định kỹ thuật Fresh meat Specification 266 Tài liệu tham thảo 272 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm NHỮNG QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng thí nghiệm vi sinh vật Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường khơng nhìn thấy Trong q trình làm thí nghiệm, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật Bên cạnh giống, lồi vi sinh vật có ích giống, lồi có khả gây bệnh có hại sức khỏe người Mặt khác, q trình thí nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có hóa chất có độc tính Chính thế, người làm thí nghiệm phịng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ quy tắc sau I NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG - Những người khơng có nhiệm vụ khơng vào phịng thí nghiệm O - Khi vào phịng thí nghiệm phải mặc áo blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng R - Khơng nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Khơng ăn uống, hút thuốc phịng kiểm nghiệm IG - Mang trang, găng tay thao tác với vi sinh vật hóa chất - Trên bàn thí nghiệm để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở… phải để nơi quy định IN A - Trước sau kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn hóa chất sát trùng cồn 70% dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) chuẩn bị sẵn lau khô giấy vệ sinh L - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm… - Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dính lên quần áo, sách dụng cụ cá nhân Đồng thời phải ý bảo vệ da quần áo khỏi bị dính hóa chất thuốc nhuộm - Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), tuyệt đối không hút miệng - Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm chưa hướng dẫn cụ thể Sử dụng theo hướng dẫn, thận trọng, tránh làm đổ vỡ hư hỏng Thực tập Vi sinh vật học - Tất vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần phải khử trùng trước vứt bỏ sử dụng lại Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng - Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh thiết bị, dụng cụ sử dụng theo quy trình xếp vào nơi quy định - Rửa tay trước rời phịng thí nghiệm - Tất trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời xử lý II MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT Trước thực hành - Cần đọc trước nội dung tồn để hình dung khối lượng công việc làm - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích thí nghiệm O - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm R Trong thực hành - Ghi cẩn thận dặn giảng viên thao tác quy trình thực hành IG - Thực thí nghiệm theo hướng dẫn giảng viên IN - Trong q trình thí nghiệm có thao tác, cơng đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn - Ghi chép cẩn thận ý quan trọng thí nghiệm kết thí nghiệm A Kết thúc thực hành L - Làm báo cáo thực hành theo yêu cầu mục V thí nghiệm theo yêu cầu giảng viên Tuyệt đối không dùng miệng để hút dung dịch vi sinh vật hóa chất !!! Viện Cơng nghệ sinh học & Thực phẩm Bài THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT I THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC o o Tủ sấy (vacuum oven): điều chỉnh nhiệt độ từ 60 C – 200 C, dùng để sấy khô, khử trùng loại dụng cụ chịu sức nóng khơ, chủ yếu dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy chế độ nhiệt thời gian khác nhau, thường o o sấy 160 C giờ, 180 C 30 phút IN IG R O Hình 1.1 Tủ sấy A o o L 2.Tủ ấm (incubator or etuve): nhiệt độ từ 20 C – 60 C, có chế độ ổn định nhiệt độ, sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ nhiệt độ khác để vi sinh vật có o o thể phát triển tốt Ví dụ: coliform 30 C 24 – 48 giờ, E coli thích hợp 44 C 24 – 48 Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường pha chế, giống vi khuẩn, chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy nhiệt độ thường Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao (hơi nước bão hòa áp suất cao), sử dụng để hấp khử trùng mơi trường, số ngun liệu dụng cụ thí nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng chế độ nhiệt độ áp suất o o thích hợp, thường dùng 121 C/1 atm 15 phút; 127 C/1.5 atm 30 phút với môi o trường đất; hay 117 C/0.8 atm 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa… Thực tập Vi sinh vật học 10 Bảng 1.1 Tương quan thể thích mơi trường thời gian hấp tiệt trùng 121oC Thể tích mơi trường ni cấy (ml) 25 50 100 250 500 1000 2000 4000 Thời gian hấp tiệt trùng tối thiểu (phút) 20 25 28 31 35 40 48 63 Bảng 1.2 Tương quan áp suất (chỉ số áp kế nồi hấp) nhiệt độ o O Chỉ số áp kế nồi áp 0,0 suất (atm) o 100 Nhiệt độ sôi nước ( C) Nhiệt độ sôi nước ( F) 212 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 L A IN IG R Hình 1.2 Nồi hấp cao áp (Autoclave) Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100 µg – 200 g -4 -2 Độ xác 10 g Cân kỹ thuật (technical balance): độ xác 10 g Dùng cân hóa chất, mơi trường Trong q trình sử dụng, không đặt trọng lượng khoảng cân lên cân Thực tập Vi sinh vật học 92 II Dụng cụ, mơi trường hóa chất Dụng cụ STT 10 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Cốc 100 ml Cốc 500 ml Đèn cồn Que cấy Bình tia Đĩa petri Dụng cụ dùng chung Tủ ấm Tủ cấy vô trùng Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 3 1 1 10 Cái Cái 1 O Môi trường, hóa chất R - Mơi trường ni cấy vi sinh vật: môi trường cao thịt - peptone - Cồn 96o IG - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật làm kháng sinh đồ: môi trường Mueller Hinton Chủng giống vi sinh vật A IN - Đĩa giấy tẩm kháng sinh: ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, kanamycin, tetracyclin, penicillin - Vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus - Giấy lọc L Nguyên liệu khác - Bông không thấm - Bông thấm nước - Tăm bơng vơ trùng III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Kiểm soát sinh trưởng vi sinh vật tia UV a) Chuẩn bị đèn UV - Đèn UV đặt úp, cách vật chiếu 10 cm buồng chiếu Dùng vải dày, sẫm màu che chắn kỹ, tránh tia UV chiếu vào mắt (có thể nhìn qua kính thủy tinh) - Bật đèn cho ổn định 30 phút trước chiếu Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 93 b) Thực chiếu xạ - Thực hút ml dịch huyền phù vi khuẩn E coli cho vào hộp petri vô trùng chứa 9ml NaCl 0,9% có cá từ - Đặt hộp petri lên máy khuấy từ hộp đèn UV buồng chiếu Điều chỉnh tốc độ cá từ mức vừa phải - Mở nắp hộp petri, dung micropipette với đầu tip vô trùng thu 0,2 ml dịch huyền phù tế bào vào ống Eppendorff Đánh số lên nắp ống - Tiếp tục thu mẫu sau phút chiếu xạ 30 phút Ghi nhận thời gian chiếu xạ lên nắp ống Eppendorff chứa mẫu c) Kiểm tra khả sống sót vi khuẩn - Chuyển vô trùng 0,1 ml huyền phù tế bào chiếu xạ 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 lên hộp petri chứa môi trường cao thịt - pepton - Dùng que trải thủy tinh vô trùng trải dịch vi khuẩn lên khắp bề mặt thạch O - Nuôi ủ tối thời gian 24 R - Ghi nhận sinh trưởng đếm số khuẩn lạc đĩa 3.2 Ức chế sinh trưởng vi sinh vật chất kháng sinh IG - Mỗi tổ sinh viên chuẩn bị sẵn hai đĩa petri chứa môi trường Mueller Hinton Mỗi đĩa dùng để cấy chủng vi khuẩn E coli Staphylococcus aureus IN - Trong điều kiện vô trùng, nhúng đầu tăm vô trùng vào ống giống vi khuẩn (môi trường nuôi cấy dạng lỏng) Vắt dịch giống vi khuẩn thừa cách ép xoay đầu que tăm vào thành ống nghiệm phía mực dung dịch ống L A - Chuyển đầu tăm sang đĩa petri, bôi đầu tăm lên bề mặt môi trường, để khô phút Dùng que tăm hộp petri riêng cho giống vi khuẩn - Dùng bút lông dầu chia hộp petri thành sáu phần - Dùng kẹp inox vô trùng, gắp đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh vào phần đĩa petri Mỗi phần dùng cho loại kháng sinh riêng Ghi tên kháng sinh phần đĩa - Ủ đĩa 370C 24-48 - Sau thời gian này, quan sát đo đường kính vịng vơ khuẩn tạo quanh đĩa giấy kháng sinh Thực tập Vi sinh vật học 94 O R Hình 11.2 Đĩa kháng sinh đồ thử nghiệm tính mẫn cảm vi khuẩn với chất kháng sinh IG IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Tránh nhìn trực tiếp tia UV Phải đeo kính lọc tia UV mang găng tay thực chiếu xạ IN - Các que tăm sau cấy dịch vi khuẩn lên đĩa petri phải gom chung hấp khử trùng trước loại bỏ V BÁO CÁO THỰC TẬP L A - Ghi cẩn thận vị trí đĩa giấy tẩm chất kháng sinh khác để tránh nhầm lẫn kết khảo sát kháng sinh đồ - Trình bày chế tiêu diệt vi sinh vật chất kháng sinh - Xác định số lượng khuẩn lạc đĩa petri chiếu xạ với thời gian khác Xác định thời gian chiếu xạ làm vi khuẩn chết hoàn toàn - Đo đường kính vịng vơ khuẩn hai lồi vi khuẩn theo kháng sinh khác Nhận xét tính mẫn cảm kháng sinh vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 95 Bài 12 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE VÀ HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI SINH VẬT I NGUYÊN TẮC Cellulose thành phần cấu tạo thành tế bào thực vật Hàng năm, có lượng lớn cellulose đưa vào đất dạng chất thải hữu Mặc dù hợp chất cao phân tử bền, chúng bị phân giải mạnh ảnh hưởng số vi sinh vật điều kiện kị khí lẫn hiếu khí, mơi trường kiềm hay acid, độ ẩm cao thấp điều kiện khác O Hoạt động phân giải cellulose vai trò vi sinh vật phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu cho đất có tầm quan trọng đặc biệt vịng tuần hồn carbon Ngồi ra, q trình phân giải cellulose vi sinh vật cịn có ý nghĩa quan trọng q trình xử lý chất thải có nguồn gốc hữu giàu cellulose IG R Trong điều kiện hiếu khí, vi sinh vật tham gia vào việc phân giải cellulose gồm niêm vi khuẩn, vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm Chúng tổng hợp enzyme cellulase thủy phân cellulose sau: (C6H10O5)n + H2O + xO2 → R-CHOH COOH + O2 → CO2 + H2O + xKc IN Trong điều kiện kỵ khí, vi sinh vật sản xuất enzym cellulase để phân giải cellulose Dưới tác dụng cellulase cellobiase, cellulose biến thành glucose Cellobiose L Cellulose A (C6H10O5)n + 1/2nH2O + xO2 → 1/2n C12H22O11 Cellobiase C12H22O11 + 1/2nH2O C6H12O6 Glucose Glucose tiếp tục lên men tạo thành nhiều sản phẩm khác acid butyric, acid acetic, CO2, H2, CH4 nC6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + H2 + CO2 + xC nC6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + CO2 + CH4 + xC Trong điều kiện khơng khí bị hạn chế, vi khuẩn ưa ấm ưa nóng thuộc nhóm Clostridium Bacillus tiến hành phân giải cellulose Thực tập Vi sinh vật học 96 II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT Dụng cụ STT 10 Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Tấm Cái Cái 3 1 1 Cái Cái 1 Ghi R O 11 12 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm Ф18 Cốc 100 ml Cốc 500 ml Đèn cồn Que cấy Kính hiển vi Lame lamelle Bình tia Đĩa petri Dụng cụ dùng chung Tủ ấm Tủ cấy vô trùng Môi trường, hóa chất - Cồn 96o - Xanh metylen - Lugol - Môi trường Vinogratxki: : 2,5 g + KH2PO4 : 1,0 g + MgSO4 : 0,5 g + NaCl : 0,5 g + FeSO4 : 0,01 g L + KNO3 A IN - Dầu soi kính IG - Mơi trường nuôi cấy vi sinh vật: môi trường cao thịt - peptone nuôi cấy vi khuẩn + Mn2(SO4)3 : 0,001 g + Nước cất đủ :1000 ml Phối trộn thành phần, điều chỉnh pH7,0 ± 0,2 Phân phối vào dụng cụ chứa Hấp tiệt trùng nhiệt độ 121oC 30 phút Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 97 Nguyên liệu khác - Giấy lọc - Bông không thấm - Bông thấm nước - Đất vườn: 100 g III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Xác định q trình phân giải hiếu khí cellulose vi sinh vật - Cho vào ống nghiệm - ml môi trường Vinogratxki - Nhúng vào dung dịch ống nghiệm dải giấy lọc (20 x 1,5 cm) - Dùng kẹp sắt sợi kẹp đầu dải giấy vào miệng ống nghiệm Ống nghiệm môi trường hấp tiệt trùng nhiệt độ 121oC 30 phút O - Cho vào ống nghiệm cục đất nhỏ (nguồn vi sinh vật) đặt ống nghiệm vào o tủ ấm, giữ 30 C 7-15 ngày IG R - Các vi sinh vật phân giải cellulose phát triển, tiết enzyme cellulase làm cho giấy bị phân hủy, hóa nhày có màu vàng, hồng, lục, chất nhày có màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn IN - Xác định đối tượng vi sinh vật tham gia trình phân giải hiếu khí cellulose Để quan sát hình thái vi sinh vật hiếu khí tham gia vào q trình phân giải ta làm tiêu từ chất nhày bề mặt giấy lọc - Nhuộm đơn vết bôi Fuchsin A - Quan sát tiêu kính hiển vi với vật kính dầu (x 100) Xác định q trình phân giải kị khí cellulose vi sinh vật L - Cho vào ống nghiệm 10 ml môi trường có thành phần sau: + NH4PO4: 2,0 g + KH2PO4: 1,0 g + CaCl2: 0,3 g + Peptone: g + MgSO4: 0,5 g + CaCO3: 5,0 g - Cho dải giấy lọc (10 cm x 1,5 cm) ngập ống nghiệm có mơi trường - Hấp tiệt trùng nhiệt độ 121oC 30 phút Bỏ vào cục đất nhỏ để cấy nguồn vi sinh vật có bào tử Thực tập Vi sinh vật học 98 o o - Để tủ ấm 30 C 60 C - tuần o - Vi khuẩn phân giải Cellulose kị khí phát triển 60 C làm cho môi trường đục lên, phiến giấy lọc có màu vàng, nhày nát vụn dần - Xác định thành phần loài vi sinh vật phân giải cellulose kị khí - Làm tiêu từ chỗ nhày giấy nhuộm đơn Fuchsin - Quan sát tiêu kính hiển vi với vật kính dầu (x 100) Xác định hoạt tính enzyme cellulase vi sinh vật a) Chủng vi sinh vật - Thí nghiệm tiến hành chủng vi sinh vật: - Nấm mốc: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma - Xạ khuẩn: Streptomyces sp O - Nấm men: Saccharomyces sp b) Môi trường nuôi cấy 3g + FeSO4 0,01 g + K2HPO4 1g + CMC 5g + KCl 0,5 g + Agar 20 g + MgSO4.7H2O 0,5 g IN IG + NaNO3 R Môi trường để kiểm tra khả sinh enzym có thành phần: + Nước cất đủ 1000 ml L A Cách pha chế: Hòa CMC vào nước ấm, khuấy đều, đun thành hồ đổ vào hỗn hợp làm môi trường Điều chỉnh pH = 5,5 cấy nấm mốc, pH = 6,8 - 7,2 cấy xạ khuẩn Khử trùng môi trường 121oC/30 phút Phân phối môi trường vào hộp petri, để nguội c) Cấy chủng vi sinh vật để kiểm tra khả hình thành enzyme cellulase - Dùng que cấy hình thước thợ lấy giống vi sinh vật cấy vào tâm đĩa môi trường thạch điểm Mỗi đĩa thạch cấy từ chủng - Để hộp petri cấy vào tủ ấm nhiệt độ 30oC d) Xác định hoạt tính enzyme cellulase - Chủng vi sinh vật vừa phân lập ni cấy mơi trường thích hợp để phát triển thành khuẩn lạc - Các enzyme đặc trưng chúng tiết môi trường xung quanh dạng vòng suốt bao quanh khuẩn lạc gọi vòng thủy phân - Căn tỷ lệ vòng thủy phân đường kính khuẩn lạc để đánh giá khả Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 99 hình thành enzyme chủng vi sinh vật (hoạt tính enzyme vi sinh vật) - Dùng thước kẻ có chia mm, đo bán kính khuẩn lạc vi sinh vật phát triển đĩa môi trường Ghi d (mm) - Đổ dung dịch lugol lên mặt thạch môi trường - Enzyme cellulase tiết môi trường làm phân giải tinh bột phần xung quanh khuẩn lạc tạo thành vịng thủy phân khơng màu Phần cịn lại có màu xanh - Dùng thước đo bán kính vịng thủy phân Ghi D (mm) (Chú ý: đo mặt sau hộp petri đo mm) Vùng phân giải Khuẩn lạc Vùng không phân giải D IN IG R O d Hình 12.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme vi sinh vật vòng phân giải Chủng vi sinh vật Quan sát lần Thời gian nuôi D D D/d L - Ta ghi nhận kết theo mẫu bảng sau: A - Tính tỷ lệ D/d Tỷ số có giá trị cao chứng tỏ hoạt tính enzyme chủng vi sinh vật mạnh Quan sát lần Thời gian nuôi D Nhận xét kết luận d D/d Thực tập Vi sinh vật học 100 IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Phải đo đường kính khuẩn lạc trước cho dung dịch lugol vào đĩa petri để đo đường kính vịng phân giải - Khi đo kích thước khuẩn lạc, tiến hành đo mặt đĩa petri - Khi cấy sinh khối vi sinh vật vào đĩa petri, cấy vào tâm đĩa hạn chế rơi vãi vi sinh vật vùng môi trường khác đĩa (nhất bào tử nấm mốc) để tránh tượng mọc lan khuẩn lạc vi sinh vật dẫn đến không xác định vòng phân giải V BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày hoạt tính enzyme cellulase chế phân giải cellulose vi sinh vật - Trình bày phương pháp xác định khả phân giải cellulose vi sinh vật - Nhận xét khả phân giải cellulose vi sinh vật môi trường đất O - Vẽ hình tiêu nhuộm Gram vi sinh vật phân giải cellulose đất L A IN IG R - Đo kích thước khuẩn lạc, kích thước vịng phân giải So sánh hoạt tính enzym cellulase chủng vi sinh vật thử nghiệm Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 101 Bài 13 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP I NGUYÊN TẮC Phương pháp đếm trực tiếp phương pháp định lượng dựa quan sát đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật kính hiển vi buồng đếm Phương pháp dùng để xác định số lượng loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc dễ quan sát kính hiển vi Quy trình đếm đơn giản, cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật Tuy nhiên, quan sát đếm mắt kính hiển vi, phương pháp có số trở ngại: - Không phân biệt tế bào vi sinh vật sống chết mẫu O - Không phân biệt tế bào vi sinh vật hạt vật thể - Hạn chế huyền phù có mật độ thấp lượng dung dịch đem đếm nhỏ IG R Tùy mức độ có mặt vi sinh vật mẫu ban đầu, dung dịch đem đếm cần pha loãng đến mức phù hợp (số tế bào ô nhỏ không 10 tế bào) Nguyên tắc pha loãng: IN - Mẫu phải pha loãng Tùy theo mức độ nhiễm khuẩn mẫu ta có ước lượng pha loãng 1/5; 1/10 ; 1/20 hay 1/10; 1/100; 1/1000 - Dung dịch dùng pha loãng mẫu thường NaCl 9% hay photphat đệm vô trùng + Mẫu 1/5 : ml mẫu + ml NaCl 9% + Mẫu 1/10: ml mẫu + ml NaCl 9%0 L A - Cách pha: -1 -2 - Từ mẫu 1/10(10 ) lấy ml + ml NaCl 9% ta có độ pha lỗng 10 , ta -3 có độ pha loãng 10 , 10 II DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm Ф18 Bình tam giác Cốc 100 ml Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái 1 Thực tập Vi sinh vật học 102 STT Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Bình tia Pipette ml Buồng đềm vi sinh vật Lamelle Que cấy Đèn cồn Kính hiển vi Dụng cụ dùng chung Nồi hấp cao áp Tủ sấy Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 Cái Cái 1 Môi trường hóa chất O - Nước muối sinh lý 0,9% - Nước cất vô trùng R - Cồn 96o IG Nguyên liệu khác - Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae IN - Bánh men thuốc bắc - Quả nho III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM A - Mẫu nước ao, hồ dùng để đếm số lượng tảo đơn bào L Đếm lam phết kính: Tiêu vi khuẩn nhuộm màu (nhuộm đơn) D 20mm ∑ = 30 - 50 Hình 13.1 Diện tích hình vng phết kính sơ đồ di chuyển vật kính phết kính Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 103 a) Phết kính - Dùng lam bút chì mỡ (bút lơng kim), kẻ hình vng S = 400 mm , mặt lam Mục đích khơng cho vi khuẩn lan khỏi diện tích đếm - Hút V (0.02 – 0.2 ml) dung dịch pha lỗng, nhỏ vào hình vng, mặt lam - Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy đầu que dàn giọt mẫu xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vng - Cố định tiêu bản, nhuộm đơn thuốc nhuộm blue methylen - Nhỏ giọt dầu soi, xem vật kính x100 b) Cách đếm - Đếm số tế bào vi sinh vật/ 1VT (VT: vi trường) - Đếm hết tất từ 30 – 50 VT/ hình vng phết kính Theo sơ đồ hình vẽ O c) Cơng thức tính Số tế bào/ml mẫu = (X x 400)/(0.0004 x V x H) R X: Số tế bào vi khuẩn đếm vi trường IG 400: diện tích hình vng phết kính, 400 mm 0.0004: diện tích thị trường vật kính X100, πR2= 0.0004 mm2 Số vi trường có S:4 cm2 H = hệ số pha loãng mẫu a) Cấu tạo buồng đếm L A Đếm buồng đếm IN V = thể tích giọt vi khuẩn phết kính Tên loại buồng đếm Rãnh buồng đếm, nơi cho dd vào Khung đếm Chiều cao nhỏ(1/10) Diện tích nhỏ(1/400) Hình 13.2 Buồng đếm tế bào vi sinh vật Thực tập Vi sinh vật học 104 - Buồng đếm phiến kính trong, dày, hình chữ nhật - Giữa phần lõm phẳng, có kẻ hai khung đếm gồm 400 nhỏ Bên ngồi có ghi tên loại buồng đếm, ghi thơng số kỹ thuật hình b) Cấu tạo khung đếm R O Hình 13.3 Cấu tạo Khung đếm Thoma Lá kính Dịch mẫu Rãnh tràn IN IG Lưới đếm vi sinh vật A Hình 13.4 Buồng đếm nhìn mặt bên L Cấu tạo khung đếm có: - Trường hợp1: khung có 16 ô lớn, ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy khung có 400 nhỏ - Trường hợp 2: khung có 25 lớn, lớn có 16 nhỏ Vậy khung có 400 nhỏ 2 - Diện tích nhỏ 1/400 mm Vậy ô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm = 1/4000mm c) Cách tiến hành - Đặt lamelle phủ lên khung đếm - Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men pha loãng, bỏ vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm lamelle - Dung dịch chảy tràn từ từ vào rãnh, lan tỏa lấp đầy khắp lamelle, thừa Nếu bị bọt mắc lại lamelle phải làm lại - Đặt buồng đếm lên bàn kẹp kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 105 - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ trước, sau dùng vật kính x40 để đếm - Đếm số tế bào ô lớn (4 ô cạnh, ô giữa), đếm ô nhỏ ô lớn Trong tất ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trước, sau đếm số tế bào nằm cạnh phía cạnh bên trái - Đếm tất 80 nhỏ có lớn (trường hợp: lớn có 16 nhỏ) - Hoặc đếm 125 nhỏ có lớn (trường hợp: lớn có 25 nhỏ) IG R O d) Cơng thức tính IN Hình 13.5 Cách nạp mẫu dung dịch vi sinh vật vào buồng đếm A Trong trường hợp buồng đếm với lớn có 16 nhỏ, số lượng tế bào mẫu ban đầu tính sau: L Số tế bào/1 ml mẫu = (a x 250 x 1000)/H đó: a = số tế bào trung bình có lớn 3 1.000 = số quy đổi từ mm thành ml (1ml = 1000 mm ) -2 H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10 ) Thực tập Vi sinh vật học 106 Hình 13.6 Phương pháp đếm trực tiếp số lượng tảo buồng đếm IN IG R O L IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý A Hình 13.7 Những tế bào đếm (màu đen) không đếm (màu xanh) ô lớn - Chỉ đếm tổng số tế bào, biết tế bào sống, tế bào chết - Nồng độ dịch huyền phù pha loãng cho mật độ ô nhỏ không 10 tế bào - Sử dụng xong phải rửa buồng đếm lau khô - Để đạt độ xác cao, số tế bào trung bình đếm nhỏ: < a < 10 V BÁO CÁC THỰC TẬP - Trình bày nguyên tắc cách tiến hành phương pháp định lượng vi sinh vật phương pháp đếm trực tiếp - Xác định số lượng tảo đơn bào ml mẫu thực phẩm phương pháp đếm trực tiếp - Phương pháp định lượng vi sinh vật cách đếm trực tiếp thường áp dụng cho đối tượng vi sinh vật nào? Giải thích? ... suất (atm) o 10 0 Nhiệt độ sôi nước ( C) Nhiệt độ sôi nước ( F) 212 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1, 0 1, 5 2,0 10 5 11 0 11 2 11 4 11 6 11 7 11 9 12 1 12 7 13 4 2 21 230 234 237 2 41 243 246 250 2 61 273 L A IN... khoa học nghiên cứu hoạt động sống vi sinh vật gọi Vi sinh vật học Vi sinh vật học phát triển nhanh, với nhiều lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học, nấm học, tảo học, virus học hay y sinh vi sinh vật. .. thường dùng 12 1 C /1 atm 15 phút; 12 7 C /1. 5 atm 30 phút với môi o trường đất; hay 11 7 C/0.8 atm 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa… Thực tập Vi sinh vật học 10 Bảng 1. 1 Tương