LUẬN văn THẠC sĩ HAY tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase ở cây chè

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THỊ HẰNG TẠO DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CÂY CHÈ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cá nhân tập thể ghi nhận lời cảm ơn Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm cam đoan Tác giả Phạm Thị Hằng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Hồng Thị Thu Yến - Khoa Cơng nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học - người tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô tập thể cán Khoa Công nghệ Sinh học, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên cán công tác Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn TS Huỳnh Thị Thu Huệ Cử nhân Phạm Thị Hằng - Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tận tình dẫn giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp đỡ thời gian thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Một lần xin chân thành cảm ơn! Tác giả Phạm Thị Hằng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỤC TIÊU ĐỀ TÀI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại chè 1.1.2 Đặc điểm sinh học chung chè 1.1.3 Thành phần hóa học chè 1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 12 1.2.1 Tình hình sản xuất chè giới 12 1.2.2 Tình hình sản xuất chè Việt Nam 13 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chè giới 14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu chè Việt Nam 15 1.4 CATECHINS VÀ LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ 16 1.4.1 Catechins công dụng Catechins 16 1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp catechins chè 17 1.4.3 Leucoanthocyanidin reductase (LAR) 19 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Phương pháp thu mẫu chè 22 2.2.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ chè 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v 2.2.3 Điện di RNA tổng số 23 2.2.4 Tổng hợp cDNA 24 2.2.5 Nhân gen CsLAR1 kỹ thuật RT –PCR 24 2.2.6 Tách dòng gen CsLAR1 25 2.2.7 Xác định phân tích trình tự 29 2.2.8 Tạo vector biểu gen CsLAR1 30 2.2.9 Biểu gen CsLAR1 31 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 KHUẾCH ĐẠI GEN CsLAR1 TỪ MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU 32 3.2 TẠO DÒNG GEN, XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE 33 3.2.1 Tạo dòng gen CsLAR1 33 3.2.2 Xác định phân tích trình tự gen CsLAR1 34 3.3 BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CsLAR1 TỪ CHÈ TRUNG DU XANH TRONG VI KHUẨN E COLI 41 3.3.1 Tạo cấu trúc biểu mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E coli DH10B 41 3.3.2 Biểu gen CsLAR1 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Việt Từ viết tắt C Nghĩa tiếng Anh Catechin Catechin cDNA DNA bổ sung Complementary DNA CsLAR Gen LAR chè Camellia sinensis LAR DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide Đồng tác giả et al Đtg EDTA Axit etylene diamin tetraaxetic Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide EtOH Etanol Ethanol EGCG Epigallocatechin-3-O-gallate Epigallocatechin-3-O-gallate Epicatechin Epicatechin ECG Epicatechin-3-O-gallate Epicatechin-3-O-gallate EGC Epigallocatechin Epigallocatechin Gallocatechin Gallocatechin Chất cảm ứng biểu gen Isopropyl- -D-thiogalactoside EC GC IPTG IPTG Kilô bazơ Kilo base Leucoanthocyanidin reductase Leucoanthocyanidin reductase LB Môi trường LB Luria Bertani mRNA ARN thông tin Mesenger Axit Ribonucleic Trung tâm Thông tin Công National Center for nghệ Sinh học Quốc gia Biotechnology Information Nicotinamid adenine Nicotinamid adenine Kb LAR NCBI NAD LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii dinucleotide dinucleotide Nicotinamid adenine Nicotinamid adenine dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate Khung đọc mở Open reading frame Proanthocyanidin Proanthocyanidin Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Primer R Mồi ngược Primer reverse Primer F Mồi xuôi Primer forward RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngược Reverse Transciptase SSR Chất thị phân tử Simple sequence repeats TAE TAE Tris Acetate EDTA Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus UTR Vùng không dịch mã Untranslated region NADP ORF PA PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng tán chè Hình 1.2 Mầm chè cắt dọc Hình 1.3 Búp chè Hình 1.4 Sơ đồ đợt sinh trưởng Hình 1.5 Các loại cành chè Hình 1.6 Rễ chè Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp catechins chè 18 Hình 2.1 Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 26 Hình 2.2 Sơ đồ vector biểu pET32a(+) 30 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 31 Hình 3.1 Hình ảnh điện di kết PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ chè Trung Du xanh 32 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm tách dòng gen CsLAR1 từ mẫu chè Trung du xanh vector pJET1.2 33 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt sản phẩm PCR plasmid pJET 1.2 34 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự gen CsLAR1 phân lập từ mẫu chè Trung du xanh với số trình tự Genbank 36 Hình 3.5 So sánh trình tự amino acid suy diễn CsLAR1 từ giống chè Trung Du xanh với trình tự cơng bố 38 Hình 3.6 Kết kiểm tra plasmid 41 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm tách plasmid gắn gen CsLAR1 vào vector pET32a(+) 42 Hình 3.8 Kết cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_CsLAR1 BamHI XhoI PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ plamid 43 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm protein tổng số từ chủng Rosetta tạo CsLAR1 tái tổ hợp 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học chè tươi Bảng 1.2 Thành phần độ ẩm thay đổi theo tháng năm 11 Bảng 1.3 Diễn biến diện tích, suất, sản lượng số nước trồng chè giới năm 2016 12 Bảng 1.4 Tình hình diện tích, suất, sản lượng chè Việt Nam năm gần 14 Bảng 2.1 Thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt thực phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.4 Trình tự đoạn mồi sử dụng nhân gen CsLAR1 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR nhân gen CsLAR1 25 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng tạo đầu sản phẩm PCR 26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen CsLAR1 vector pJET 1.2 27 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid 29 Bảng 3.1 Sự sai khác số trình tự nucleotide gen CsLAR1 chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Genbank 37 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid gen mã hóa LAR giống chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Genbank 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Chè (Camellia sinensis (L) O Kuntze) loại cơng nghiệp lâu năm, có nguồn gốc vùng nhiệt đới Á nhiệt đới, trồng xuất từ lâu, trồng phổ biến giới Chè nước uống thông dụng người ưa thích khơng hương vị độc đáo nó, mà cịn nước chè có lợi cho sức khỏe Nước chè có tác dụng giải khát, khắc phục mệt mỏi bắp hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng khoái, hưng phấn thời gian lao động căng thẳng trí óc chân tay, ngăn chặn phát triển tiến triển bệnh Alzheimer [22] Hơn nữa, uống chè cịn kích thích tiêu hố mỡ, chống béo phì; chống viêm; chống sâu răng, miệng ung thư vòm họng; phòng ngừa ung thư [18], [36]; phòng ngừa bệnh tăng huyết áp [41]; tiểu đường [20] ngăn ngừa cholesteron tăng cao [17] Ngoài ra, chè cịn có khả bảo vệ da khỏi tác hại tia cực tím [21] Hầu hết đặc tính có lợi cho sức khỏe liệt kê chứng minh hợp chất polyphenol có chè Ngồi ra, chè cịn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, cải thiện đời sống nhân dân, thúc đẩy q trình cơng nghiệp hóa đại hóa nơng thơn [11] Theo đánh giá Unal (2011) có khoảng 2,5 triệu chè khơ sản xuất năm, chè đen chiếm khoảng 78%, chè xanh chiếm 20% chè Olong chiếm 2% [26] Thành phần hóa học, đặc biệt hàm lượng polyphenol, chất hòa tan định đến chất lượng sản phẩm chè [3] Trong đó, catechins chiếm khoảng 30% thành phần polyphenol chè Catechins chia thành nhóm: catechins epimer hóa cịn gọi epicatechin (EGCG, ECG, EGC EC) catechins khơng epimer hóa (GC C) [27], [30] Hiện nay, hoạt tính sinh học chế tổng hợp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 Bảng 3.1 Sự sai khác số trình tự nucleotide gen CsLAR1 chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Genbank Vị trí CsLAR1 KF879516 EF205148 KY615698 GU992401 KR045740 29 32 54 59 74 97 99 149 195 219 207 268 315 345 354 370 358 585 612 729 749 790 944 962 T G A G A C G A T G C T C A T A C T C T G G G A C G A C A C T A C G A G C G T A T T C A A G A A C G A C A C T A C G A G C G T A T T C A A G A A C G A C A C T A C G A G C G T A T T C A A G A A C G A C A C T A C G A G C G T A T T C A A G A A C A G C G G T T C A A G T G C G T G A A A A A G Kết so sánh trình tự nucleotide gen mã hóa CsLAR1 giống chè nghiên cứu với trình tự cơng bố cho thấy gen CsLAR1 bảo thủ chè, hệ số tương đồng di truyền trình tự nucleotide dao động từ 96,3–100% Trong đó, trình tự nucleotide gen CsLAR1 mẫu chè nghiên cứu so sánh với trình tự mang mã số KF879516 có 13 vị trí sai khác; có 14 vị trí sai khác so với trình tự mang mã số EF205148; có 16 vị trí sai khác so với trình tự mang mã số KY615698 GU992401; có 37 vị trí sai khác so với trình tự mang mã số LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 KR045740 Để kiểm tra sai khác trình tự nucleotide dẫn đến sai khác trình tự amino acid sai khác có liên quan đến vùng chức CsLAR1 hay không, tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn CsLAR1ở giống chè Trung Du xanh với trình tự cơng bố Kết so sánh thể hình 3.5 bảng 3.2 CsLAR1VN KF879516 EF205148 KY615698 GU992401 KR045740 10 20 30 40 50 60 70 80 90 | | | | | | | | | | | | | | | | | | MTVLESVSAVGGGVLIVGACGFIGQFIAEASLQADRPTYLLVRSVGSKTNKTLQDKGAKVIHGVVKDQAFMEKILTEHKIDIVISAIGGS A .S H K A A .S H P K A T .S H T.K A T .S H T.K A AE S R .D I I E N K A CsLAR1VN KF879516 EF205148 KY615698 GU992401 KR045740 100 110 120 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | | | | | | | NILDQLTLVHAIKAVGTIKRFLPSEFGHDVDRANPVEPGLTMYNEKRRVRRLIEECGVPYTYTCCNSIASWPYYDNTHPSEVIPPLDEFQ I I I I D I Motif RFLP Motif ICCN CsLAR1VN KF879516 EF205148 KY615698 GU992401 KR045740 190 200 210 220 230 240 250 260 270 | | | | | | | | | | | | | | | | | | IYGDGSVKAYFVAGSDIGKFTIKTVDDIRTLNKSVHFRPSCNFLNINELASLWEKKIGRTLPRVTVSENGLLAAAAVNIIPQSVVASFTH .D D R .D D Y D I CsLAR1VN KF879516 EF205148 KY615698 GU992401 KR045740 280 290 300 310 320 330 340 | | | | | | | | | | | | | | DIFIKGCQINFSIEGPNDVEVCSLYPDESFRTVDECFDDFVVKMSGKNFTDETDGNTAQNHVVEVLPITMCA N G N N.E N.E V E N G I T Motif THD Hình 3.5 So sánh trình tự amino acid suy diễn CsLAR1 từ giống chè Trung Du xanh với trình tự cơng bố ( )Trình tự amino acid thay đổi CsLAR1 với trình tự cơng bố; Dấu ( ) gốc amino vùng giàu glycine; Dấu ( ) gốc amino vùng liên kết chất LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid gen mã hóa LAR giống chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Genbank Vị trí CsLAR1 KF879526 EF205248 KY615698 GU992401 KR045740 10 V A A T T A 11 G G G G G E 20 C S S S S S 25 Q Q Q Q Q R 33 Q H H H H D 50 N N N N N I 62 H H D H H H 65 V V V V V I 69 A A A A A I 73 K K K K K E 74 I I I I T I 76 T K K K K K 90 S A A A A A 124 N N N N N D 153 T I I I I I 212 N N N N N Y 250 G D D D D D 262 Q Q R Q Q Q 264 V V V V V I 279 I I I I I V 288 D D D D D E 304 D D G D D D 315 S N N N N N 317 K K K E E K 320 T T T T T G 326 N N N N N I 340 M M M M M I LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Trên hình 3.5 cho thấy, CsLAR1 chè tương đối bảo thủ, tương đồng trình tự amino acid 88,3-100%, trình tự amino acid CsLAR1 giống chè Trung Du xanh có nhiều vị trí sai khác so với CsLAR1 giống chè cơng bố Trong đó, CsLAR1 từ chè Trung Du xanh có vị trí amino acid khác biệt (S20C; K76T; A90S; I153T; D250G, N315S) CsLAR1 thuộc siêu họ dehydrogenase, phân tích có chứa motif bảo thủ loài: motif RFLP, ICCN THD CsLAR1 có vùng chức chính, vùng liên kết với NADP giàu glycine đầu N (vị trí 18-24); vùng xác định đặc hiệu chất chứa amino acid vị trí 118H, 133Y 136K [40] Kết so sánh CsLAR1 chè cho thấy, CsLAR có tính bảo thủ amino acid liên kết với chất, vùng liên kết với NADP tất mẫu công bố S, mẫu chè Trung Du xanh C Motif RFLP THD có tính bảo thủ cao, motif ICCN CsLAR1 từ chè Trung Du xanh có vị trí amino acid khác biệt so với trình tự cịn lại I153T Mặt khác, phân tích tiến hóa họ LAR thực vật nhóm nghiên cứu Wang đồng tác giả (2017) [39] cho rằng, LAR thực vật chia làm nhóm là: nhóm thực vật mầm; thực vật mầm hạt trần LAR thực vật mầm lại chia thành phân lớp nhỏ dựa vào xuất amino acid S A vị trí thứ motif ICCN [39] Motif ICCN CsLAR1 chè Trung Du xanh có chứa S vị trí amino acid thứ có khác biệt lớn so với LAR thực vật I ICCN chuyển thành T Như vậy, CsLAR1 từ chè Trung Du xanh có số sai khác trình tự amino acid đặc biệt so với CsLAR1 chè nói riêng nói chung, vị trí sai khác xảy vùng domain chức motif bảo thủ nên tạo khác biệt chức CsLAR1 Sự sai khác có ảnh hưởng đến hoạt tính CsLAR1 cần phải có nghiên cứu sâu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 3.3 BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CsLAR1 TỪ CHÈ TRUNG DU XANH TRONG VI KHUẨN E COLI 3.3.1 Tạo cấu trúc biểu mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E coli DH10B Vector biểu pET32a(+) nằm hệ thống biểu pET, hệ thống sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm sinh học phân tử, biểu protein tái tổ hợp E coli Hệ thống biểu có nguồn gốc từ plasmid pBR322 thiết kế sử dụng promoter T7 promoter mạnh giúp tăng cường phiên mã gen mong muốn Vector pET32a(+) tạo điều kiện thuận lợi cho phép chèn gen ngoại lai vào vector có vùng đa điểm cắt mang trình tự nhận biết nhiều enzyme giới hạn khác Bên cạnh đó, thành phần lac operator giúp người dùng dễ dàng điều khiển trình biểu protein ngoại lai chất cảm ứng IPTG Đoạn gen CsLAR1 từ giống chè Trung du xanh tạo dòng vector pJET1.2, plasmid tái tổ hợp cắt hai enzyme giới hạn BamHI XhoI để thu đoạn gen CsLAR1 có kích thước 1026bp Đồng thời, phản ứng cắt BamHI XhoI tiến hành với vector pET32a(+) (Hình 3.6) Kb M 6,0 3,0 1,0 Hình 3.6 Kết kiểm tra plasmid 1: sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ dòng plasmid pJET1.2_CsLAR1 vector pET32a(+) BamHI XhoI LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 Trên hình 3.6 cho thấy, plasmid tái tổ hợp bị cắt thành hai đoạn: đoạn lớn có kích thước tương ứng với kích thước vector pJET1.2 (~ 3,0 kb) đoạn nhỏ có kích thước khoảng 1,0 kb tương ứng đoạn gen CsLAR1 Trong đó, vector pET32a(+) mở vịng có kích thước ~5,9Kb Tiếp theo, chúng tơi thực phản ứng lai gen CsLAR1 vào vector pET32a(+), biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH10B nuôi môi trường LB chọn lọc Quan sát kết đĩa cấy trải, chúng tơi thấy có số khuẩn lạc đơn mọc bề mặt đĩa Chúng chọn ngẫu nhiên 15 khuẩn lạc đĩa biến nạp ni mơi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin để tách plasmid kiểm tra Plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc thu kết điện di trình bày hình 3.7 10 11 12 13 14 15 (-) Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm tách plasmid gắn gen CsLAR1 vào vector pET32a(+) (-): vector pET32a(+) không mang đoạn chèn, – 15: 15 dòng plasmid Kết điện di kiểm tra plasmid hình 3.7 cho thấy, 15 dịng thu có dịng số 07 thấp đối chứng vector pET32a(+) không mang đoạn chèn Do đó, chúng tơi lựa chọn ngẫu nhiên số dịng plasmid cao đối chứng để phân tích chọn vector biểu pET32a(+)_CsLAR1 Đầu tiên, dòng plasmid tiến hành phản ứng cắt kiểm tra hai enzyme giới hạn BamHI XhoI Sản phẩm phản ứng cắt điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.8A) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 Kb M Kb 6,0 5,9 kb M (+) (-) 3,0 3,0 1,0 1,0 ~1,0 kb A 1,0 kb 0,5 B Hình 3.8 Kết cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_CsLAR1 BamHI XhoI PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ plamid Hình 3.8A (M: maker 1kb, - 3: sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ dịng plasmid pET32a(+)_CsLAR1); Hình 3.8B (M: maker kb, (+): sản phẩm PCR từ đối chứng dương plasmid pJET1.2_CsLAR1, (-): sản phẩm PCR đối chứng âm Trên hình 3.8A cho thấy, plasmid tách chiết cắt kiểm tra enzyme giới hạn BamHI XhoI, DNA plasmid bị cắt thành hai đoạn: đoạn lớn có kích thước tương ứng với kích thước vector pET32a(+) (5,9kb) đoạn nhỏ có kích thước khoảng 1,0kb tương ứng với đoạn gen CsLAR1 Như vậy, tạo vector pET32a(+) mang gen CsLAR1 Để chắn hơn, thực phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen CsLAR1 Sản phẩm PCR từ dòng plasmid lên băng đậm rõ nét có kích thước khoảng 1,0kb tương ứng với kích thước đoạn gen CsLAR1 (hình 3.8B) Như vậy, chúng tơi tạo dòng biến nạp vào E coli DH10B mang plasmid pET32a(+)_CsLAR1 3.3.2 Biểu gen CsLAR1 Sau thiết kế thành công vector tái tổ hợp pET32a(+)_CsLAR1, tiến hành biến nạp vector vào chủng tế bào biểu E.coli Rosetta1, E.coli Rosetta2 kiểm tra biểu CsLAR1 chủng mang vector tái tổ hợp Để lựa chọn chủng biểu thích hợp nhất, chúng tơi chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc đĩa biến nạp tiến hành cảm ứng biểu gen CsLAR1 Kết kiểm tra protein tổng số thể hình 3.9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm protein tổng số từ chủng Rosetta tạo CsLAR1 tái tổ hợp M: thang protein chuẩn Fermentas, (-): đối chứng âm chủng không cảm ứng, ts: protein tổng số, tan: protein thu pha tan, tủa: protein thu pha tủa Gen CsLAR1 có độ dài 1026bp tương ứng với sản phẩm protein lý thuyết khoảng 37,62kDa với đoạn trình tự TrxA mã hố cho protein thioredoxin (11,8kDa), His-Taq (1,68kDa), S-Taq (1,7kDa), thrombin (0,63kDa), enterkinase (0,61kDa) Như vậy, protein tái tổ hợp thu có kích thước lý thuyết khoảng 54,04kDa Hình ảnh điện di protein tổng số cho thấy sản phẩm điện di chủng E coli Rosetta1, E coli Rosetta2 có xuất băng protein đậm khác biệt so với đối chứng chủng không cảm ứng Băng protein nằm khoảng kích thước tương đương với kích thước protein CsLAR1 phần vector pET32a(+) (27,72kDa) lý thuyết Trong đó, băng protein CsLAR1 chủng E coli Rosetta1 to đậm so với chủng E coli Rosetta2 thể lượng protein thu nhiều Đồng thời đánh giá độ tan protein CsLAR1 chủng Rosetta1, Rosetta2 môi trường nước Chúng nhận thấy rằng, chủng, protein CsLAR1 hầu hết biểu dạng không tan, lượng nhỏ dạng tan Như vậy, biểu thành công vector tái tổ hợp pET32a(+)_CsLAR1 chủng E coli Rosetta1, E coli Rosetta2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Gen CsLAR1 khuếch phản ứng PCR từ khuôn cDNA từ chồi chè mẫu Trung Du xanh, kích thước sản phẩm PCR thu khoảng 1.0kb Đã tạo dòng gen CsLAR1 vector pJET1.2, xác định phân tích trình tự gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ mẫu chè nghiên cứu Gen CsLAR1 có ORF 1029 nucleotide, mã hóa 342 amino acid Hệ số tương đồng trình tự nucleotide CsLAR chè Trung du xanh với trình tự công bố ngân hàng GenBank dao động từ 96,3-100%, tương đồng trình tự amino acid 88,3-100%, có vị trí amino acid khác biệt (S20C; K76T; A90S; I153T; D250G, N315S) Đã tạo dòng vi khuẩn E coli mang vector biểu gen CsLAR1 (pET32a(+)_CsLAR1) tạo CsLAR1 tái tổ hợp CsLAR1 thu trạng thái khơng hịa tan hịa tan KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu bước tối ưu điều kiện biểu để tăng lượng protein CsLAR1 tái tổ hợp biểu dạng tan phục vụ mục đích nghiên cứu chức LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Văn Chung (2012), Luận án tiến sĩ, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên Tống Văn Hằng (1985), Cơ sở sinh hóa kĩ thuật chế biến trà, Tp HCM trích dẫn Nguyễn Hải Hà (2006), Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà(Camellia sinensis L), Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách khoa Tp.HCM Ngơ Hữu Hợp (1983), “Hóa sinh chè”, Đại học Bách khoa Hà Nội Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phịng (2004), "Đánh giá tính đa hình RAPD genome số giống chè", Tạp chí cơng nghệ sinh học, (1), 109-116 Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thu Phương, Hoàng Văn Chung, Hoàng Thị Thu Yến (2010), “Bước đầu nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng chè shan (Camellia sinensis var Assamica (Mast) Pierre sec Phamh), kỹ thuật RAPD” Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 65(03): 149-157 Lê Tất Khương, Hồng Văn Chung (1999), Giáo trình chè, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Giang Trung Khoa, Nguyễn Thanh Hải, Ngơ Xn Mạnh, Nguyễn Thị Bích Thủy, Phạm Đức Nghĩa, Nguyễn Thị Oanh, Phan Thu Hương, P.Duez (2013), "Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu đến thành phần hóa học giống chè trung du", Tạp chí khoa học phát triển, 11(3), 373-279 Trịnh Xuân Ngọ (2009), “Cây chè kĩ thuật chế biến chè”, NXB Khoa học Kĩ Thuật Công Nghệ Đỗ Ngọc Quỹ (1991), “Sự thành lập hoạt động trạm nghiên cứu nông nghiệp Phú Hộ 1918- 1945”, Viện nghiên cứu chè LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 10 Đỗ Ngọc Quỹ, Đỗ Thị Ngọc Oanh (2008), “Khoa học văn hóa trà giới Việt Nam”, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 11 Hồng Thị Thu Yến, Nguyễn Văn Tuấn, Hoàng Thị Ngà (2012), "Nghiên cứu đa dạng di truyền genome số dòng chè (Camellia sinensis) trồng xã Tân Cương – Thành phố Thái Nguyên kỹ thuật RAPD", Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 96 (8), 139 -143 12 Nguyễn Duy Thịnh (2004) “Giáo trình cơng nghệ chế biến chè”, Đại học Bách khoa Hà Nội 13 Hoàng Thị Thu Yến, Dương Thị Nhung, La Quang Thương, Hà Thị Loan (2014), "Nghiên cứu thị SSR số giống/dịng chè trồng Thái Ngun", Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 120 (6), 13-19 Tài liệu tiếng Anh 14 Chen C, Wei K, Wang L, Ruan L, Li H, Zhou X, Lin Z, Shan R & Cheng H (2015), “Expression of Key Structural Genes of the Phenylpropanoid Pathway Associated with Catechin Epimerization in Tea Cultivars”, Front Plant Sci, 8, 702 15 Bursill C, Roach P D, Bottema C D, Pal S (2001), "Green tea upregulates the low-density lipoprotein receptor through the sterol-regulated element binding Protein in HepG2 liver cells", J Agric Food Chem, 49 (11), 5639-5645 16 Eden T (1958), “Tea, Longman, green and co – London – New York – Toronto”, pp, 16-18 17 Finger A (1994), “In-Vitro studies on the effect of polyphenol oxidase and peroxidase on the formation of polyphenolic black tea constituents”, J Sci Food Agric, 66, 293-235 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 18 Hammerbacher A, Paetz C, Wright LP, Fischer TC, Bohlmann J, Davis AJ, Fenning TM, Gershenzon J, Schmidt A (2014), “Flavan-3-ols in Norway spruce: biosynthesis, accumulation, and function in response to attack by the bark beetle-associated fungus Ceratocystis polonica”, Plant Physiol, 164: 2107–2122 19 Holton T A, Brugliera F, Tanaka Y (1993), "Cloning and expression of flavonol synthase from Petunia hybrida", Plant J, (6), 1003-1010 20 Ji P Z, Jiang H B, Huang X Q, Zhang J, Liang M Z, Wang P S (2009), "Genetic diversity of ancient tea gardens and tableland tea gardens from Yunnan Province as revealed by AFLP marker", Yi Chuan, 31 (1), 101 - 108 21 Lee M J, Lambert J D, Prabhu S, Meng X, Lu H, Maliakal P, Ho C T, Yang C S (2004), "Delivery of tea polyphenols to the oral cavity by green tea leaves and black tea extract", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 13 (1), 132-137 22 Lim YC, Park HY, Hwang HS, Kang SU, Pyun JH, Lee MH (2008), “(−) -Epigallo-catechin-3-gallate (EGCG) inhibits HGF- induced invasion and metastasis in hypopharyngeal carcinoma cells”, Cancer Lett, 271:140–152 23 Liu M, Tian HL, Wu JH, Cang RR, Wang RX, Qi XH, Xu Q & Chen XH (2015), “Relationship between gene expression and the accumulation of catechin during spring and autumn in tea plants (Camellia sinensis L.)”, Hortic Res 2, 15011 24 Mauge C, Granier Td’Estaintot BL, Gargouri M, Manigand C, Schmitter JM, Chaudiere J, Gallois B (2010), “Crystal structure and catalytic mechanism of leucoanthocyanidin reductase from Vitis vinifera”, J Mol Biol, 397:1079–1091 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 25 Mukhtar H, Ahmad N (2000) “Tea polyphenols: prevention of cancer and optimizing health”, American Journal of Clinical Nutrition, 71:1698– 1702 26 M.U Unal, S.N Yabaci, A Sener (2011), “Extraction, partical purification and characterisation of polyphenol oxidase from tea leaf (Camellia sinensis)”, GIDA, 36, 137-144 27 Harbowy, D A Balentine (1997), “Tea chemistry”, Critical Reviews ill Plant Sciences, 16, 415-480 28 Pang Y, Abeysinghe IS, He J, He X, Huhman D, Mewan KM, Sumner LW, Yun J & Dixon RA (2013), “Functional characterization of proanthocyanidin pathway enzymes from tea and their application for metabolic engineering”, Plant Physiol, 161(3), 1103-1116 29 Pang Y (2013), “The antiprion compound 6-aminophenanthridine inhibits the protein folding activity of the ribosome by direct competition”, J Biol Chem, 288(26):19081-9 30 Punyasiri PA, Abeysinghe SB & Kumar V (2005), “Preformed and induced chemical resistance of tea leaf against Exobasidium vexans infection”, J Chem Ecol, 31 (6), 1315-1324 31 Sang S, Tian S, Wang H, Stark RE, Rosen RT, Yang CS & Ho CT (2003), “Chemical studies of the antioxidant mechanism of tea catechins: radical reaction products of epicatechin with peroxyl radicals”, Bioorg Med Chem, 11(16), 3371-3378 32 Sharma H, Kumar R, Sharma V, Kumar V, Bhardwaj P, Ahuja P S, Sharma R K (2009), “Identification and cross-species transferability of 112 novel unigene-derived microsatellite markers in tea (Camellia sinensis)", Am J Bot, 98 (6), 133 -138 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 33 Schramm L (2013), “Going Green: The role of the green tea component EGCG in chemoprevention”, J Carcinog Mutagen 4: 1000142 34 Singh K, Paul A, Kumar S, Ahuja P S (2009), "Cloning and differential expression of QM like protein homologue from tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze]", Mol Biol Rep, 36 (5), 921-7 35 Singh K, Rani A, Kumar S, Sood P, Mahajan M, Yadav S K, Singh B, Ahuja P S (2008), "An early gene of the flavonoid pathway, flavanone 3hydroxylase, exhibits a positive relationship with the concentration of catechins in tea (Camellia sinensis)", Tree Physiol, 28 (9), 1349-1356 36 Stafford HA (1990), “Pathway to proanthocyanidins (condensed tannins), flavan-3-ols, and unsubstituted flavans”, In Flavonoid Metabolism, pp 63–100 37 Tounektia T, Joubertbc E, Hernándezd I, Munné-Boschd S (2013), “Improving the polyphenol content of tea”, Crit Rev Plant Sci, 32: 192–215 38 FAO, “Selected indicators of food and Agricultural development in AsiaPacific region, 1982-1992, Bangkok”, 1993 39 Wang P, Zhang L, Jiang X, Dai X, Xu L, Li T, Xing D, Li Y, Li M, Gao L (2017), “Evolutionary and functional characterization of leucoanthocyanidin reductases from Camellia sinensis”, Planta, 139-154 40 Yang S, Chung J Y, Yang G, Chhabra S K, Lee M J (2000), "Tea and tea polyphenols in cancer prevention", J Nutr, 130 (2S Suppl), 472-478 41 Yamamoto T, Digumarthi H, Aranbayeva Z, Wataha J, Lewis J, Messer R (2007), “EGCG-targeted p57/KIP2 reduces tumorigenicity of oral carcinoma cells: role of c-Jun N-terminal kinase”, Toxicol Appl Pharmacol, 224: 318–325 42 Zaveri NT (2006), “Green tea and its polyphenolic catechins: medicinal uses in cancer and noncancer applications”, Life Sci, 78: 2073–2080 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 Tài liệu internet 43 Tổng quan trà xanh https://www.slideshare.net/ThuongPhamPy/tong-quan-traxanh 44 Tìm hiểu màu trà https://khotrithucso.com/luan-van-do-an-bao-cao/khoa-hoc-tu-nhien/sinhhoc/tim-hieu-ve-mau-tra.html 45 Đặc điểm sinh vật học chè https://text.123doc.org/document/1485923-dac-diem-sinh-vat-hoc-cuacay-che-p4-docx.htm 46 Đặc điểm sinh thái, sinh sản chè, phân bố ngành hàng chè nước http://tancuongtea.com.vn/bvct/che-tan-cuong-thai-nguyen-tra-thainguyen/68/2-dac-diem-sinh-thai-sinh-san-cua-cay-che-phan-bo-cuanganh-hang-che-trong-nuoc.html 47 Kỹ thuật sản xuất chè https://cnx.org/contents/X0tRBZqa@1.1:XN7C8SNJ@1/ky-thuat-sanxuat-che LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 KHUẾCH ĐẠI GEN CsLAR1 TỪ MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU 32 3.2 TẠO DÒNG GEN, XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE 33 3.2.1 Tạo dòng gen. .. định phân tích trình tự Trình tự nucleotide gen CsLAR1 xác định máy ABI PRISM®3100 Avant Genetic Anlalyzer (Applied Biosystems) Đối với mẫu, trình tự đọc với mồi xi mồi ngược Kết trình tự gen phân. .. mã hóa CsLAR1 từ giống chè Trung Du xanh gắn với vector pJET1.2 xác định trình tự Sau phân tích trình tự, khẳng định chắn đoạn sản phẩm PCR phân lập trình tự ORF hồn chỉnh mã hóa CsLAR1 Gen