Luận văn thạc sĩ sinh học ứng dụng nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng pseudomonas aeruginosa

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên,[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên, 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Khá Thái Nguyên, 2020 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ Thầy Cô, bạn bè người thân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo – QLKH&HTQT, Khoa Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi qua trình học tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Khá, người Thầy tận tình bảo cung cấp cho kiến thức quý báu phương pháp nghiên cứu kiến thức chuyên ngành Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Hội đồng chấm luận văn đóng góp cho tơi nhiều ý kiến quý báu, đánh giá ghi nhận nỗ lực học tập Tôi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Giáo dục Đào tạo “Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli sản xuất protein Azurin có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú”, mã số B2019-TNA-16 Thái nguyên, tháng 10 năm 2020 Học viên La Thị Sinh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu giới protein azurin 1.2 Tình hình nghiên cứu protein azurin Việt Nam 1.3 Khái quát trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) 1.3.1 Các tính chất sinh học 1.3.2 Các yếu tố độc lực 10 1.3.3 Sức đề kháng 12 1.3.4 Dịch tễ học 12 1.4 Tổng quan protein azurin 13 1.4.1 Sơ lược protein azurin 13 1.4.2 Cấu trúc gen azurin 14 1.4.3 Khả chống ung thư 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 21 2.1.2 Thiết bị dụng cụ hóa chất 21 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật 23 2.3.2 Tách chiết ADN tổng số vi khuẩn 23 2.3.3 Điện di gel argarose 24 iii 2.3.4 PCR phân lập gen azurin 24 2.3.5 Phương pháp tạo dòng gen 25 2.3.6 Phương pháp giải trình tự gen 26 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết DNA tổng số chủng Pseudomonas 29 3.2 Phân lập gen azurin 30 3.3 Gắn gen vào vector nhân dòng chọn dòng 30 3.4 Phân tích trình tự gen azurin 32 3.4.1 Phân tích trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 32 3.4.2 Phân tích trình tự gen azurin chủng QN1 34 3.4.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleic triphosphate EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid ETA Exotoxin A HIV Human Immunodeficiency Virus kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction PTD Miền tải nạp protein 10 TAE Tris – Acetic acid - EDTA 11 P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 12 NXB Nhà xuất v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 21 Bảng 2.2 Các dung dịch đệm sử dụng 22 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 25 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cấu trúc protein azurin 15 Hình 1.2 Cơ chế azurin gây trình apoptosis ức chế phát triển tế bào ung thư người 17 Hình 2.1 Cấu trúc vector tách dịng pTZ57R/T 26 Hình 2.2 Hình ảnh mơ tả q trình giải trình tự hệ theo nguyên lý Sanger sử dụng ddNTP có đánh dấu huỳnh quang 28 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng nghiên cứu 29 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen azurin 30 Hình 3.3 Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ khuẩn lạc sau biến nạp 31 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt 32 Hình 3.5 Trình tự gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 33 Hình 3.6 Hình ảnh kết so sánh trình tự gen azurin chủng P aeruginosa VTCC-B-657 phần mềm Blast 33 Hình 3.7 Trình tự gen azurin chủng QN1 34 Hình 3.8 Hình ảnh kết so sánh trình tự gen azurin chủng P aeruginosa QN1 phần mềm Blast 35 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide gen azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự gen azurin P aeruginosa mã số M30389 GenBank 35 Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự amino acid P aeruginosa mã số M30389 GenBank 37 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, bệnh ung thư sức khoẻ cộng đồng vấn đề ngày quan tâm hầu hết quốc gia giới Bởi lẽ, ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước kinh tế phát triển nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai nước phát triển [27] Theo WHO, năm 2008 giới có 12,6 triệu người mắc ung thư, có 7,5 triệu người tử vong Năm 2015, có khoảng 90,5 triệu người bị ung thư Mỗi năm có 14,1 triệu ca mắc mới, tử vong 8,8 triệu ca (15,7%) Ở Mỹ nước phát triển tử vong ung thư chiếm khoảng 25% hàng năm có khoảng 0,5% dân số chẩn đoán ung thư [6], [20] Tính đến năm 2018, ước tính tồn giới có khoảng 18,1 triệu trường hợp ung thư (17 triệu không bao gồm ung thư da u ác tính) 9,6 triệu ca tử vong ung thư (9,5 triệu không bao gồm ung thư da không hắc tố) [18] Việt Nam số nước có tỉ lệ mắc ung thư cao giới, WHO xếp Việt Nam nằm 50 nước thuộc top đồ ung thư (50 nước cao thuộc top 1) Mỗi năm có khoảng 115.000 người chết ung thư, tương ứng 315 người/ngày Trong đó, ung thư vú với tỷ lệ mắc 15.000 ca/năm Tỷ lệ tử vong 35% 70% người bệnh đến khám giai đoạn muộn [6] Hiện nay, phương pháp điều trị ung thư chủ yếu sử dụng phương pháp hóa trị, xạ trị phẫu thuật Các liệu pháp điều trị ung thư nhà khoa học nghiên cứu Trong hoạt chất sinh học từ thực vật, vi sinh vật quan tâm nghiên cứu Trên giới nghiên cứu chứng minh hoạt tính chống ung thư azurin exotoxin A (ETA) từ Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa), Pep27anal2 từ Streptococcus pneumoniae, độc tố bạch hầu từ Corynebacterium diphtheriae, gần phát Entap từ Enterococcus sp [29] Các chất ngăn chặn trình tổng hợp protein gây trình tự chết tế bào ung thư Vào năm 2012, nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu đặc tính nhắm mục tiêu khối u E coli Nissle 1917 để ức chế khối u ác tính B16 chuột khối u vú 4T1 thông qua biểu protein azurin Kết họ chứng minh phát triển khối u ác tính B16 khối u vú 4T1 trực tiếp hạn chế đáng kể di phổi ngăn chặn chuột có khả miễn dịch [51] Việc nghiên cứu tách chọn dòng, biểu tinh protein azurin giúp người tiến đến gần việc nghiên cứu điều trị ung thư cách hiệu khơng gây hại đến tế bào bình thường khác Bởi lẽ, sản phẩm protein azurin từ chủng P aeruginosa chứng minh có khả đặc biệt nhắm vào tế bào ung thư mà không gây tác động có hại đến tế bào bình thường [43] Ở Việt Nam, nghiên cứu azurin gen mã hóa azurin chưa có cơng bố Chính vậy, tơi tiến hành thực đề tài “Nhân dịng phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ số chủng P aeruginosa” Mục tiêu nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa protein azurin từ chủng P aeruginosa để tiến hành tạo protein azurin tái tổ hợp ứng dụng ức chế tế bào ung thư vú Nội dung nghiên cứu  Tuyển chọn chủng P aeruginosa mang gen mã hóa azurin  Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng tuyển chọn  Phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu giới protein azurin Để giảm thiểu nguy cách tối đa cho bệnh nhân, nhà khoa học nghiên cứu có kết bước đầu phương pháp điều trị ung thư mới, nhiên phương pháp nhiều hạn chế Như liệu pháp miễn dịch ung thư phương pháp điều trị sáng tạo đầy hứa hẹn cho nhiều dạng ung thư, đặc biệt u ác tính Mặc dù liệu pháp miễn dịch chứng minh có hiệu quả, tỷ lệ đáp ứng bệnh nhân khác nhóm nhỏ bệnh nhân nhóm lớn đáp ứng tốt với điều trị [40] Hay số điều tra thiết kế để nghiên cứu tác dụng chống ung thư tiềm chiết xuất vi tảo, họ chủ yếu kết luận khả gây chết tế bào ung thư apoptotic thông qua đường độc lập phụ thuộc caspase [9] Hay Nanomedicine, công nghệ thay đầy hứa hẹn cho phép tích tụ có chọn lọc chất hóa trị liệu quản lý cách có hệ thống mơ khối u thơng qua tác dụng tăng cường tính thấm lưu giữ (EPR) khối u bị rò rỉ mạch máu dẫn lưu bạch huyết Tuy nhiên hiệu điều trị bị ảnh hưởng thời gian lưu thông thuốc nano máu, tương tác hạt nano protein sau sử dụng tương tác phức tạp môi trường vi mô khối u quanh mạch (TME) diện nhiều trình sinh học [21] Việc sử dụng số peptit tổng hợp thiết kế để tối ưu hóa đặc tính kháng sinh chống khối u cải thiện khả điều trị, chúng có ưu điểm độc đáo peptit, chẳng hạn trọng lượng phân tử thấp, khả nhắm mục tiêu cụ thể vào tế bào khối u độc tính thấp mơ bình thường Tuy nhiên, peptit trị liệu có số nhược điểm đáng kể liên quan đến tính ổn định thời gian bán hủy ngắn chúng [34], [47], [45] Azurin, protein oxy hóa khử chống ung thư mạnh tiết lồi P aeruginosa báo cáo có hoạt tính chống lại dịng tế bào ung thư vú Azurin protein oxy hóa khử trọng lượng phân tử thấp, sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu sử dụng điều trị khối u, điều thúc đẩy nhà nghiên cứu tìm kiếm phương pháp để tăng cường sản xuất protein Trong nghiên cứu năm 2010, P aeruginosa phân lập từ phổi bệnh nhân xơ nang Ai Cập xác định rRNA 16S Gen azurin khuếch đại chương trình PCR thích hợp Gen nhân thành vectơ dễ dàng pGEM-T giải trình tự Sau nhân dòng vào vectơ biểu mức pET-28a (+) cách sử dụng vi khuẩn E coli BL21 làm vi khuẩn biểu Protein tái tổ hợp tinh chế cách tinh chế bước sử dụng nhựa Ni++ Kết cho thấy azurin ức chế mạnh tăng sinh dòng tế bào ung thư biểu mơ ruột kết dịng tế bào ung thư vú Đồng thời, azurin không cho thấy ảnh hưởng đến tế bào hắc tố bình thường người [38], [35] Một nghiên cứu khác, Bệnh viện Đại học Mansoura phân lập 95 chủng P aeruginosa từ bệnh nhân nội trú bệnh nhân ngoại trú tham dự phòng khám Bệnh viện Đại học Mansoura Kết nghiên cứu cho thấy azurin từ phân lập địa phương khác P aeruginosa phát huy tác dụng gây độc tế bào nhìn thấy dịng tế bào MCF-7 ung thư vú [50] Năm 2011, nhóm nhà khoa học sử dụng protein azurin từ lồi Pseudomonas khác phân tích để phân tích cấu trúc sinh lý sơ cấp, thứ cấp mối quan hệ phát sinh loài chúng Nghiên cứu thành phần axit amin, trọng lượng phân tử khác protein azurin Phân tích phát sinh loài cho thấy protein azurin loài Pseudomonas khác có tổ tiên chung, có quan hệ họ hàng chặt chẽ với trình tự bảo tồn cao [28] Trong nghiên cứu khác vào năm 2011, nhóm nhà khoa học sử dụng phương pháp tùy chỉnh để tập trung vào việc tổng hợp azurin từ chủng P aeruginosa khác với đồng rõ ràng Họ sàng lọc phát triển chủng P aeruginosa khác (1934, 741, 2453 1942) để tổng hợp azurin tăng cường sản xuất azurin Và cho thấy đặc tính azurin cách sử dụng giải hấp thụ/ion hóa laser hỗ trợ ma trận, natri dodecyl sulfat điện di gel polyacrylamide quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Kết cho thấy 2453 chủng tiết nhiều azurin cho thấy chết rụng đáng kể tế bào ung thư biểu mô vú T-47D ZR-75-1 Nghiên cứu chứng minh phương pháp tùy chỉnh để tổng hợp azurin từ chủng P aeruginosa khác với tính đồng rõ ràng tác động tự chết chúng tế bào ung thư biểu mơ vú với chế phân tử có loại oxy phản ứng [38] Trong nghiên cứu nhà khoa học Mỹ Ý, báo cáo hoạt động chống khối u p28 (một đoạn peptid azurin) phát sinh từ ổn định sau dịch mã chất ức chế khối u p53 thường điều chỉnh giảm liên kết số ligase ubiquitin Điều đòi hỏi p28 phải liên kết đặc biệt với p53 để ức chế ligase cụ thể bắt đầu phân hủy qua trung gian proteosome Trong nghiên cứu này, quang phổ lực nguyên tử, phương pháp tiếp cận công nghệ nano, sử dụng để khảo sát tương tác p28 với p53 có chiều dài đầy đủ miền lập cấp độ phân tử đơn lẻ Phân tích lực khơng liên kết số tốc độ phân ly cho thấy p28 tạo thành phức bền vững với vùng liên kết DNA p53, ức chế liên kết ligase ubiquitin khác với Mdm2 để giảm phân hủy protein p53 [39] Nghiên cứu khác Bồ Đào Nha báo cáo rằng, azurin nhắm mục tiêu Pcadherin biểu mức bệnh ung thư vú, chống lại tác dụng xâm lấn P-cadherin biểu mức xảy khoảng 30% ung thư biểu mô tuyến vú đại diện cho loại ung thư vú nguy hiểm [11] Năm 2015, Đại học Calicut Ấn Độ thực phân lập gen azurin sản xuất chủng P aeruginosa địa xác nhận diện kỹ thuật phân tử Trong số 10 mẫu chọn cho nghiên cứu này, mẫu cho thấy diện gen azurin cách sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể PCR gradient, khuếch đại đoạn DNA 545 bp đơn đặc trưng gen azurin Tổng số protein tế bào chiết xuất phân tích điện di gel SDSPolyacrylamide, có nhiều dải băng bao gồm dải tương ứng với trọng lượng phân tử 14 KD tất mẫu chọn từ PCR [42] Gần vào năm 2018, Sarwar Fahim Đại học BRAC tiến hành với 25 chủng phân lập mơi trường (đất) mục đích phân lập azurin sản xuất Pseudomonas spp địa với việc xác nhận diện azurin kỹ thuật phân tử Họ sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể (AZU-F AZU-R) PCR gradient Kết số 25 chủng phân lập, 10 chủng cho thấy diện gen azurin cách khuếch đại đoạn DNA 545 bp PCR Việc phát chủng vi sinh vật sản xuất azurin có suất cao dẫn đến việc phát triển loại thuốc chống ung thư [41] 1.2 Tình hình nghiên cứu protein azurin Việt Nam Nghiên cứu nhóm nghiên cứu vật lý lý thuyết, Đại học Tôn Đức Thắng thành phố Hồ Chí Minh đưa giả thuyết vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn đồng loại cư trú lâu dài thể người tạo protein giống azurin vũ khí chống lại xâm nhập bệnh ung thư Trong nghiên cứu trước họ, vi khuẩn giả định sàng lọc từ gen hoàn chỉnh 66 loài vi khuẩn ưu hệ vi sinh vật đường ruột người sau đặc trưng cách coi chúng thuật tốn thích chức với azurin làm đối chứng Họ dự đốn định tính 14 loại vi khuẩn giả định sở hữu đặc tính chức giống với azurin Trong công việc này, họ thực số phân tích định lượng dựa cấu trúc bao gồm tính tốn tỷ lệ phần trăm kỵ nước, mơ hình cấu trúc, nghiên cứu gắn kết phân tử vi khuẩn quan tâm chống lại protein p53, mục tiêu ung thư Cuối cùng, họ xác định vi khuẩn giả định liên kết p53 theo cách tương tự p28-azurin azurin, peptit (p1seq16, p2seq20 p3seq24) từ nghiên cứu trước họ peptit (p1seq09, p2seq05, p2seq08, p3seq02 p3seq17) phát lần [36] Sau vào tháng 12 năm 2019, tác giả Nguyễn Duy nhóm nhà khoa học khác thực nghiên cứu khác với mục đích cải thiện quy trình sàng lọc đánh giá tính đa dạng di truyền gen azurin P aeruginosa gen giống azurin hệ vi sinh vật đường ruột quần thể cụ thể Việt Nam quần thể toàn cầu Kết là, nghiên cứu tối ưu hóa thành cơng nhiệt độ ủ để khuếch đại DNA nhằm sàng lọc gen azurin áp dụng cho gen giống azurin từ hệ vi sinh vật đường ruột người; nghiên cứu phân loại gen azurin thành kiểu gen khác quy mơ tồn cầu xác nhận hoạt động chống ung thư tiềm protein tổng hợp giống azurin (Cnazu1, Dlazu11 Ruazu12) Các kết đóng góp cho phát triển thủ tục áp dụng để sàng lọc protein chống ung thư từ microbiome người hiểu biết toàn diện đáp ứng trị liệu chúng cấp độ di truyền [37] Các nghiên cứu Việt Nam dừng lại việc phân lập sàng lọc phân loại Ngoài ra, đến thời điểm chưa có cơng bố nhân dòng biểu gen azurin sử dụng azurin phương pháp điều trị ung thư 1.3 Khái quát trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) Trực khuẩn mủ xanh tìm thấy đất, nước, hệ vi sinh vật da hầu hết môi trường nhân tạo khắp giới Nó phát triển mạnh khơng mơi trường bình thường, mà khí oxy thấp, xâm chiếm nhiều mơi trường tự nhiên nhân tạo [17] 1.3.1 Các tính chất sinh học 1.3.1.1 Hình thái tính chất bắt màu Là trực khuẩn thẳng cong (không xoắn), hai đầu trịn, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đơi có xếp thành chuỗi Bắt màu Gram âm Di động nhờ lơng cực Có pili, nơi tiếp nhận page giúp vi khuẩn bám dính vào thể vật chủ Khơng có khả sinh nha bào [7], [1] 1.3.1.2 Về tính chất ni cấy Là trực khuẩn hiếu khí tuyệt đối Mọc dễ môi trường nuôi cấy thông thường Có thể mọc khoảng nhiệt độ 5-420C, tối ưu 370C; pH từ 4,5-9,0; tối ưu pH 7,2-7,5 Trên mơi trường đặc khuẩn lạc dạng S (thường gặp nuôi cấy từ bệnh phẩm lâm sàng), dạng M R Sinh sắc tố tính chất đặc trưng trực khuẩn mủ xanh Có hai loại sắc tố chính: - Pyocyanin: ni cấy mơi trường aka King A tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tiết sắc tố này, sắc tố có màu xanh cây, tan nước chloroform, sắc tố làm cho mủ môi trường nuôi cấy có màu xanh 8 - Pyoverdins: ni cấy mơi trường aka King B, sắc tố có màu vàng – lục, sắc tố huỳnh quang, phát xanh chiếu tia cực tím, dễ mơi trường ni cấy khơng chuẩn Ngồi cịn có hai loại sắc tố thứ yếu khác là: Pyorubin Pyomelanin - Pyorubrin: sắc tố màu hồng nhạt, 1% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố - Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, 1- 2% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh khơng sinh sắc tố Có vẻ việc tiếp xúc lâu dài với tác nhân khác sulfathiazole khích thích phát triển biến thể sắc tố [7], [1], [8], [5], [26] 1.3.1.3 Tính chất sinh hóa Trực khuẩn mủ xanh có oxydase dương tính, làm lỏng gelatin, khử NO3 thành N2 Sử dụng carbohydrat hình thức oxy hố có sinh axit glucose, mannitol, glycerol, arabinose Lactose âm tính, Citrat simmon dương tính, ADH dương tính; Urease âm tính, indol âm tính, H2S âm tính [5] Mặc dù phân loại sinh vật hiếu khí, P aeruginosa cịn xem sinh vật kị khí tùy nghi, vi khuẩn tăng sinh mơi trường thiếu phần hay tồn phần khí oxy Nó tăng sinh yếm khí cách sử dụng nitrat chất nhận điện tử cuối cùng, chí thiếu nitrat lên men arginine phosphoryl hóa mức chất Khả thích nghi mơi trường vi hiếu khí hay kị khí mang ý nghĩa quan quan trọng chế sinh bệnh P aeruginosa, ví dụ bệnh nhân bị viêm phổi bệnh xơ nang, mà lớp alginate dày bao quanh tế bào vi khuẩn nhầy giới hạn khuếch tán oxy vào máu [8] Sự đa dạng chế trao đổi gen, bao gồm biến nạp, tải nạp tiếp hợp, giúp P aeruginosa thích nghi với điều kiện thay đổi cách thu nhận thông tin di truyền [46] 9 1.3.1.4 Hình thái khuẩn lạc Trên mơi trường đặc, khuẩn lạc điển hình, thường gặp P.aeruginosa cấy bệnh phẩm lâm sàng: kích thước lớn,nhẵn, bờ dẹt, lồi lên, gặp khuẩn lạc xù xì nhầy [7] 1.3.1.5 Khả gây bệnh Trực khuẩn mủ xanh mầm bệnh hội gây nhiễm trùng bệnh viện thường gặp công bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Có thể gây nhiều bệnh khác nhiễm trùng vết thương, vết bỏng, hô hấp, tiết nhiệu; nhiễm trùng huyết dịch não tủy [7], [8] Do nhóm bệnh nhân có nguy mắc phải P aeruginosa nhiễm trùng bao gồm người mắc bệnh di truyền u nang bệnh nhân xơ hóa, bệnh nhân liệt, bỏng, người nhập viện đơn vị chăm sóc đặc biệt người phải thở máy, bệnh nhân bị ức chế miễn dịch số bệnh ung thư AIDS P aeruginosa thường tồn nhiều dai dẳng môi trường bệnh viện Chúng có mặt nhà, giường, chăn, đệm, lavabo, tay nhân viên y tế, nhiều dụng cụ máy móc bệnh viện ống thông, máy hô hấp nhân tạo Chúng xâm nhập vào thể qua da (nhất sau bị bỏng) qua vết thương, phẫu thuật Từ đó, vi khuẩn xâm nhập vào bệnh nhân gây bệnh Tại chỗ vi khuẩn gây viêm có mủ, điển hình mủ có màu xanh Nếu thể giảm sức đề kháng bệnh toàn thân, vi khuẩn xâm nhập gây viêm quan viêm bàng quang, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm màng bụng Có thể vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc Nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh ngày trở nên trầm trọng kháng kháng sinh mạnh vi khuẩn Mặc dù liệu pháp kháng sinh cải thiện đáng kể quản lý bệnh truyền nhiễm nói chung, nhiều P aeruginosa nhiễm trùng khơng thể điều trị đầy đủ loại bỏ ứng dụng thuốc chống Pseudomonas gây nhiễm trùng mãn tính [2], [44], [1] Khả gây bệnh P aeruginosa đa yếu tố, biểu nhiều độc tố, yếu tố độc lực, tạo nhiều loại bệnh mà gây P aeruginosa loài xâm nhập gây độc Nhiễm trùng xảy theo giai 10 đoạn: tiếp cận vi khuẩn, xâm chiếm, xâm nhập phổ biến, bệnh toàn thân nhiễm độc Yếu tố virus góp phần vào giai đoạn bệnh sinh Các yếu tố bề mặt, bao gồm pili, lipopolysaccharide, polysaccharide chất nhờn (alginate), góp phần vào hai giai đoạn Chất nhờn polysaccharide lipopolysaccharide góp phần vào trình khác sau trình nhiễm trùng Độc tố, bao gồm ETA phospholipase C (hemolysin) protease P aeruginosa góp phần làm tổn thương phổ biến mơ Chúng hỗ trợ việc thu mua chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn giai đoạn đầu nhiễm trùng Tầm quan trọng yếu tố độc lực khác phụ thuộc vào nhiễm trùng [46] 1.3.2 Các yếu tố độc lực P aeruginosa loài vi khuẩn gây bệnh hội Độc tố P aeruginosa có tác động gây chết chúng tạo với số lượng lớn Tuy nhiên, loài vi khuẩn có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền gây bệnh - Nội độc tố (endotoxin): thành phần vách tế bào vi khuẩn Nội độc tố bao gồm chủ yếu LPS lượng nhỏ protein Hoạt tính sinh học nội độc tố chủ yếu phức hợp LPS đảm nhiệm LPS có vai trị quan trọng bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết sốc nhiễm khuẩn huyết - Ngoại độc tố (exotoxin A): chất protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa ETA hoạt động tượng tự chế hoạt động độc tố vi khuẩn bạch hầu Với khả khuếch tán ức chế tổng hợp protein tế bào, ETA độc tố mạnh P aeruginosa ETA gây rối loạn chức huyết động trung tâm, thay đổi chức đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều quan, biểu rõ rệt tổn thương gan 90% số chủng P aeruginosa sản xuất ETA đặc tính độc tố khác tuỳ chủng - Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả sinh nhiều enzyme ngoại tiết, enzyme đóng vai trị quan trọng trình xâm nhập, gây bệnh chỗ: 11 + Protease: gần 90% chủng P aeruginosa có khả phân giải protein P aeruginosa tiết loại protease quan trọng alcaline elastase Nhiều chủng tiết collagenase Các protease thường có tác dụng hiệp đồng Elastase phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên ổ hoại tử thành mạch máu Enzyme cịn gây ức chế tượng opsonin hố, làm giảm khả thực bào bạch cầu đa nhân trung tính Ngồi tác động trực tiếp, protease cịn có khả làm thay đổi sức đề kháng vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc globulin miễn dịch + Hemolysine có loại: o Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): khơng có tính enzyme, khơng có tính kháng ngun độc Glycolipide đóng vai trị chất tẩy hồ tan lipid chất cần cho hoạt động phospholipase C o Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): enzyme tan máu nằm polypeptid đơn Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipide protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử chỗ tổn thương + Cytotoxine (leucocidin): protein độc với bạch cầu đa nhân trung tính tế bào lympho + Exoenzyme S: protein, có dạng: dạng khơng hoạt động khơng có tính enzyme dạng hoạt động, có tính enzyme + Enterotoxin yếu tố thấm qua thành mạch: độc tố cịn biết đến Một số nghiên cứu chứng minh, thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch đường ruột; độc tố nguyên nhân gây viêm ruột non Khi gây nhiễm qua da, yếu tố thấm vào lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ngồi lịng mạch - Glycocalyx - capsule: chức bảo vệ vi khuẩn chống yếu tố có hại cho chúng từ vật chủ thực bào, kháng thể, bổ thể, kháng sinh, giúp cho trình nhân lên vi khuẩn mơ cịn thực chức bám vào tế bào 12 - Lơng (flagella): vai trị flagella sinh bệnh học nhiễm P aeruginosa chưa rõ ràng - Pili: giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô vật chủ [1] 1.3.3 Sức đề kháng Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao so với vi khuẩn khơng có khả sinh nha bào Có thể sống hàng tuần mơi trường ẩm, thống, khơng có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp Trong môi trường tối thiểu, 50C sống tới nửa năm Trực khuẩn mủ xanh bị tiêu diệt nhiệt độ 1000C thuốc sát khuẩn thông thường Trực khuẩn sống đất, nước Ở nơi có khơng khí, đủ độ ẩm khơng có ánh sáng mặt trời, vi khuẩn sống hàng tuần Trong mơi trường có chất dinh dưỡng tối thiểu để tủ lạnh, chúng sống tháng Chuyển sang lối sống không lành mạnh với độc lực thấp lợi sống nhờ nhiều loại vi khuẩn gây bệnh P aeruginosa trốn tránh căng thẳng điều kiện bất lợi Chúng khả vận động bám vào bề mặt hình thành tập hợp tế bào vi khuẩn nhúng chất đa bào ngoại bào (EPS) để bảo vệ vi khuẩn khỏi môi trường xung quanh Những cấu trúc gọi màng sinh học tạo khả bền bỉ chống lại thực bào, stress oxy hóa, hạn chế chất dinh dưỡng / oxy, tích lũy chất thải trao đổi chất, cạnh tranh sinh vật chất chống vi trùng thông thường [17], [7], [2] 1.3.4 Dịch tễ học Mô tả P aeruginosa loài vi khuẩn khác biệt đưa vào cuối kỷ 19, sau Pasteur phát triển môi trường nuôi cấy vô trùng Việc sàng lọc thuốc nhuộm cung cấp kích thích cho nghiên cứu khoa học P aeruginosa dược sĩ Carle Gessard xuất năm 1882 với tựa đề “On the blue and green coloration of bandages” Mặc dù khả gây nhiễm trùng P aeruginosa ý vào năm 1889, khả gây bệnh bị nghi ngờ, P aeruginosa chủ yếu coi nguồn cung cấp chất kháng khuẩn mạnh Trước năm 1947, có 91 trường hợp nhiễm trùng huyết P aeruginosa báo cáo y văn [32] Một nghiên cứu năm 2018 rằng, tỷ lệ ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: ... Gắn gen vào vector nhân dòng chọn dòng 30 3.4 Phân tích trình tự gen azurin 32 3.4.1 Phân tích trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 32 3.4.2 Phân tích trình tự gen azurin chủng. .. dịng phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ số chủng P aeruginosa? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng P aeruginosa để tiến hành tạo protein azurin tái