Luận văn thạc sĩ tinh sạch, nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa và tác dụng sinh học của polisaccarit từ lá cây

br VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ VÂN ANH Tinh sạch, nghiên cứu số đặc tính sinh hóa tác dụng sinh học polisaccarit từ Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ VÂN ANH Tinh sạch, nghiên cứu số đặc tính sinh hóa tác dụng sinh học polisaccarit từ Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 6042 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ HOÀI BẮC HÀ NỘI - 2017 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh LỜI CẢM ƠN Trong lời luận văn Thạc sỹ Khoa học này, em muốn gửi lời biết ơn chân thành tới tất người hỗ trợ, giúp đỡ em chuyên môn, vật chất tinh thần trình thực luận văn Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới giáo TS Võ Hồi Bắc, Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam, người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo, nhận xét giúp đỡ em tận tình suốt trình thực luận văn Em xin cảm ơn thầy, cô Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam, đơn vị đào tạo bồi dưỡng sau đại học, người dạy dỗ, bảo em suốt trình học tập nghiên cứu vừa qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè thành viên khóa đào tạo Thạc sỹ K19 đồng hành, giúp đỡ động viên em nhiều q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp Do thời gian thực có hạn, kiến thức chun mơn cịn nhiều hạn chế nên luận văn em thực không tránh khỏi thiếu sót định Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy, bạn để em hồn thiện luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2017 Học viên Trần Thị Vân Anh Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined Mục tiêu nghiên cứu đề tài Error! Bookmark not defined PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Polisaccarit Error! Bookmark not defined 1.2 Vai trò sinh học tác dụng polisaccarit thực vật Error! Bookmark not defined 1.3 Giới thiệu chung Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum Error! Bookmark not defined 1.4 Khái niệm viêm Error! Bookmark not defined 1.5 Vai trò đại thực bào (macrophage) đáp ứng viêm Error! Bookmark not defined 1.6 Vai trò cytokine đáp ứng viêmError! Bookmark not defined PHẦN II Error! Bookmark not defined VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu .Error! Bookmark not defined 2.1.1 Nguyên liệu thực vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Xử lý nguyên liệu Error! Bookmark not defined 2.2.2 Các phản ứng định tính đặc trưng .21 2.2.3 Định lượng polisaccarit phương pháp phenol - sunfuric axit (Dubois, 1956) Error! Bookmark not defined Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit Error! Bookmark not defined 2.2.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry .24 2.2.6 Phương pháp tinh polisaccarit Error! Bookmark not defined 2.2.7 Phân tích độ chế phẩm polisaccarit phổ UV Error! Bookmark not defined 2.2.8 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC xác định độ trọng lượng phân tử polisaccarit Error! Bookmark not defined 2.2.9 Xác định độ nhớt polisaccarit Error! Bookmark not defined 2.2.10 Xác định ảnh hưởng pH nhiệt độ tới chất lượng chế phẩm polisaccarit Error! Bookmark not defined 2.2.11 Phương pháp xác định mức ảnh hưởng polisaccarit lên khả sống sót đại thực bào Error! Bookmark not defined 2.2.12 Phương pháp định lượng nồng độ cytokine IL-6 TNF-α Error! Bookmark not defined 2.2.13 Xác định hoạt tính quét gốc tự sử dụng phương pháp DPPH Error! Bookmark not defined 2.2.14 Đánh giá tác dụng làm lành vết thương tế bào nguyên sợi da người theo phương pháp Laing Error! Bookmark not defined 2.2.15 Thử nghiệm tác dụng chế phẩm polisaccarit chuột tiêm cyclophosphamide Error! Bookmark not defined 2.2.16 Phân tích thống kê Error! Bookmark not defined PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Định tính nhận biết polisaccarit polisaccarit peptic nguyên liệu Error! Bookmark not defined 3.2 Nghiên cứu điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết rút hiệu polisaccaritError! Bookmark not defined 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết rút polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.2.3 Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit Error! Bookmark not defined Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh 3.2.4 Tỷ lệ ngun liệu dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.3 Tinh polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.4 Nghiên cứu số tính chất polisaccarit tinh Error! Bookmark not defined 3.4.1 Xác định độ trọng lượng phân tử chế phẩm polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.4.2 Xác định độ nhớt chế phẩm polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.4.3 Đánh giá ảnh hưởng pH nhiệt độ tới chất lượng chế phẩm polisaccarit Error! Bookmark not defined 3.5 Nghiên cứu số tác dụng sinh học polisaccarit tinh từ Xuân Hoa P palatiferum Error! Bookmark not defined 3.5.1 Xác định hoạt tính quét gốc tự Error! Bookmark not defined 3.5.2 Đánh giá hoạt tính độc tố polisaccarit tới khả sống tế bào macrophage Error! Bookmark not defined 3.5.3 Đánh giá ảnh hưởng polisaccarit đến giải phóng cytokine Error! Bookmark not defined 3.5.4 Đánh giá tác dụng làm lành vết thương tế bào nguyên sợi da người Error! Bookmark not defined 3.5.5 Đánh giá khả tăng cường miễn dịch polisaccarit từ từ Xuân Hoa P Palatiferum Error! Bookmark not defined PHẦN IV 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 4.1 Kết luận 58 4.2 Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz 22 Bảng 2.2 Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry 25 Bảng 3.1 Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit polisaccarit peptic 34 Bảng 3.2 So sánh phương pháp loại protein Sevag TCA 41 Bảng 3.3 Hoạt tính polisaccarit phân đoạn qua cột Sephadex G100 42 Bảng 3.4 Các bước tinh polisaccarit từ Xuân Hoa P Palatiferum 42 Bảng 3.5 Xác định hoạt tính quét gốc tự sử dụng phương pháp DPPH 49 Bảng 3.6 Sự thay đổi trọng lượng chuột ngày thí nghiệm 55 Bảng 3.7 Trọng lượng tương đối tuyến ức, lách, hàm lượng hemoglobin (Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu (BC) 56 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Xn Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk 11 Hình 3.1 Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit 35 Hình 3.2 Ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng polisaccarit 36 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất 37 Hình 3.4 Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit 38 Hình 3.5 Tỷ lệ dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit 39 Hình 3.6 Sắc ký qua cột Sephadex G100 41 Hình 3.7 Sơ đồ tinh chế phẩm polisaccarit 44 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa 45 Hình 3.9 Phổ sắc ký thẩm thấu gel GPC polysaccharit tinh từ Xuân Hoa P palatiferum 46 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến chế phẩm polisaccarit 47 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polisaccarit 48 Hình 3.12 Ảnh hưởng polisaccarit lên khả sống chết tế bào RAW264.7 50 Hình 3.13 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng 51 IL-6 51 Hình 3.14 Ảnh hưởng polisaccarit tinh giải phóng TNF-α 52 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Hình 3.15 Hình ảnh kính hiển vi hàn gắn vết rạch nguyên bào sợi polisaccarit 53 Hình 3.16 Mức độ hàn gắn vết rạch polisaccarit XH nguyên bào sợi 54 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT A490 : Bước sóng 490 A660 : Bước sóng 660 BSA : Bovine Seurum Albumin CY : Cyclophosphamide DPPH : 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl HPLC : High performance liquid chromatography IL-6 : interleukin-6 MTT : [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] OD : Optical Density TCA : trichloroacetic acid TNFα : Tumor necrosis factor-alpha Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh 63.Zhang, Z.F, Lv, G.Y., He, W.Q., Shi, L.G., Pan, H.G and Fan, L F., (2013) Effects of extraction methods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes Carbohydrate Polymers., 98: 1524-1531 66 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Phụ lục Hình Đồ thị chuẩn glucoz theo phương pháp DuBoietal 67 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Phụ lục Hình Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry y = 14.315x + 0.0216 R² = 0.996 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.02 0.04 0.06 68 0.08 0.1 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Phụ lục Hình Đồ thị tương quan mật độ quang học nồng độ DPPH 1.800 1.600 y = 0,3225x + 0,0241 R² = 0,9938 Mật độ quang học (OD) 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 Phụ lục 69 nồng độ DPPH mM Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Cơng trình cơng bố: Nghiên cứu tách chiết polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum Palatiferum (Nees) Radlk Võ Hoài Bắc, Trần Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Thanh Hương, Quách Thị Liên, Lê Văn Trường Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2017 In review NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLISACCARIT TỪ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NEES) RADLK 70 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Võ Hoài Bắc1,2, Trần Thị Vân Anh1,2, Nguyễn Thị Mai Phương1,2, Nguyễn Thị Thanh Hương3,2, Quách Thị Liên1, Lê Văn Trường1,2* Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam Viện Sinh Thái Tài nguyên Sinh Vật, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam “*” Author for correspondence: Le Van Truong, Tel: 84-4-37652880; Fax: 84-4-37560339; E-mail: lvtruong@ibt.ac.vn TÓM TẮT Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuốc sử dụng dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ vết thương, bệnh ung thư thời kỳ phát bệnh, bệnh gan (Trần Công Khánh et al., 1997) Cho đến nay, nhiều nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý chất thứ cấp từ Xuân Hoa như: flavonoids, phytol, palmitic acid, kaempferol, ß-sitosterol, triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid, lignan, triterpene, dipeptide nghiên cứu (Phạm Minh Giang et al., 2005; Hung et al., 2004; Mai et al., 2011) Polisaccarit nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm tác dụng quan trọng chúng tăng cường miễn dịch, kháng viêm, làm lành vết thương… Trong nghiên cứu này, tách chiết, tinh sơ xác định hàm lượng polisaccarit từ Xuân Hoa Hàm lượng polisaccarit Xuân Hoa đạt 8,2 % (± 0,65) trọng lượng khô Các điều kiện chiết rút polisaccarit thích hợp xác định: dung mơi ethanol 25%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1g mẫu khô/10ml), nhiệt độ chiết rút 70°C, thời gian chiết rút 12 Chế phẩm polisaccarit tinh TCA 10%, có độ đạt 77,8% (± 1,19 %) hiệu suất thu nhận chế phẩm polisaccarit đạt 2,3 % (± 0,24) Từ khóa: Cây Xuân Hoa, Pseuderanthemum palatiferum, polisaccarit, tách chiết, tinh MỞ ĐẦU Cây thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ Ơrơ Acanthaceae thuốc định danh Việt Nam từ năm 1980 Lá Xuân Hoa dùng dân gian để chữa nhiều bệnh như: nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ vết thương, bệnh ung thư thời kỳ phát bệnh, bệnh gan (Trần Công Khánh et al., 1997) Cây Xuân hoa P palatiferum quan tâm nghiên cứu sâu rộng lĩnh vực hóa học lẫn dược học năm gần Tuy nhiên, việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý tập trung vào chất thứ cấp như: flavonoids, phytol, palmitic acid, kaempferol, ß-sitosterol, triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid, lignan, triterpene, dipeptide… (Phạm Minh Giang et al., 2005; Hung et al., 2004; Mai et al., 2011) Hiện nay, nhiều polisaccarit khác thực vật tác giả giới chứng minh tác dụng Y học như: kháng viêm, phân hủy fibrin, làm lành vết thương (Fujiwara et al., 1984; Wong et al., 1994; Dourado et al., 2004 ; Chan et al., 2007) Các polisaccarit như: beta-glucans (Vetvicka et al., 2008), pectin (Puhlann et al., 1992; Lim et al., 2003), chất nhày (nhóm galactomannan) (Santander et al., 2011; Hussein et al., 1988) có tác dụng tăng cường miễn dịch, kháng viêm cao Theo Y học cổ truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy dùng phổ biến tạo máu, chống viêm, chữa lành vết 71 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh thương Lá Xuân hoa P palatiferum có độ nhớt cao, nguồn polisaccarit giá trị cho ngun liệu thuốc Tuy nhiên chưa có cơng bố nghiên cứu tách chiết, tinh sạch, đặc tính tác dụng sinh học polisaccarit từ thuốc Xuân hoa P palatiferum Trong nghiên cứu này, xác định điều kiện chiết rút polisaccarit hiệu nhất: dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nguyên liệu dung môi Bước đầu tinh sơ chế phẩm polisaccarit từ thuốc Xuân Hoa P palatiferum Đây thông tin khoa học làm sở cho nghiên cứu sau tinh sạch, đặc tính tác dụng sinh học polisaccarit VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Lá Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk dùng nghiên cứu thu nhận Hà Nội Hóa chất phenol, trichloroacetic acid, ethanol 96o, chloroform, H2SO4 Merck (CHLB Đức), glucose mua hãng Sigma (Mỹ) Phương pháp Thu nhận xử lý nguyên liệu: Lá Xuân Hoa P palatiferum sau thu hái rửa sạch, sấy khô nhiệt độ khoảng 50-60oC, sau xay nhỏ thành bột, bảo quản 4°C cho nghiên cứu Chiết rút polisaccarit Bột khô Xuân Hoa (2g) cho vào bình nón, bổ sung dung mơi (ethanol nước cất) theo tỉ lệ 1:20 (2g nguyên liệu: 40ml dung mơi), ủ 6h nhiệt độ thích hợp bể ổn nhiệt Hỗn dịch làm nguội tới nhiệt độ phịng sau ly tâm với vận tốc 8.000 vịng 30 phút 4oC để lấy dịch Dịch chiết thu sau li tâm xác định hàm lượng polisaccarit theo phương pháp phenol-sunfuric axit (Dubois et al., 1956) Phương pháp định lượng polisaccarit Polisaccarit định lượng phương pháp phenol-sunfuric axit (Dubois et al., 1956) Các bước mơ tả tóm tắt sau: 400µl dịch mẫu chứa polisaccarit cho tác dụng với 200µl dung dịch phenol 5%, cho thêm 1ml H2SO4 đậm đặc để 30 phút nhiệt độ phòng Màu phản ứng phát máy quang phổ bước sóng 490 nm Hàm lượng polisaccarit định lượng dựa số đo OD thu mẫu thí nghiệm đối chiếu với đồ thị chuẩn glucose Tinh sơ polisaccarit phương pháp Servag Polisaccarit tinh sơ phương pháp Sevag (Staub et al., 1965): Dịch chiết Xuân hoa sau chiết rút loại protein dung dịch sevag (1 butanol: chlorofom) theo tỉ lệ 1:1 (1 dịch mẫu: sevag) Hỗn hợp phản ứng voltex nhẹ 20 phút sau để lắng cho pha tách Hỗn hợp tách làm pha, polisaccarit phần lớn tách pha thu lại, tiếp tục cho sevag (lặp lại 3lần) Dịch pha chứa polisaccarit tủa ethanol 96% theo tỉ lệ 1:4 (1 dịch: ethanol) 4oC qua đêm sau ly tâm 12000 vịng 20 phút 4oC để thu tủa sau sấy khơ 60°C, thu chế phẩm polisaccarit sơ tinh Tinh sơ polisaccarit TCA (Stimpel et al., 1984) 72 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Dịch chiết Xuân hoa sau chiết rút bổ sung dung dịch TCA 10%, 20% 40% (tỉ lệ 1:1), voltex, để qua đêm nhiệt độ phòng sau ly tâm 12000 vịng/phút, 20 phút 4oC Dịch sau ly tâm chứa polisaccarit pha thu lại tủa với ethanol 96% theo tỉ lệ 1:4 (1 dịch: ethanol) oC qua đêm, sau ly tâm 12000 vịng 20 phút 4oC Polisaccarit kết tủa thu nhận, sấy khô, thu chế phẩm polisaccarit tinh phần Phân tích độ chế phẩm polisaccarit phổ UV Độ chế phẩm polisaccarit sau tinh phân tích máy đo quang phổ theo phương pháp Jiang cộng (Jiang et al., 2007) Chế phẩm polisaccarit hòa vào nước cất với nồng độ 100 µg/ml sau qt máy UV-vis spectrophotometer (Shimazu, Japan) với bước sóng từ 200 -700nm Phân tích thống kê Phân tích thống kê thể ý nghĩa ± SD phân tích student’s t-test so sánh giá trị trung bình nhóm Sự khác ý nghĩa p< 0.05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết xuất tỷ lệ dung môi mẫu điều kiện quan trọng ảnh hưởng đến hiệu chiết rút polisaccarit (Zhang et al., 2015) Vì chúng tơi xác định ảnh hưởng điệu kiện đến khả chiết rút polisaccarit từ Xuân Hoa P palatiferum Lựa chọn dung mơi thích hợp cho chiết rút polisaccarit từ Xuân Hoa Dựa vào nghiên cứu chiết rút polisaccarit từ thực vật công bố, lựa chọn chiết polisaccarit từ Xuân Hoa với dung môi ethanol nước cất (Zhang et al., 2013; Aoxue et al., 2011) Bột khô Xuân Hoa cho vào bình nón, chiết polisaccarit ethanol với nồng độ 15%, 25%, 35% nước cất điều kiện 60oC 6h Hàm lượng polisaccarit (% tương đối) 120 80 c b 100 d a 60 40 20 Nước cất Ethanol 15% Ethanol 25% Ethanol 35% Hình So sánh hiệu chiết xuất polisaccarit từ Xuân Hoa với dung môi khác 73 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh (60oC 6h, tỷ lệ:1g mẫu/20ml dung môi); p< 0,05: sai khác có ý nghĩa chiết ethanol 25% (c) so sánh với chiết ethanol nồng độ khác (a,b,d) Kết cho thấy dung môi ethanol 25% cho hiệu chiết rút polisaccarit cao so với chiết ethanol 15%, 35% nước cất (hình 1) Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết rút polisaccarit Để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết polisaccarit, ethanol 25% sử dụng làm dung môi để chiết rút polisaccarit nhiệt độ từ 50-90°C Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 70°C-80°C hàm lượng polisaccarit thu cao Khơng có khác biệt có ý nghĩa chiết nhiệt độ 70°C (c) 80°C (d) (hình 2) Do vậy, sử dụng 70°C nhiệt độ thích hợp để chiết rút polisaccarit Điều phù hợp với nghiên cứu sử dụng nhiệt độ cao để chiết rút polisacharit Tuy nhiên, tăng nhiệt độ chiết rút dẫn đến bay dung mơi, chi phí lượng lẫn nhiều tạp chất (Lianfu & Zelong, 2008) Vì thế, nhiệt độ tách tối ưu polisaccarit từ Xuân Hoa P palatiferum khoảng 70°C nhiệt độ phù hợp cho việc sản xuất quy mô lớn, tiết kiệm lượng chi phí chiết rút Hàm lượng polisaccharit (% tương đối) 120 c 100 a b 50 60 d e 80 60 40 20 70 80 90 Nhiệt độ (°C) Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất (ethanol 25%, 60oC 6h, tỷ lệ:1g mẫu/20ml dung môi); p< 0,05 (sự sai khác có ý nghĩa chiết nhiệt độ 70°C (c) so sánh với chiết nhiệt độ khác (a, b, e) Thời gian thích hợp chiết rút polisaccarit 74 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Hàm lượng polisaccarit (% tương đối) 120 b 100 c d e 80 60 a 40 20 3h 6h 9h 12h 15h Thời gian (h) Hình Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit (ethanol 25%, 70oC 6h, tỷ lệ:1g mẫu/20ml dung mơi) p< 0,05: sai khác có ý nghĩa chiết thời gian 12h (d) so sánh với chiết nhiệt độ khác (a, b, c) Để tìm thời gian chiết polisaccarit từ Xuân Hoa đạt kết cao, lựa chọn chiết polisaccarit từ Xuân Hoa P palatiferum với thời gian chiết rút sau: 3h, 6h, 9h, 12h, 15h Chiết polisaccarit ethanol 25% nhiệt độ 70°C (các điều kiện tối ưu trên) Kết hình cho thấy với thời gian trích ly lâu hàm lượng polisaccarit thu tăng lên Ở thời gian chiết rút 12h, hàm lượng polisaccarit đạt 8,2 (± 1,3)% cao so với chiết thời gian 3-9h Tuy nhiên tăng lên 15h chiết rút hàm lượng polisaccarit có tăng khơng đáng kể so với 12h (hình 3) Do chúng tơi chọn 12h thời gian thích hợp để chiết rút polissacarit Tỷ lệ nguyên liệu dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit Với lượng dung mơi trích ly sử dụng nhiều hàm lượng polisaccarit thơ thu tăng Lượng dung mơi trích ly nhiều làm cho q trình trích ly xảy nhanh hơn, mật độ độ nhớt thấp tạo điều kiện giải phóng phân tử polisaccarit nước, lượng polisaccarit hòa tan dịch chiết cao (Chen et al., 2015) Chúng so sánh chiết rút polisaccarit từ Xuân Hoa P palatiferum theo tỷ lệ 1/5; 1/10; 1/20 (g/ml) 75 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Hàm lượng polisaccarit (g/100 g mẫu khô) 10 b c a 1/5 1/10 1/20 Tỷ lệ mẫu (g)/V dung mơi (ml) Hình Tỷ lệ dung mơi thích hợp chiết rút polisaccarit (Ethanol 25%, 70oC 12h, tỷ lệ:1g mẫu/20ml dung môi), p< 0,05 (sự sai khác có ý nghĩa chiết tỷ lệ 1/10 (b) so sánh với chiết tỷ lệ dung mơi 1/5 (a) Kết hình cho thấy tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1/10 thu hàm lượng polisaccarit cao so với tỷ lệ chiết 1/5 Tuy nhiên xử lý thống kê cho thấy hai mức tỷ lệ 1/10 1/20 khơng có khác mức ý nghĩa (p>0,05) Từ kết nghiên cứu trên, đưa điều kiện thích hợp để chiết rút polisaccarit từ Xuân Hoa sau: dung môi ethanol 25%, tỷ lệ ngun liệu dung mơi 1/10, nhiệt độ trích ly 70°C, 12 Với điều kiện chiết rút thích hợp, hàm lượng polisaccarit từ Xuân Hoa P Palatiferum đạt 8,2 (± 0,65) % Tinh polisaccarit Dịch chiết rút theo điều kiện tối ưu tủa ethanol 80% thu chế phẩm polisaccarit Chúng tiến hành loại protein thu polisaccarit phương pháp Sevag (Staub et al., 1965) phương pháp TCA (Stimpel et al.,1984) Bảng So sánh phương pháp loại protein Sevag TCA Phương pháp tinh Chế phẩm polysaccarit tinh thu từ 100 g nguyên liệu khô (g) Hàm lượng polisaccarit (%) Hiệu suất (%) Sevag 1,4 ± 0,09 36,78 ± 0,86 1,4 ± 0,09 5% 2,1 ± 0,16 11,04 ± 0,98 2,1 ± 0,16 10% 2,3 ± 0,24 77,8 ± 1,19 * 2,3 ± 0,24 34,07 ± 1,16 1,35 ± 0,11 TCA 20% 1,35 ± 0,11 Chú thích: : p< 0,05 (sự sai khác hàm lượng polisaccarits có ý nghĩa so với phương pháp tinh lại) 76 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Kết bảng cho thấy sử dụng tinh phương pháp TCA 10% loại protein hiệu nhất, độ tinh chế phẩm polisaccarit đạt cao (77,8 ±1,19 %) hiệu suất thu thu hồi đạt cao (2,3 ± 0,24 %), cao so với phương pháp lại Kiểm tra độ chế phẩm polisaccarit phổ UV Để đánh giá độ chế phẩm polisaccarit chiết từ Xuân Hoa P palatiferum, trình chiết rút, đo quang phổ UV dịch chiết dung dịch polisaccarit sau tinh từ bước sóng 200-700nm Kết cho thấy chế phẩm polisaccarit tinh đạt độ cao đường biểu diễn phổ UV dung dịch đỉnh bước sóng từ 200-220nm thấp bước sóng 260 -280 nm Ngược lại, dịch chiết thơ có nhiều tạp chất nên phổ UV cao bước sóng từ 200- 600nm (hình 5) Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả trước (Cai et al., 2013 Pan et al., 2013) Absorbance 3.5 2.5 1.5 0.5 0 200 Dịch chiết thô 400 Chế phẩm polisaccharit tinh TCA 600 800 Wavenumber (nm) Hình Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polisaccarit chiết từ Xuân Hoa KẾT LUẬN Đây lần polisaccrit từ Xuân Hoa P palatiferum tách chiết tinh sơ Điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit sau: dung môi ethanol 25%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1g/10ml), nhiệt độ chiết rút 70°C, thời gian chiết rút 12 Với điều kiện chiết rút thích hợp, hàm lượng polisaccarit từ Xuân Hoa P Palatiferum đạt 8,2 % (±0,65) Phương pháp tinh polisaccarit từ Xuân Hoa TCA 10% hiệu nhất, sản phẩm có độ 77,8 %( ±1,19), hiệu suất thu hồi chế phẩm polisaccarit tinh đạt 2,3 % ( ± 0,24) Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ IFS (International Foundation for Science, Stockholm, Sweden, through a grant N0 F/5371-1) Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN.02-2015.54" TÀI LIỆU THAM KHẢO Aoxue L and Yijun F (2011) In vitro Antioxidant of a Water-Soluble Polysaccharide from Dendrobium fimhriatum Hook.var.oculatum Hook Int J Mol Sci., 12(6): 4068-4079 77 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Cai W, Xie L, Chen Y, Zhang H (2013) Purification, characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea Carbohyd Polym., 92: 1086–1090 Chan Y, Chang T, Chan CH, Yeh YC, Chen CW, Shieh B (2007) Immunomodulatory effects of Agaricus blazei Murill in Balb/cByJ mice J.Microbiol Immunol Infect., 40: 201-208 Chen C, You LJ, Abbasi AM, Fu X, Liu RH (2015) Optimization for ultrasound extraction of polysaccharides from mulberry fruits with antioxidant and hyperglycemic activity in vitro Carbohydr Polym., 130-122 Dourado F, Madureira P, Carvalho V, Coelho R, Coimbra MA and Vilanova M (2004) Purification, structure and immunobiological activity of an arabinan-rich pectic polysaccharide from the cell walls of Prunus dulcis seeds Carbohydr Res., 339: 2555–2566 Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, et al (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances Anal Chem., 28: 350–356 Fujiwara T, Sugishita E, Takeda T, Ogihara Y, Shimizu M, Nomura T and Tomita Y (1984) Further studies on the structure of polysaccharides from the bark of Melia azadirachta Chem Pharm Bull., 32:1385–1391 Hung NV, Tuan LA, Chien NQ (2004) Study on chemical constituents of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk TC khoa học công nghệ., 42: 75–79 Hussein MM, Helmy WA and Salem HM (1998) Biological activities of some galactomannans and their sulfated derivatives Phytochemistry., 48: 479–484 Jiang H, Chen, X., Kou, X., Wang, C., Cui, H & Jiang, Y (2007) Purification of tea polysaccharide and its physicochemical characteristics Journal of Tea Science., 27: 248–253 Lianfu, Z and Zelong, L (2008) Optimization and comparison of ultrasound/ microwave assisted extraction (UMAE) and ultrasonic assisted extraction (UAE) of lycopene from tomatoes Ultrasonics Sonochemistry., 15(5): 731-737 Lim BO, Lee SH, Park DK, Choue RW (2003) Effect of dietary pectin on the production of immunoglobulins and cytokines by mesenteric lymph node lymphocytes in mouse colitis induced with dextran sulfate sodium Biosci Biotechnol Biochem., 67: 1706-1712 Mai HD, Minh HN, Pham VC, Bui KN, Nguyen VH, Chau VM (2011) Lignans and other constituents from the roots of Vietnamese medicinal plant Pseuderanthemum palatiferum” Planta Med., 77 (9): 951-954 Pan Z, Xin Y, Wei WH, Hai TZ, Jing W, Ren BX, Xing LH, Si Y S and Di Q (2013) Characterization and Bioactivity of Polysaccharides Obtained from Pine Cones of Pinus koraiensis by Graded Ethanol Precipitation Molecules., 18: 9933-9948 Phạm Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn (2005) Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố khảo sát sơ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết giàu flavonoid từ Xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.)., Tạp chí Dược học., 45 (9): 9-12 78 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Puhlann J, knaus U, Tubaro L, Schaefer W, Waguer H (1992) Immunologically active metalic, ioncontanining polysaccharide of Achyrocline satureioides phytochemistry., 31 (8): 2617-2621 Santander S P, Aoki M, Hernandez J F, Pombo M, Moins T H, Mooney N, Fiorentino S (2011) Galactomannan from Caesalpinia spinosa induces phenotypic and functional maturation of human dendritic cells International Immunopharmacology 11: 652–660 Staub AM (1965) Removal of protein—Sevag method Method Carbohydr Chem., 5: 1-5 Stimpel M, Proksch A, Wagner H and Lohmann-Matthes ML (1984) Macrophage activation and induction of macrophage cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the plant Echinacea purpurea Infect Immun., 46: 845–849 Trần Công Khánh, (1997) Sự thật thuốc "kỳ diệu", Xuân Hoa Tạp chí thuốc sức khỏe., 101: 10-11 Vetvicka V, Vashishta A, Saraswat O S, Vetvickova J (2008) Immunological effects of yeast- and mushroom derived beta-glucans J Med Food., 11: 615-622 Wong CK, Leung KN, Fung KP, Choy YM (1994) Immunomodulatory and anti-tumor polysaccharides from medicinal plants J Int Med Res., 22: 229-312 Zhang, Z.F, Lv, G.Y., He, W.Q., Shi, L.G., Pan, H.G and Fan, L F., (2013) Effects of extraction methods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes Carbohydrate Polymers., 98: 1524-1531 Zhang, Z F, Lv G Y, Jiang X, Cheng, J H and Fan, L F (2015) Extraction optimization and biological properties of a polysaccharide isolated from Gleoestereum incarnatum Carbohydrate Polymers., 117: 185-191 OPTIMIZED EXTRACTION OF POLYSACCARIDE FROM PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NESS) RADLK Vo Hoai Bac1,2, Tran Thi Van Anh1, Nguyen Thi Mai Phuong1,2, Quach Thi Lien1, Nguyen Thi Thanh Huong3,2, Le Van Truong1,2* Institute of Biotechnology, Vietnamese Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Graduate University of Science and Technology, Vietnamese Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Institute of Ecology and Biological resource, Vietnamese Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam “*” Author for correspondence: Le Van Truong, Tel: 84-4-37652880; Fax: 84-4-37560339; E-mail: lvtruong@ibt.ac.vn SUMMARY 79 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk is a tree native of Vietnam with various use in traditional medicine It is used to treat many diseases including wound, colitis, stomach-aches, trauma, high blood pressure, nephritis, diarrhoea (Tran Cong Khanh et al, 1997) However, the research on effective constituents from P palatiferum has mainly been focused on small-molecular compounds Some compounds: flavonoids, phytol, palmitic acid, kaempferol, ß-sitosterol, triterponoid saponin, stigmasterol and salicylic acid have been detected in leaves (Phạm Minh Giang et al., 2005; Hung et al, 2004; Mai et al, 2011) Polysaccharide has attracted great attentions for its benefits to human health Polysaccharide from natural sources have diverse anti-inflammatory, anticoagulant and wound healing activities In this study, we extracted, purified and determined the polysaccharide content from the leaves of P palatiferum plant The polysaccharide content in P palatiferum leaves was 8.2% (± 0,65) in dry weight The appropriate polysaccharide extraction conditions were determined: 25% ethanol solvent, material/solvent ratio (1g/10ml), extracted temperature of 70°C, extraction time 12 hours The polysaccharide composition was purified by TCA 10%, with a purity of 77.8% (± 1.19) and a polysaccharide yield of 2.3% (± 0.24) Key Words: Extraction, Pseuderanthemum palatiferum, polysaccharide, purification, Xuan Hoa plant 80 ...VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ VÂN ANH Tinh sạch, nghiên cứu số đặc tính sinh hóa tác dụng sinh học polisaccarit từ Xuân Hoa Pseuderanthemum... ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 6042 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ HOÀI BẮC HÀ NỘI - 2017 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh LỜI CẢM ƠN Trong lời luận văn Thạc. .. Trong khóa luận này, nghiên cứu điều kiện tách chiết, tinh xác định tính chất sinh hóa số tác dụng dược lý (kháng viêm, điều hòa miễn dịch làm lành vết thương polisaccarit từ thuốc này) Các kết nghiên