Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http //www lrc tnu edu vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUY[.]
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ THU HIỀN PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG NẤM ĐẢM THU THẬP TỪ VƢỜN QUỐC GIA BIDOUP- NÚI BÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội tháng 12 năm 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Lời Cảm Ơn Trước hết, xin bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà tận tình bảo, quan tâm hướng dẫn dìu dắt tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, giúp tơi có thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Xin cám ơn Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Phân lập chọn lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà để tạo nguồn nguyên liệu cho phát triển chế phẩm ứng dụng nông nghiệp, lâm nghiệp” để hồn thành cơng trình Tơi xin cám ơn chủ nhiệm đề tài thành viên tham gia tạo điều kiện giúp thu thập số liệu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đinh Thị Thu Hằng, Th.S Đào Thị Ngọc Ánh, Th.S Nguyễn Thị Lan Anh, Th.S Phạm Quang Huy, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS Nguyễn Hải Vân, KS Nguyễn Đăng Thắng, KS Hồng Thị Nhung, CN Nguyễn Văn Huynh phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình làm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn thầy cô viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, viện Cơng nghệ sinh học tận tình dạy dỗ tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học thực luận văn Bên cạnh đó, xin cảm ơn bố mẹ, chồng người thân yêu tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Trần Thị Thu Hiền Lời cam đoan Tôi xin cam đoan trực tiếp thực nghiên cứu luận văn Mọi kết thu không chép từ nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết luận văn chưa cơng bố Mọi liệu hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng từ nguồn liệu mở với đồng ý tác giả Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Tác giả Trần Thị Thu Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm tự nhiên Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà 1.2 Enzyme laccase 1.2.1 Giới thiệu laccase 1.2.2 Cấu trúc phân tử laccase 1.2.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.2.4.Chất gắn kết 1.2.5 Tính chất laccase 1.2.5.1 pH tối ưu độ bền pH 1.2.5.2 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt 1.2.5.3 Hằng số động học phản ứng laccase 1.2.5.4 Chất ức chế laccase 1.2.6 Sự phân bố laccase vi sinh vật sinh enzyme laccase 10 1.2.7 Gene mã hóa enzyme laccase 12 1.2.8 Ứng dụng laccase 13 1.2.8.1 Xử lý rác thải loại màu thuốc nhuộm 13 1.2.8.2 Ứng dụng xử lý khí độc mơi trường nhiễm chuyển hóa polymer mạch dài 14 1.2.8.3 Ứng dụng công nghệ thực phẩm 15 1.2.8.4 Ứng dụng công nghệ dược phẩm công nghệ nano 15 1.2.8.5 Các ứng dụng khác laccase 16 1.2.9 Chi Polyporus đặc tính 17 1.3 Thuốc nhuộm đặc tính chúng 20 1.3.1 Khái quát phân loại thuốc nhuộm 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 1.3.2 Khả phân hủy, loại màu thuốc nhuộm vi sinh vật sinh laccase 23 1.3.3 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm tác hại 26 1.3.3.1 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm thuốc nhuộm 26 1.3.3.2 Tác hại ô nhiễm thuốc nhuộm 26 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu phƣơng pháp 28 2.1.1 Vật liệu 28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Thiết bị 28 2.1.4 Các môi trường nuôi cấy 28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phân lập chủng nấm sinh enzyme ngoại bào 29 2.2.2 Sàng lọc chủng nấm sinh enzyme ngoại bào 29 2.2.3 Phương pháp thu dịch laccase môi trường lên men lỏng để xác định hoạt tính 29 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 30 2.2.5 Phân loại chủng nấm 30 2.2.5.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 30 2.2.5.2 Phân loại phương pháp xác định so sánh trình tự vùng ITS 31 2.2.5.3 Phương pháp xác định trình tự vùng ITS 31 2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp laccase 31 2.2.6.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 32 2.2.6.2 Ảnh hưởng chất cảm ứng 32 2.2.6.3 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy 32 2.2.6.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon 32 2.2.6.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô 32 2.2.6.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu 32 2.2.7 Đánh giá hiệu loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase thơ từ chủng nấm FBD154 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………… 34 3.1 Phân lập chủng nấm sinh enzyme ngoại bào 34 3.2 Sàng lọc chủng nấm sinh enzyme ngoại bào 35 3.3 Đặc điểm hình thái, phân loại định danh chủng nấm FBD154 38 3.3.1 Đặc điểm hình thái 38 3.3.2 Phân loại chủng FBD154 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 3.3.2.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 39 3.3.2.2 Phân loại phương pháp xác định so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) 39 3.4 Chọn lọc môi trƣờng điều kiện nuôi cấy 41 3.4.1 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 41 3.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 43 3.4.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 44 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 46 3.4.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 47 3.4.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp laccase chủng Polyporus sp FBD154 48 3.4.6.1 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô 48 3.4.6.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu 50 3.5 Khả loại màu thuốc nhuộm enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng nấm Polyporussp FBD154 51 3.5.1 Khả loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) laccase thơ từ chủng Polyporus sp FBD154 52 3.5.2 Khả loại màu azo (NY1, NY7) laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 54 3.5.3 Khả loại màu thương mại (CLS LF-2B) laccase thô chủng Polyporus sp FBD154 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận 60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Tiếng Việt 62 Tiếng Anh 62 PHỤ LỤC 74 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid Ace Acetosyringone bp Base pair CLS Dimaren Black CLS CGK Chất gắn kết DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid Đtg Đồng tác giả HCH Hexachlorocyclohexane HBT Hydroxybenzotriazole ITS Internal transcribed spacer Lac Laccase LF-2B Everzol Red LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase NY1 Acid red 299 NY5 Acid blue 281 NY7 Acid red 266 PCR Polymerase Chain Reaction RBBR Remazol brilliant blue R Si Sinapic acid Sy Syringaldehyde VIO Violuric acid VSV Vi sinh vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số vi sinh vật có khả sinh laccase 11 Bảng 1.2 Một số loại thuốc nhuộm hoạt tính 23 Bảng 3.1 Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào 35 Bảng 3.2 Hoạt tính laccase hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm môi trường PDA ………………………………………………………………………………… 36 Bảng 3.3 Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase FBD154 có mặt chất gắn kết khác 58 Bảng 3.4 So sánh hiệu suất loại màu laccase chủng nấm FBD154 so với laccase thu chủng nấm khác 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh khơng gian ba chiều laccase từ M albomyces Hình 1.2 Trung tâm hoạt động laccase Hình 1.3 Cơ chế xúc tác laccase [40] Hình 3.1 Hoạt tính tự nhiên mẫu nấm từ Bidoup 34 Hình 3.2 Hoạt tính laccase chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà 38 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng nấm FBD154 38 Hình 3.4 Hệ sợi nấm kính hiển vi quang học 39 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loài chủng FBD154 40 Hình 3.6 Ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy đến khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 42 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp.FBD154 43 Hình 3.8 Ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 45 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 mơi trường lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp FBD154 46 Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh laccase chủng 47 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn nitơ vơ lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp.FBD154 49 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ hữu lên khả sinh laccase chủng Polyporus sp.FBD154 50 Hình 3.13 Khả loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) dịch enzyme thô chủng Polyporus sp FBD154 có khơng cómặt chất gắn kết 52 Hình 3.14 Sự thay đổi màu RBBR laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 52 Hình 3.15 Sự thay đổi màu NY5 laccase thơ từ chủng Polyporus sp.FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 52 Hình 3.16 Khả loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) enzyme thơ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Hình 3.17 Sự thay đổi màu NY1 laccase thơ từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 54 Hình 3.18 Sự thay đổi màu NY7 laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 54 Hình 3.19 Khả loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) dịch enzyme thô chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 55 Hình 3.20 Sự thay đổi màu CLS laccase thô từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 56 Hình 3.21 Sự thay đổi màu LF-2B laccase thơ từ chủng Polyporus sp FBD154 có khơng có mặt chất gắn kết 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền MỞ ĐẦU Hiện nay, ô nhiễm môi trường ngày trở nên nghiêm trọng vấn đề cấp thiết tồn giới quan tâm Sự nhiễm ngày gia tăng tác động thiên tai hoạt động người Việt Nam nước mà tình trạng nhiễm mơi trường trở nên báo động, có tình trạng nhiễm nguồn thuốc nhuộm khơng xử lý Cùng với phát triển nhiều ngành công nghiệp khác sử dụng màu tổng hợp giấy in, photo màu hay thêm vào sản phẩm dầu mỏ, đặc biệt ngành công nghiệp dệt nhuộm lượng lớn nước thải màu thải mơi trường Thơng thường, chất có thuốc nhuộm không bám hết vào sợi vải q trình nhuộm mà cịn lại lượng dư định tồn nước thải Đây nguyên nhân làm cho nước thải dệt nhuộm có độ màu cao nồng độ chất nhiễm lớn, không xử lý triệt để chúng gây ô nhiễm nguồn nước mặt nước ngầm.Cụ thể thuốc nhuộm gây nên nhiều bệnh hiểm nghèo đặc biệt bệnh ung thư gây nên đột biến Do ảnh hưởng xấu đến môi trường nên xử lý thuốc nhuộm vấn đề toàn xã hội quan tâm Một số phương pháp xử lý nước thải từ nhà máy dệt nhuộm sử dụng phương pháp vật lý hóa học thường khơng triệt để Loại màu phân hủy thuốc nhuộm đường sinh học quan tâm năm gần cơng nghệ sinh học vừa mang lại hiệu kinh tế thân thiện với môi trường Trong phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm vi sinh vật sử dụng hệ enzyme ngoại bào từ đại diện hai ngành Basidomycota Ascomycotanhư laccase, manganese peroxidase (MnP), lingnin peroxidase (LiP) quan tâm hiệu kinh tế môi trường Những năm gần việc nghiên cứu sàng lọc để tiến tới sản xuất enzyme ngoại bào từ nấm đảm nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu giành quan tâm đăc biệt laccase Các nguyên cứu tìm kiếm khai thác Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoredase peroxidase từ nấm đảm đạt thành tựu cao Đã phát 100 loại laccase có trọng lượng phân tử khác với hoạt tính tính chất khác Chúng có khả phá vỡ liên kết hợp chất hữu xúc tác chuyển hóa chúng thành chất độc dạng dễ phân hủy để tiến tới khống hóa hồn tồn chất ô nhiễm Laccase xuất loại thực vật bậc cao nhiều nấm lớn, có dải pH tối thích rộng có loại laccase có khả chịu nhiệt cao Chúng có khả phân hủy phenol hợp chất phenol Ngoài ra, laccase ứng dụng nhiều lĩnh vực khử độc loại màu thuốc nhuộm màu khác ngành công nghiệp thải ra, xử lý nước thải, làm trắng giấy có ứng dụng công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nano, dược phẩm v.v Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính chủng nấm đảm thu thập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà” tiến hành Luận văn bao gồm nội dung chủ yếu sau: - Phân lập sàng lọc chủng nấm đảm có khả sinh laccase cao từ vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng; - Phân loại chủng nấm chọn lọc có hoạt tính cao phương pháp truyền thống xác định trình tự vùng ITS; - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy phù hợp để chủng chọn sinh tổng hợp laccase với hoạt tính cao; - Đánh giá khả loại màu số thuốc nhuộm hoạt tính (tổng hợp thương mại)bởi laccase thô thu từ chủng nghiên cứu có khơng có chất gắn kết Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm tự nhiên Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà hai mươi tám vườn quốc gia nằm hệ thống khu rừng đặc dụng Việt Nam Khu vực Bidoup – Núi Bà thuộc địa giới hành Huyện Lạc Dương Tỉnh Lâm Đồng chiếm gần trọn cao nguyên Langbiang (còn gọi cao nguyên Lâm Viên), cách thành phố Đà Lạt 50 km theo tỉnh lộ 273 Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà nằm tọa độ địa lý Từ 12 độ 00' 00” đến 12 độ 52' 00” vĩ độ Bắc từ 108 độ 17'00” đến 108 độ 42' 00” kinh độ Đơng Địa hình núi trung bình núi cao, chia cắt mạnh, độ cao phổ biến từ 1.500m 1.800m Ðịa hình thấp dần theo hướng Nam Bắc Nhiệt độ trung bình năm 18 0C Lượng mưa trung bình 1.755 mm/năm, mùa khơ lượng mưa chiếm khoảng 20%, mùa mưa lượng mưa chiếm khoảng 80%; số ngày mưa trung bình 170 ngày/năm Số ngày có sương mù khoảng 80 ngày/năm, tập trung vào tháng 2, 3, 4, Khu vực Vườn quốc gia Bidoup-Núi Bà thượng nguồn hệ sông Krơng-Knơ, sơng Ða Nhim, trì nguồn nước cho loạt hồ Ðà Lạt như: hồ Ðan Kia, hồ Ða Thiện, hồ Than Thở, hồ Xuân Hương Vườn quốc gia Bidoup-Núi Bà mẫu chuẩn hệ sinh thái rừng kín thường xanh mưa ẩm nhiệt đới Việt Nam đặc trưng cho vùng cao nguyên, địa điểm lý tưởng nghiên cứu khoa học, bảo tồn đa dạng sinh học Đa dạng sinh học loài thực vật: với khoảng 1.468 loài bao gồm họ Lan 250 loài; họ Cúc 78 loài; họ Ðậu 65 loài; họ Cỏ 58 loài; họ Cà phê 45 loài; họ Dẻ 41 loài; họ Thầu dầu 35 loài; họ Cói 33 lồi; họ Hoa hồng 33 lồi; họ Long não 29 loài; họ Dâu tằm 28 loài; họ Ðơn nem 25 loài; họ Bạc hà 22 loài; họ Ðỗ quyên 21 loài; họ Chè 21 loài… Đa dạng nguồn gene: có nhiều nguồn gene quý đặc hữu; riêng đặc hữu hẹp thống kê 91 lồi: Thơng tre, Thơng đỏ, Du sam, Pơ mu Bách xanh, Thông hai dẹt, Thông Ðà Lạt, Ðỉnh tùng, Hồng đàn giả Cơm Bidoup, Chè gị đồng Bidoup, Lan Hồng Thảo Ðà Lạt, Lan Hồng thảo Lang Biang, Trà hoa Langbiang, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Chân chim Langbian, Cung nữ Langbian, 250 loài phong lan, cho hoa đẹp quý, loài Ðỗ quyên, loài Thu hải đường, lồi Thích nguồn gen q Đa dạng loài động vật: Về thú: Bao gồm họ: họ Cầy, họ Chuột, họ Khỉ, họ Mèo, họ Sóc cây, họ Chồn, họ Hươu nai, họ Gấu, họ Trâu bị, họ Nhím, họ Chuột chù, Chồn bay, họ Dơi quả, họ Cu li, họ Vươn, họ Chó, họ Lợn, họ Cheo cheo, họ Tê tê, họ Sóc bay, họ Dúi Về Chim: họ Khướu, họ Trĩ , họ Cu cu, họ Chào mào, họ chim chích; đặc biệt có lồi đặc hữu hẹp như: Mi Langbian, Khướu đầu đen, Khướu má xám, Sẻ thông họng vàng Về Bị sát: họ Rắn nước, họ Nhơng, họ Rắn hổ, họ Tắc kè, họ Kỳ đà, họ Rùa núi, họ Thằn lằn bóng, họ Trăn, họ Rắn mống, họ Rắn lục, họ Ba ba Về Ếch Nhái: có họ: họ Ếch nhái, họ Nhái bầu, họ Cóc nhà, họ Ếch cây; … vv Tuy nhiên nay, nghiên cứu hệ nấm vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà cịn ít, có đề tài điều tra, đánh giá, phân loại loài nấm tán rừng thơng tập trung vào điều tra lồi nấm cộng sinh ngoại bào ThS Tôn Thất Minh, cịn hệ nấm ngoại sinh nhóm vi sinh khác chưa có nghiên cứu cụ thể Đặc biệt, với đặc điểm rừng tán rộng, độ che phủ cao, ẩm quanh năm hệ vi sinh vật nơi kỳ vọng đa dạng, cần nghiên cứu khai thác bền vững Vì đề tài mở hướng nghiên cứu mới, vừa góp phần xây dựng sở liệu đa dạng sinh học cho Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, vừa đưa hướng khai thác hiệu hệ sinh thái rừng phục vụ cho việc phát triển kinh tế môi trường bền vững 1.2 Enzyme laccase 1.2.1 Giới thiệu laccase Laccase (p–benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2 ) thuộc nhóm enzyme oxy hóa khử Trong phân tử có chứa nguyên tử đồng có khả oxy hóa chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn enzyme khác, laccase có phổ chất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin hợp chất vô iot Các loại laccase tách chiết từ nguồn khác khác khối lượng Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền phân tử, tính chất glycosyl hóa tính chất động học Trong năm gần đây, laccase đặc biệt quan tâm enzyme có ứng dụng hữu ích nhiều ngành công nghiệp khác xử lý khử độc công nghệ phân hủy sinh học, dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm, dược phẩm v.v 1.2.2 Cấu trúc phân tử laccase Một lồi sinh vật có nhiều dạng isozyme laccase, dạng isozyme khác trình tự axit amin số tính chất động học xúc tác Nấm tạo nhiều dạng isozyme laccase khác mức độ glycosyl hóa thành phần gốc cacbonhydrat Lồi nấm Trametes versicolor có dạng isozyme khác thành phần cacbonhydrat, thành phần cacbonhydrat chúng thay đổi từ 10-45% so với khối lượng thành phần protein Phân tử laccase thường monomeric protein, số oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động khoảng 60-90 kDal Phần lớn laccase nấm có chất glycoprotein với hàm lượng cacbonhydrat chiếm khoảng 10-25% [35] Ngồi cịn có nhiều loại enzyme giống laccase (laccase-like) Tuy vậy, tất laccase giống cấu trúc trung tâm xúc tác với nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng chia thành ba nhóm: Loại (T1), loại (T2) loại (T3), chúng khác tính chất hấp thụ ánh sáng điện tử Các ngun tử đồng T1 T2 có tính chất hấp thụ điện tử tạo thành phổ điện tử mạnh, cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử hoạt hóa liên kết với anion mạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Hình 1.1 Hình ảnh khơng gian ba chiều laccase từ M albomyces Tiểu phần A, B, C kí hiệu đỏ, xanh lam xanh Phân tử laccase thơng thường bao gồm tiểu phần (vùng) A, B, C có khối lượng tương đối nhau, ba phần có vai trị q trình xúc tác laccase Vị trí liên kết với chất nằm khe vùng B vùng C, trung tâm nguyên tử đồng nằm vùng C trung tâm ba nguyên tử đồng nằm bề mặt chung vùng A vùng C Trung tâm đồng nguyên tử chứa nguyên tử đồng T1, liên kết với đoạn peptit có hai gốc histidin gốc cystein Liên kết nguyên tử đồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh cystein liên kết đồng hóa trị bền hấp thụ ánh sáng bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 cặp nguyên tử đồng T3 Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ nguyên tử đồng T3 tạo liên kết với gốc histidin bảo thủ (Hình 1.2) Hình 1.2 Trung tâm hoạt động laccase Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 1.2.3 Cơ chế xúc tác laccase Laccase enzyme oxy hóa khử có khả oxy hóa diphenol hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn loại enzyme khác, laccase có phổ chất rộng Sự phù hợp chất laccase định hai nhân tố Thứ phù hợp chất nguyên tử đồng T1, thứ hai phụ thuộc vào chênh lệch oxy-hóa khử chất enzyme Các đại lượng phụ thuộc vào cấu trúc hóa học chất Thế oxy hóa khử laccase dao động khoảng 0,4 đến 0,8 V [43] Cơ chất khử bị điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành gốc tự do, gốc tự không bền tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác laccase tiếp tục phản ứng không cần xúc tác enzyme hydrat hóa, phân ly polymer hóa Trung tâm nguyên tử đồng nguyên tử (T1) nơi diễn phản ứng oxy hóa chất Cơ chất chuyển điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có nguyên tử đồng trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến vận chuyển đồng thời electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, cuối bị khử thành nước (Hình 1.3) Hình 1.3 Cơ chế xúc tác laccase [40] Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Ngồi ra, chế xúc tác xảy theo chế sau Cơ chế đơn giản diễn chất bị oxy hóa trực tiếp trung tâm hoạt động nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên, phần tử chất thường có cấu tạo cồng kềnh khử q lớn, chúng tiếp cận trung tâm phản ứng laccase Trong trường hợp cần hợp chất hóa học trung gian chất gắn kết (CGK) Hợp chất hóa học tiếp xúc với trung tâm phản ứng laccase bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự [77] Sự tham gia chất trung gian làm tăng phổ chất xúc tác tính khơng đặc hiệu chất laccase 1.2.4.Chất gắn kết Như trình bày trên, laccase có khả loại khử độc nhiều màu công nghiệp [45] Tuy nhiên, số màu khơng thể bị oxy hóa, bị oxy hóa phần laccase Bởi phần tử chất thường có cấu tạo cồng kềnh oxi hóa khử q lớn, chúng khơng thể tiếp cận trung tâm phản ứng laccase Trong trường hợp cần chất gắn kết (mediator) có vai trị quan trọng để tiếp xúc với trung tâm phản ứng laccase bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự [77] Sau CGK dạng oxy hóa nhận điện tử chất trở thành dạng khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác Ngược lại, laccase sau cho CGK điện tử trở thành dạng khử, sau bị oxy hóa thành dạng oxy hóa tiếp tục tham gia vào chu kỳ Do đó, CGK có vai trị quan trọng phản ứng enzyme trường hợp Hơn 100 loại CGK biết đến CGK thường sử dụng nhiều HBT,VIO, ABTS, Ace, Si, Sy Những CGK chứng minh có hiệu việc oxy hóa loại màu khác [45] 1.2.5 Tính chất laccase 1.2.5.1 pH tối ưu độ bền pH Laccase hoạt động tối thích khoảng pH 4-6 chất phenolic Khi Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền tăng pH sang vùng trung tính vùng kiềm hoạt tính laccase bị giảm, ngun nhân anion nhỏ ion hydroxyt ức chế laccase Mặt khác, tăng pH cịn làm giảm oxy hóa khử chất phenolic chất phenolic dễ bị oxy hóa laccase Do vậy, hoạt tính laccase pH khác kết hai tác dụng đối lập pH tăng chênh lệch oxy hóa khử laccase-cơ chất tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử ion hydroxit Đối với chất phenolic ABTS phản ứng oxy hóa khơng liên quan đến vận chuyển ion pH tối thích nằm khoảng 2-3 Ngược lại, tính bền laccase cao khoảng pH kiềm nằm khoảng 8-9 1.2.5.2 Nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt Nhiệt độ bền laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc VSV Nhìn chung, laccase bền 30-50oC nhanh chóng hoạt tính nhiệt độ 60oC Laccase bền nhiệt phân lập chủ yếu từ loài thuộc sinh vật nhân sơ Ví dụ thời gian bán hủy laccase Streptomyces lavendulae 100 phút 70oC protein cotA từ loài Bacillus subtilis 112 phút 80oC Thời gian bán hủy laccase có nguồn gốc từ nấm thường 70oC 10 phút 80oC [43] 1.2.5.3 Hằng số động học phản ứng laccase Hoạt tính xúc tác enzyme đặc trưng số Michaelis-Menten (Km) Hằng số laccase dao động giới hạn rộng, khoảng 2500 µM phụ thuộc vào nguồn enzyme chất Giá trị Km thấp chất syringaldazine Ái lực oxy phụ thuộc vào enzyme dao động khoảng 20-50µM 1.2.5.4 Chất ức chế laccase Các chất ức chế laccase thường ion nhỏ azit, cyanit, fluorit Các ion liên kết vào trung tâm đồng nguyên cản trở dòng điện tử đến nguyên tử Các chất ức chế laccase khác ethylenediaminetetraaxetic axit, axit béo, tropolon axit coumaric chúng có tác dụng ức chế nồng độ cao Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền Các hợp chất chứa sulfhydryl L-cystein, dithiothreitol thioglycolic axit coi chất ức chế laccase 1.2.6 Sự phân bố laccase vi sinh vật sinh enzyme laccase Laccase enzyme phổ biến tự nhiên, chúng tìm thấy thực vật, nấm, số vi khuẩn côn trùng Laccase lần phát Rhus vernicifera Nghiên cứu laccase đối tượng thực vật nấm đảm thể sinh tổng hợp laccase phổ biến Laccase từ nấm nghiên cứu khảo sát kỹ đặc biệt laccase từ nấm đảm thuộc chi Basidiomyces Ngồi ra, laccase cịn phát lồi nấm chi Ascomyces,Deuteromyces lồi nấm có khả phân hủy lignocellulose Agaricus bisidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomiumthemophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotusostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor v.v Tuy nhiên, nghiên cứu laccase đối tượng nấm sợi, xạ khuẩn vi khuẩn lại khơng nhiều Một số VSV có khả tạo laccase trình bày bảng 1.1 10 ... tài ? ?Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính chủng nấm đảm thu thập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà? ?? tiến hành Luận văn bao gồm nội dung chủ yếu sau: - Phân lập sàng lọc chủng nấm đảm có... kết Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm tự nhiên Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà hai mươi tám vườn quốc gia nằm hệ... thực nghiên cứu luận văn Mọi kết thu không chép từ nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết luận văn chưa cơng bố Mọi liệu hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng từ nguồn