Luận văn thạc sĩ sinh học phân lập nấm aspergillus flavus và aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http //www lrc tnu edu vn i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***=============[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHẠM NHƢ TRỌNG PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t Mã số: 62 42 40 Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: PGS.TS Phạm Xuân Đà Học viên: Phạm Nhƣ Trọng Hà Nô ̣i - 2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn khóa luận ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Ngƣời viết báo cáo Phạm Nhƣ Trọng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii LỜI CÁM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Khoa Vi sinh - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hướng dẫn PGS.TS Phạm Xuân Đà Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, cố gắng, nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm từ thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình, bạn bè Tôi Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Đà hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới cán Khoa Vi sinh, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Và cuối cùng, xin cám ơn gia đình bạn bè ln sát cánh bên tơi, chia sẻ, tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Ngƣời viết báo cáo Phạm Nhƣ Trọng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC VIẾT TẮT x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung lạc 2.1.1 Cấu tạo lạc 2.1.2 Giá trị công dụng lạc đời sống người 2.2 Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin lạc 2.2.1 Các loại nấm sinh aflatoxin lạc 2.2.2 Đặc điểm hình thái 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng A flavus A parasiticus 2.2.4 Điều kiện sinh độc tố 2.3 Độc tố aflatoxin 2.2.1 Lịch sử phát aflatoxin 2.2.2 Định nghĩa 2.2.3 Cấu tạo tính chất hóa lý aflatoxin 2.2.4 Độc tính aflatoxin 10 2.2.5 Cơ chế tác động aflatoxin thể 11 2.2.6 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 11 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 2.3 Các phương pháp xác định có mặt độc tố aflatoxin 11 2.3.1 Phương pháp hóa sinh 11 2.3.2 Phương pháp vi sinh 11 2.3.3 Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR 12 2.4 Tình hình nghiên cứu độc tố aflatoxin lạc 14 2.4.1 Ngoài nước 14 2.4.2 Trong nước 14 PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Đối tượng 16 3.1.1 Chủng chuẩn nấm Aspergillus mẫu lạc 16 3.1.2 Dụng cụ thiết bị 16 3.1.3 Các mơi trường sử dụng trình nghiên cứu 16 3.1.4 Hóa chất 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc A flavus A parasiticus 17 3.2.2 Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái cấu tạo vi thể 19 3.2.3 Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS 19 3.2.4 Xác định khả sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ 23 PHẦN THỨ TƢ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết phân lập nấm mốc A flavus A parasiticus 26 4.2 Kết định danh nấm mốc dựa vào hình thái cấu tạo vi thể 26 4.4 Kết giải trình tự gen ITS định danh nấm A flavus, A parasiticus 31 4.4.1 Kết tách chiết ADN 31 4.4.2 Kết khuếch đại phản ứng PCR đặc hiệu 32 4.4.3 Kết giải trình tự 33 4.4.4 Kết chụp ảnh hiển vi điện tử quét 36 4.5 Kết phân tích khả sinh độc tố aflatoxin sắc ký khối phổ 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi PHẦN NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 43 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái nấm A flavus A parasiticus Bảng 2.2 Công thức phân tử aflatoxin tính chất Bảng 3.1 Chương trình gradient pha động 24 Bảng 3.2 Điều kiện chạy khối phổ 24 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc cấu tạo vi thể 27 Bảng 4.2 Kết định danh nấm A flavus A parasiticus 31 Bảng 4.3 Kết đo nồng độ ADN sau tách chiết 32 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm ngân hàng gen quốc tế 36 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo chung aflatoxin Hình 2.2 Trình tự đoạn ITS đinh ̣ danh nấ m 12 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy môi trường MEA 29 Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy môi trường MEA 30 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn ITS 33 Hình 4.4 Trình tự từ nu từ 330 đên nu 590 35 Hình 4.5 Trình tự ADN nấm M45 35 Hình 4.6 Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M50 37 Hình 4.7 Sắc đồ chạy sắ c ký khối phổ nấm M45 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC VIẾT TẮT ADN : Axid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid ITS : Internal Transcriped Spacer HPLC : High-performance Liquid Chromatography MEA : Malt Extract Agar PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA TLC : Thin Layer Chromatography YEP : Yeast Extract Peptone Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nấm mốc nguyên nhân hàng đầu gây nên giảm chất lượng phá hủy nông sản sau thu hoạch, nhiều chủng nấm sinh độc tố nấm (mycotoxin) nhiễm vào thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người không may ăn phải, phổ biến chi Aspergillus (A flavus; A parasiticus; …) có khả sinh độc tố aflatoxin, chủng nấm thuộc chi có phổ hoạt động rộng có khả lây nhiễm nhiều loại nơng sản ngô, lạc, bông, đậu tương … Các loại hạt có dầu (đặc biệt lạc) thích hợp cho phát triển nấm Aspergillus hình thành độc tố aflatoxin, loại độc tố không bị phân hủy điều kiện đun nấu thông thường, có khả gây ung thư người sử dụng lâu dài [4] Cây lạc công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Cây lạc chiếm vị trí quan trọng kinh tế giới không gieo trồng diện tích lớn 100 nước, mà cịn lạc nguồn cung cấp lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm chất béo quan trọng cho người, hạt lạc sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất bánh kẹo [11] Tuy nhiên điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện bảo quản lạc kho nhỏ lẻ chưa quan tâm Đó điều kiện thuận lợi cho loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm khơng có biện pháp kiểm sốt nghiêm ngặt Trong năm gần cơng tác vệ sinh an tồn thực phẩm có tiến rõ rệt ngày trọng Từ năm 70 nhà khoa học dựa vào hình thái xây dựng hệ thống phân loại nấm đầy đủ, phương pháp truyền thống dựa kỹ thuật vi sinh hình thái học sợi nấm, chồi túi bào tử [4] Tuy nhiên phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian tiến hành lâu thường đến 10 ngày hệ sợi nấm phát triển đầy đủ Do đó, nhà khoa học phát triển kỹ thuật sinh học phân tử kỹ thuật PCR, giải trình gen… để phát định danh nấm sinh độc tố aflatoxin Và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ dùng để xác định khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm Xuất phát từ thực tế trên, để đảm bảo chất lượng sản phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng tiến hành đề tài " phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc " 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin lạc phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS Từ xác định khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập chủng nấm mốc A flavus; A parasiticus có khả sinh độc tố afatoxin mẫu lạc thu thập từ chợ Hà Nội; - Xây dựng phương pháp định danh nấm mốc sinh độc tố aflatoxin dựa vào hình thái kết hợp giải trình tự gen ITS; - Phân tích khả sinh độc tố afatoxin sắc ký lỏng khối phổ PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu chung lạc 2.1.1 Cấu tạo lạc Lạc gọi đậu phộng hay đậu phụng (tên khoa học Arachis hypogaea L), loài thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc Trung Nam Mỹ Nó lồi thân thảo hàng năm cao từ 3-50 cm Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm Sau thụ phấn, phát triển thành dạng đậu dài 3-7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), (củ) thường dấu xuống đất để phát triển Hạt lạc loại thực phẩm giàu lượng có chứa nhiều lipid Theo bảng thành phần dinh dưỡng chất thực phẩm, hạt lạc có chứa nước 7,5%; protein 27,5%; chất béo 44,5%; glucid 15,5%; cellulose 2,5% lượng nhỏ vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, Folat ), axid amin nguyên tố vi lượng ( K, P, Mg , Mn, Fe, Na, Zn, Cu ) Trong thành phần chất đạm (protein) có globulin arachin (60-70%) albumin conarachin (25-40%) hai chất không tan nước Cả arachin conarachin cho acid amin methionin, tryptophan d-threonin Thành phần chủ yếu nhân lạc dầu lạc Nó gồm glycerid acid béo no không no, với tỷ lệ thay đổi nhiều tuỳ theo loại lạc, acid oleic 51-79%; acid linoleic 7,4-26%, acid palmitic 8,5% acid stearic 4,5- 6,2%, acid hexaconic 0,1-0,4% acid thấy dầu lạc acid arachidic acid lignoceric [11] 2.1.2 Giá trị công dụng lạc đời sống người Lạc cơng nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Cây lạc chiếm vị trí quan trọng kinh tế giới không gieo trồng diện tích lớn 100 nước, mà cịn lạc nguồn cung cấp lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm chất béo quan trọng cho người, hạt lạc sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm nguyên liệu cho công nghiệp Với giá trị dinh dưỡng lạc, người sử dụng nguồn thực phẩm quan trọng Ngoài việc dùng để ăn nhiều hình thức luộc, rang, nấu xôi, làm bánh kẹo, chao dầu… Lạc dùng để ép dầu ăn khô dầu để chế biến nước chấm chế biến mặt hàng khác Sản phẩm phụ lạc thức ăn quý cho động vật nuôi Khi ép dầu sản phẩm phụ khô dầu với lượng dinh dưỡng cao làm thức ăn cho gia súc gia cầm Khi phân tích thân lạc có 47% đường bột, 15% chất hữu chứa nitơ 1,8% chất béo nên thân lạc dùng làm thức ăn cho gia súc Gần nhờ công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta chế biến nhiều mặt hàng thực phẩm có giá trị từ lạc lạc rút dầu, bơ lạc, chao, phomat sữa, sữa lạc…, sử dụng chế biến nhiều loại thuốc y dược, dùng làm dầu nhờn để xoa máy, bỏ trục xe, loại dầu xấu dùng để nấu xà phòng Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cho người tài nguyên cho ngành khác Cây lạc quan trọng hệ thống luân canh trồng đạt hiệu cao có tác dụng cải tạo đất tốt Nhu cầu sử dụng tiêu thụ lạc ngày tăng khuyến khích đầu tư phát triển sản phẩm lạc với quy mô ngày mở rộng quốc gia giới Lạc có nhiều cơng dụng tốt cho sức khỏe, đặc biệt người ăn kiêng mắc bệnh tim mạch [11] Trên thị trường thương mại giới lạc mặt hàng xuất đem lại kim ngạch cao nhiều nước Do giá trị nhiều mặt hạt lạc nên chưa lạc thị trường tiêu thụ Theo số liệu FAO 1999, có 100 nước trồng xuất lạc Ở Senegal, giá trị lạc chiếm 80% giá trị xuất khẩu, Nigieria chiếm 60% giá trị xuất Hiện có nước xuất lạc chủ yếu, là: Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ Việt Nam Các nước phải nhập lạc Nhật Bản , Canada, Philipin, Đức… Ở Việt Nam sản lượng lạc xuất dao động từ 100-130 nghìn tấn/ năm [21] 2.2 Nấm mớc sinh đợc tố aflatoxin lạc 2.2.1 Các loại nấm sinh aflatoxin lạc Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin sản phẩm nông sản (đặc biệt lạc) thuộc chi Aspergillus gồm A flavus A parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ cấu trúc gen hai loài có khả sinh độc tố aflatoxin mạnh Việc xác định loài sinh aflatoxin dựa vào đặc điểm hình thái loại mycotoxin sản sinh dựa vào trình tự ADN (Ito cộng sự, 2000) 2.2.2 Đặc điểm hình thái A flavus A parasiticus thuộc họ nấm cúc có khả sinh độc tố aflatoxin môi trường tự nhiên môi trường ni cấy 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái A flavus A flavus phân bố khắp nơi trái đất: Dưới đất, nông sản thực phẩm đặc biệt lạc sản phẩm từ lạc nơi phát triển ưa thích chúng Con đường xâm nhập A flavus chúng xâm nhập qua điểm tiếp hợp nhờ chỗ côn trùng hủy hoại gây Tuy nhiên lạc tươi A flavus khó xâm nhập mà chúng xâm nhập củ lạc già, sau thu hoạch A flavus xâm nhập vào hạt lạc chứa 15- 30 % nước, tức vào thời gian đầu việc làm khơ [4] A flavus có khả sinh loại độc tố AFB1, AFB2 axid cyclopyazonic (CPA) 2.2.2.2 Đặc điểm hình thái A parasiticus A parasiticus có đặc điểm hình thái tương tự A flavus song bào tử A parasiticus thường có màu xanh lục, có khả sinh loại độc tố AFB1, AFB2 khơng có khả sinh axid cyclopyazonic (CPA) Mặc dù có tương đồng lớn đặc điểm hình thái người ta tìm số khác biệt nhỏ A flavus A parasiticus Sự khác biệt hai chủng tóm tắt bảng đây: Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái nấm A flavus A parasiticus [6,7] Đặc điểm Đại A flavus A parasiticus Đường kính - d = 3-5 cm - d = 2- cm Màu sắc - Ban đầu vàng cuối - Khóm nấm xanh lục, xanh lục vàng lục vàng - Đôi hóa nâu già - Khơng hóa nâu thể già Bông - Lớn, cầu, tỏa tia, - Nhỏ, cầu tỏa tia tạo cột không rõ Vi thể Bọng - Cầu - gần cầu - Hình gần cầu Thể bình - tầng - tầng Vách cuống - Xù xì - Xù xì Hạt đính - Cầu đến gần cầu, trơn Cầu, vách có gai có gai Theo kết nghiên cứu tất loại A flavus có khả sinh độc tố aflatoxin phần lớn chủng A parasiticus phân lập lại sinh tổng hợp aflatoxin Các chủng A flavus tạo thành aflatoxin lạc chiếm 40 - 50 % 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng A flavus A parasiticus  Nhiệt độ: A flavus A parasiticus loại nấm mốc ưa nhiệt sinh trưởng phát triển dải nhiệt độ từ 20 - 60ºC, tºopt = 25 - 35ºC, 12ºC A flavus không phát triển phát triển yếu (Schroeder cộng sự,1996)  Độ ẩm: Độ ẩm tối ưu cho phát triển chúng wopt = 80-85%, A flavus A parasiticus phát triển tốt loại chất có dầu nơng sản: lạc, ngô, gạo, Hàm lượng nước chất thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng từ 15- 30% Ở hàm lượng nước cao thấp ức chế phát triển chúng [4]  Độ pH: A flavus A parasiticus phát triển khoảng pH rộng (pH =2 - 8) tùy thuộc vào loài Nhưng pH tối ưu cho phát triển chúng 4,5 6,5 [4]  Nguồn chất: A flavus A parasiticus có enzyme thủy phân tinh bột, nguồn hydrocacbon thích hợp cho sinh trưởng phát triển loại nấm glucose saccharose [2] A flavus A parasiticus có khả đồng hóa loại muối amoni nitrat Ngồi cịn có khả sử dụng axid glutamic, prolin, trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine, methionine Để đảm bảo cho tồn phát triển, vi nấm đòi hỏi lượng cần thiết nguyên tố đa lượng (P, K,S, Mg, Ca…), nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…) muối MgSO4, KCl, FeSO4, KCl, FeSO4 [2] 2.2.4 Điều kiện sinh độc tố Khả sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Chủng nấm mốc, nhiệt độ thành phần môi trường Lượng aflatoxin sản sinh thay đổi phụ thuộc vào yếu tố Một số chủng sinh aflatoxin bị khả sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp môi trường tổng hợp làm tăng độc tính chúng cấy chuyền liên tiếp mơi trường thích hợp Khi khối lượng hệ sợi nấm nhiều khả sinh độc tố mạnh ngược lại Môi trường bổ sung cao nấm men, peptone acid amin với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH = 5- 5.4, nhiệt độ 25- 28Cº) điều kiện tốt cho tạo thành aflatoxin [4] Ngồi vitamin nhóm B có tác dụng kích thích tạo thành aflatoxin Tuy nhiên, riboflavin piridoxin khơng có tác dụng nhiều Người ta xác định A flavus phát triển hạt lúa mỳ hàm lượng aflatoxin tạo giai đoạn phôi mầm nhiều hẳn giai đoạn phôi nhũ Việc thêm nước chiết từ mầm lúa mỳ, lipid hay axid béo kích thích tốt hình thành aflatoxin Điều khiến người ta nghĩ chất có vai trị quan trọng việc sinh tổng hợp aflatoxin phân hủy chúng tạo thành chất trao đổi tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin [3] 2.3 Đợc tớ aflatoxin 2.2.1 Lịch sử phát aflatoxin Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm nước Anh bị tổn thất nặng nề, lúc đầu 10.000 gà tây chết bệnh gọi '' Turkey X disease" Sau đó, loại gia cầm khác vịt, gà lôi bị nhiễm bệnh chết nhiều Qua điều tra người ta xác định bệnh có liên quan đến loại độc tố nấm có thức ăn sinh Đến năm 1961, người ta tìm chất hóa học chất aflatoxin vi nấm A flavus A parasiticus gây Aflatoxin có dẫn xuất quan trọng AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 AFB1 chiếm nhiều nông sản gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh phổ biến ( Nabil Saad, 2004) Từ trở có nhiều cơng trình nghiên cứu độc tố aflatoxin 2.2.2 Định nghĩa Aflatoxin nhóm hợp chất có nhân difuranocumarin, sản phẩm trình trao đổi chất nấm A flavus, A parasiticus số nấm khác Người ta phát xác định có 17 loại aflatoxin khác nhau, aflatoxin B1 có độc tính mạnh nhất, cịn loại khác sản phẩm chuyển hóa AFB1 gồm AFB2, AFG1, AFG2, AFM1, AFM2…[1,4] 2.2.3 Cấu tạo tính chất hóa lý aflatoxin 2.2.3.1 Cấu tạo aflatoxin Aflatoxin có nhiều loại có cấu trúc khác Các loại dạng biến đổi aflatoxin loại B, G, M Cấu tạo aflatoxin chất trao đổi chất có liên quan đến aflatoxin B1 G1 Aflatoxin B2 G2 dẫn xuất hydro hợp chất mẹ Các aflatoxin M1 M2 chất trao đổi hydroxylat hóa B1, B2 theo thứ tự chúng có cơng thức sau: Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo chung aflatoxin Trong loại aflatoxin aflatoxin B1 tìm thấy nồng độ cao nhất, G1, B2 G2 tồn nồng độ thấp  Aflatoxin B1 B2: Được sinh A flavus A parasiticus  Aflatoxin G1 G2: Được sinh A parasiticus  Aflatoxin M1: chất chuyển hóa aflatoxin B1 người động vật  Aflatoxin M2: chất chuyển hóa aflatoxin B2 sữa bị cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin ( Đậu Ngọc Hào cộng sự, 2003) 2.2.3.2 Tính chất hóa lý aflatoxin Aflatoxin tinh thể màu trắng, aflatoxin có khả phát quang mạnh ánh sáng cực tím (λ= 360 nm) cho phép phát hợp chất nồng độ thấp Từ đó, cung cấp sở lý thuyết cho việc phát định lượng aflatoxin phương pháp hóa lý [1] Bảng 2.2 Công thức phân tử aflatoxin tính chất Aflatoxin Cơng thức Khối lượng phân LD50 (µg/50g trọng Màu huỳnh phân tử tử (g/mol) lượng thể vịt) quang 18,2 Xanh da trời AFB1 C17H12O6 312 AFB2 C17H14O6 314 84,8 Xanh da trời AFG1 C17H12O7 328 39,2 Xanh AFG2 C17H14O7 330 172,5 Xanh AFM1 C17H12O7 328 16,6 Xanh tím AFM2 C17H14O7 330 62,0 Xanh tím Các aflatoxin phát quang mạnh ánh sáng cực tím sóng dài Điều cho phép phát aflatoxin nồng độ thấp ( 0,5 ng hay thấp vết sắc ký mỏng) Từ đó, cung cấp sở lý thuyết cho phép phát định lượng aflatoxin phương pháp hóa lý [4] Các aflatoxin tan tốt dung môi phân cực nhẹ cloroform metanol, đặc biệt dimetylsulfoxit Aflatoxin tan nước dao động khoảng từ 10-20mg/l [2] Các aflatoxin bền nhiệt độ cao không bị phân hủy đun nóng thơng thường mà bị phân hủy hấp 120ºC 30 phút Do tồn lạc mà khơng có có mặt nấm mốc Tuy nhiên để khơng khí đặc biệt tia tử ngoại aflatoxin tương đối khơng bền Các aflatoxin bị phá hủy hoàn toàn việc xử lý mạnh amoniac hypoclorid Sự có mặt vịng lactone phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân mơi trường kiềm Đặc tính quan trọng trình chế biến thực phẩm xử lý kiềm làm giảm nhiễm aflatoxin sản phẩm thực phẩm Tuy nhiên sau trình xử lý kiềm acid hóa làm giảm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin [1] Các aflatoxin bền với enzym tiêu hóa, aflatoxin B1 phân tử mỡ có trọng lượng phân tử thấp dễ dàng hấp thụ sau ăn Sự chuyển hóa aflatoxin B1 đường tiêu hóa nhờ hoạt động tương tác protein niêm mạc ống tiêu hóa tạo sản phẩm AFB1 - epoxie, AFB1- dihydrodiol AFB2α AFB1 sản phẩm chuyển hóa tiết qua ba đường qua mặt, nước tiểu sữa (sản phẩm AFM1) Người ta xác định có tương quan AFB1 ăn vào lượng AFM1 sữa Lượng AFM1 sữa ước tính khoảng 1% lượng AFB1 ăn vào [4] 2.2.4 Độc tính aflatoxin Ngồi việc gây ngộ độc cấp tính độc tố aflatoxin cịn xem nguyên nhân gây xơ gan ung thư Aflatoxin chất gây ung thư gan mạnh Nếu hấp thu lượng 2,5 mg aflatoxin thời gian ngắn (khoảng tháng) dẫn đến ung thư gan sau năm Aflatoxin gây tác hại sau đây: - Phá hủy tế bào gan, thận phận khác - Ức chế hệ miễn dịch - Ăn mòn thành ruột dày - Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết - Gây ung thư gan người gia súc AFB1 chất gây ung thư gan nhóm người Aflatoxin kết hợp với virut viêm gan B làm tăng nguy ung thư gan gấp 12 lần Phơi nhiễm aflatoxin yếu tố gây bệnh còi cọc thiếu cân, suy giảm thần kinh, suy giảm miễn dịch gây tử vong trẻ em Phơi nhiễm aflatoxin gây suy giảm miễn dịch, tương tác với HIV/AIDS bệnh nhiễm trùng khác [3] 10 ... KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC... paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc " 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin lạc phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS Từ xác... khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm Xuất phát từ thực tế trên, để đảm bảo chất lượng sản phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng tiến hành đề tài " phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus