Luận văn thạc sĩ sinh học phân lập và xác định đặc tính enzyme n acyl l homoserine lactone (ahl) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN THỊ THU HÀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Hoàng Hoa Long HÀ NỘI - 2015 MỞ ĐẦU Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Khoai tây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, người Pháp đưa vào Việt Nam từ năm 1890 Có thời kỳ khoai tây xem lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngơ Khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao khoai tây có chứa vitamin, khống chất, caronoids phenol tự nhiên Khoai tây không lương thực mà dược phẩm Một nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát khoai tây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp ăn thường xuyên Trong nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada phát thấy khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Theo thông tin Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Việt Nam quốc gia có khả phát triển mạnh khoai tây, nhiều đồng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ Tây Nguyên, với diện tích ước tính 200.000 Tuy nhiên, diện tích trồng khoai tây đạt 30.000-35.000 ha, với suất 10-11 tấn/ha Một nguyên nhân dẫn đến giảm suất diện tích trồng khoai tây tình trạng gây hại sâu bệnh, đặc biệt bệnh thối nhũn vi khuẩn Erwinia gây ra, phổ biến loài Erwinia carotovora subsp carotovora (Ecc) Bệnh gây chủ yếu loài trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà, họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, số loài hoa lan… Bệnh gây hại cho từ cịn trồng ngồi đồng ruộng thu hoạch bảo quản kho Đặc biệt điều kiện thời tiết nóng ẩm mưa nhiều bệnh trở nên trầm trọng Vi khuẩn Ecc sử dụng Quorum Sensing (QS) chế trao đổi thông tin tế bào phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm soát gen liên quan đến tính độc hoạt động tế bào vi khuẩn Trong chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò chất tự cảm ứng (autoinducer) phân tử tín hiệu tổng hợp tiết suốt trình phát triển vi khuẩn Khi nồng độ phân tử AHLs tăng lên với phát triển quần thể vi khuẩn đạt đến ngưỡng định (quorum level), AHLs gây hiệu ứng kiểu hình thơng qua việc điều hịa biểu gen đích, mà vi khuẩn gây bệnh Ecc gen quy định tính độc chủ Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, biện pháp không mang lại hiệu cao, đặc biệt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản môi trường sống người Do biện pháp phịng trừ sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng tự nhiên ngày đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu tự nhiên tồn nhóm vi khuẩn cư trú bên mô chủ không gây triệu chứng bệnh cho gọi vi khuẩn nội sinh (bacterial endophyte) Trong số chúng, có vi khuẩn có khả phân hủy AHLs qua chế Quorum Quenching (QQ), hoạt động xảy tự nhiên có tác dụng chặn đứng bước quan trọng hệ thống QS hình thành, tích lũy tiếp nhận phân tử tín hiệu Dựa vào cấu trúc phân tử AHLs, nhà khoa học xác định nhóm enzyme phân hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase AHL- oxidoreductase Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase nghiên cứu nhiều Enzyme phát lần từ chủng vi khuẩn Bacillus sp 240B có khả bất hoạt phân tử AHL Gen mã hóa enzyme chuyển vào chủng vi khuẩn gây bệnh E carotovora SCG1 làm giảm đáng kể giải phóng AHL, giảm hoạt động enzyme pectolytic ngoại bào giảm độc tính khoai tây, cà, cải bắp, cà rốt,… Kể từ giới, nhiều vi khuẩn có hoạt tính AHL-lactonase miêu tả Bacillus thuringiensis subsp morisoni, Arthrobacter sp., Microbacterium testaceum Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu chế gây bệnh vi khuẩn thối nhũn sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh (VKNS) đối kháng để phân hủy AHLs vi khuẩn gây bệnh phòng trừ bệnh thối nhũn Do vậy, tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lập xác định đặc tính enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase vi khuẩn nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây” với hy vọng hướng nghiên cứu góp phần đặt viên gạch để thiết lập biện pháp phòng trừ hiệu bệnh thối nhũn khoai tây vi khuẩn Ecc gây Việt Nam Mục đích đề tài Xác định hoạt tính enzyme phân hủy N-acyl-Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vi khuẩn nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây Yêu cầu đề tài - Phân lập xác định khả phân hủy AHLs vi khuẩn nội sinh từ cà dại - Thử nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy VKNS đến hoạt tính enzyme AHL lactonase - Thử nghiệm loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme AHL lactonase - Xác định hoạt tính enzyme AHL lactonase chủng VKNS phân hủy loại AHLs tổng hợp C6, C8 C10 - Thử nghiệm hiệu phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase điều kiện phịng thí nghiệm Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực đề tài giúp tơi có thêm kinh nghiệm, kiến thức kỹ thuật phân lập, xác định khả phân hủy, xác định hoạt tính enzyme phân hủy AHLs từ vi khuẩn nội sinh, đối tượng quan tâm, ngồi cịn cung cấp thêm hiểu biết kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học đại áp dụng - Kết nghiên cứu để tài cung cấp vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu enzyme phân hủy AHLs tiền đề phát triển chiến lược phịng trừ bệnh thối nhũn khoai tây an tồn bền vững sau Ý nghĩa thực tiễn Ngoài ý nghĩa khoa học, vấn đề nghiên cứu đề tài cịn có ý nghĩa thực tiễn Các chủng vi khuẩn có ích mang enzyme phân hủy AHLs sử dụng để ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh thối nhũn nhiều loài trồng có giá trị chuyển gen mã hóa enzyme vào trồng giúp trồng chống chịu với bệnh hại Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc địa lý phân bố khoai tây Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà (Solanaceae) Đây lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Cây khoai tây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 Anh Quốc vào năm 1590 Sau đó, lan truyền khắp châu Âu châu Á (Hawkes, 1994) Sau nhiều kỷ chọn lọc nhân giống, có nghìn lồi khoai tây khác Hơn 99% loài khoai tây trồng toàn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác vùng đất thấp Trung-Nam Chile, giống di dời từ cao nguyên Andes Trên giới, khoai tây coi lương thực có tầm quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước ngô (Steveson cs., 2001) Năm 1890, người Pháp Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem hạt khoai tây trồng thử nước ta Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đơng có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng phát triển Vào năm 1980, Việt Nam trở thành nước sản xuất khoai tây lớn Đông Nam Á với 100.000 diện tích trồng (Batt., 2002) Khoai tây trở thành lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngô Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kê Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), năm gần diện tích trồng khoai tây dao động khoảng 35.000 - 40.000 (Bảng 1.1) Trong 90% diện tích tập trung tỉnh thuộc đồng Bắc Bộ, số miền núi phía Bắc Trung Bộ, 0,5% diện tích cịn lại trồng Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001) Bảng 1.1: Tình hình sản xuất khoai tây Việt Nam giai đoạn 2005-2011 Năm Diện tích (ha) Sản lượng (tấn) 35.000 Năng suất (Tấn/ha) 10,6 2005 2006 37.613 11,1 419.161 2007 38.450 11,4 436.710 2008 41.160 11,8 486.184 2009 37.544 11,7 442.791 2010 37.100 12,0 446.200 2011 40.046 11,2 448.710 370.000 (Nguồn: FAO, 2012) Năng suất khoai tây trước thường đạt tấn/ha, cao 18-20 tấn/ha Từ năm 1981 đến nay, suất bình quân đạt gần 12 tấn/ha, cao đạt 35-40 tấn/ha, có thời điểm khoai tây xuất sang Nga (có năm tới 1.000 tấn) Khi lương thực lúa gạo ngơ dồi khoai tây nghiên cứu theo hướng chất lượng hiệu 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học Khoai tây Khoai tây thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao, khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, chết sau hoa Hoa có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, màu tím, nhụy hoa màu vàng Khoai tây thụ phấn chủ yếu trùng, ong vị vẽ mang phấn hoa từ đến khác Sau khoai tây hoa, số giống cho màu xanh giống màu xanh trái cà chua anh đào, chứa 300 hạt (Wikipedia) 1.1.3 Vai trò Khoai tây Khoai tây nguồn cung cấp lương thực dồi Theo báo cáo Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoai tây toàn Thế giới đến năm 2010 320 triệu tấn, 2/3 thức ăn trực tiếp người, lại thức ăn cho động vật nguyên liệu sản xuất tinh bột Ở Việt Nam, khoai tây nhập vào từ năm 1890 Do có giá trị kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi sản xuất vụ đơng, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, tốn cơng chăm sóc, phù hợp với nhiều loại đất trồng nên khoai tây trở thành trồng xóa đói giảm nghèo cho bà nông dân nhiều địa phương thuộc tỉnh miền Bắc Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái) Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam cung cấp 80% nhu cầu tiêu dùng khoai tây nước, phải nhập gần 100.000 khoai tây hàng năm Khoai tây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có 2% protein bao gồm lysine (một axit amin thường khơng có protein thực vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc Trong protein khoai tây cịn có số axit amin tự chất kiềm purin Giá trị sinh học khoai tây tương đối cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell) Người ta tính khoảng 200g khoai tây nướng vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi chuối), 28% phần sắt hàng ngày, 43% phần vitamin C, 35% phần vitamin B6 nhiều chất khác niacin, thiamin, folat… Việc sử dụng khoai tây làm thực phẩm khuyến khích số nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát hiện, khoai tây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp ăn thường xuyên chữa bệnh “ngủ” Châu Phi Không sử dụng để làm lương thực thực phẩm khoai tây sử dụng y dược Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát thấy khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Còn nhà nghiên cứu Đại học Y Harvard, Mỹ, phát người thường xuyên ăn khoai tây có khả giảm ung thư tuyến tiền liệt 1.2 Bệnh thối nhũn khoai tây 1.2.1 Tác nhân gây bệnh tác hại bệnh Trong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta năm gần nắng nóng, mưa nhiều đan xen nhiều bão liên tục điều kiện thuận lợi cho loài vi khuẩn gây bệnh trồng Bệnh vi khuẩn gây nguy hiểm gây nhiều khó khăn cho cơng tác phòng trừ bảo quản Thời gian ủ bệnh khó phát gây thiệt hại lớn thời kỳ sinh trưởng thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm Đối với khu vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnh thối nhũn khoai tây, cà rốt, hành tây, bắp cải….chủ yếu vi khuẩn Erwinia gây nên Những nghiên cứu trước kết luận vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây có ba lồi: Erwinia carotovora pv carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv atroseptica (Eca) E chrysanthemi (Ech) Trong Ecc lồi chủ yếu gây bệnh thối nhũn củ khoai tây (Jerenial), (Randall cs) Vi khuẩn phổ biến bề mặt, vết thương củ khoai tây sau thu hoạch Ecc gây bệnh vùng khí hậu ơn đới nhiệt đới, có phổ ký chủ rộng Ecc cư trú đất, nước sơng, hồ chí đại dương Vi khuẩn nhân lên tồn vùng rễ nhiều chủ khơng phải chủ nhiều lồi cỏ dại Hai loài Eca Ech tác nhân gây bệnh thối đen 10 (blackleg) khoai tây Tuy nhiên, chúng gây triệu chứng thối nhũn củ Eca gần gây hại khoai tây vùng ôn đới Chúng tồn đất năm, trừ chúng cư trú củ khoai tây bị bệnh phần khoai tây mục nát khác Ngược lại, Ech tác nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật nhiệt đới cận nhiệt đới, ảnh hưởng đến số trồng (ngô, thược dược) vùng ôn đới Nhiễm trùng tiềm ẩn củ khoai tây vi khuẩn gây thối nhũn Erwinia phổ biến bệnh có xu hướng phát triển sức đề kháng chủ bị suy yếu, chúng mô tả tác nhân gây bệnh hội (Pérombelon Kelman, 1987; Perombelon Salimond, 1995; Perombelon, 2002; Prajapat cs., 2003) Vi khuẩn gây bệnh Ecc loài đa thực, ký sinh gây hại nhiều loại trồng khác Tế bào hình gậy, hai đầu trịn, có - lơng roi bao quanh (Hình 1.1) Vi khuẩn khơng có vỏ nhờn, nhuộm Gram âm, hiếu khí, dịch hố gelatin, tạo H2S, thuỷ phân tinh bột khơng tạo NH3 Đặc tính vi khuẩn gây bệnh sản sinh lượng lớn enzyme phân hủy pectin ngoại bào, số enzyme phân hủy thành tế bào thực vật Nuôi cấy môi trường pepton saccaro, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu trắng xám, hình trịn hình bầu dục khơng đều, bề mặt khuẩn lạc ướt (Hình 1.1) Trên mơi trường có TZC khuẩn lạc vi khuẩn có màu đỏ giữa, rìa ngồi màu trắng đặc trưng để nhận biết loài Erwinia sp Vi khuẩn phát triển thuận lợi phạm vi nhiệt độ rộng, nhiệt độ thích hợp 27 – 37oC, nhiệt độ tới hạn chết 50oC; phạm vi pH rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp pH 7,2 Vi khuẩn bị chết điều kiện khơ ánh nắng 11 Hình 1.1 Khuẩn lạc vi vi khuẩn Ecc môi trường YPDA (ảnh a) tế bào vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora kính hiển vi điện tử (ảnh b) (Nguồn: Dong Hwan Lee cs., 2013) Hình 1.2: Bệnh thối nhũn khoai tây (Nguồn Wikipedia) Hiện tượng thối hỏng hậu trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào tác động chủ yếu enzyme phân giải vi khuẩn Triệu chứng bệnh bắt đầu mềm sũng nước, sau vết bệnh chuyển thành nhớt bốc mùi thối khó chịu (Lê Lương Tề Vũ Triệu Mân., 1999) Đây loại bệnh phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng khoai tây trình bảo quản, cất giữ, chuyên chở xuất nhập (Hình 1.2) 12 Vi khuẩn xâm nhập chủ yếu qua vết thương, qua mắt củ Vi khuẩn tồn đất, tàn dư củ khoai tây Bệnh thối nhũn củ khoai tây phát sinh phát triển mạnh điều kiện nhiệt độ độ ẩm cao Mức độ bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, yếu tố nhiệt độ, độ ẩm chất lượng củ giữ vai trò định Mức độ gây hại bệnh nguy hiểm vi khuẩn có khả ký sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rộng bao gồm nhiều loại nhiều họ thực vật khác nhau, trùng đất (Hình 1.3) Hiện chưa có cách phịng trị hiệu quả, thiệt hại vi khuẩn gây lớn Hình 1.3 Các giai đoạn sống chu kỳ gây bệnh vi khuẩn gây bệnh thối nhũn loại rau củ thuộc chi Erwinia, Pectobacterium Dickeya (Allen cs., 2009) Trên giới, bệnh thối nhũn xem nguyên nhân gây thiệt hại đến sản xuất lớn so với bệnh vi khuẩn khác Thiệt hại vi khuẩn thối nhũn sau thu hoạch đánh giá từ 15-30% suất trồng sau thu 13 hoạch (Agror, 2006) Một đánh giá khác Balus cho thiệt hại bệnh thối nhũn củ khoai tây xảy q trình vận chuyển bảo quản, ước tính mát lên đến 40% thiếu phương pháp bảo quản thích hợp (Balus, Dahiru, 2006) Tại số vùng trồng khoai tây Zimbabwe mùa vụ 2009-2010, thiệt hại bệnh thối nhũn gây Erwinia carotovora lên đến 65% (Elizabeth Ngadze, 2012) Trong chương trình kéo dài năm khảo sát bệnh củ khoai tây giống nhập vào Israel từ Bắc Âu Tsror thống kê nhiễm tiềm tàng Eca mức độ 103 tế bào/g vỏ có 30% lơ củ giống hàng năm (Tsror cs, 1993) Cũng khảo sát khác Tsror lô khoai tây nhập từ châu Âu vào Israel cho thấy 7% lô hàng bị nhiễm bệnh blackleg thối nhũn củ khoai tây gây Erwinia spp mức độ mạnh, 65% bị nhiễm mức độ trung bình (Tsror cs., 1999) Tại Keren County, California, Farrar theo dõi 30% khoai tây sau thu hoạch bị công Ecc Tiếp theo, họ thông báo thiệt hại nghiêm trọng gây Ecc cho khoai tây sau thu hoạch San Joaquin Valley (Farrar cs., 2009) Ở Việt Nam, đến chưa có số thống kê cụ thể thiệt hại bệnh thối nhũn khoai tây gây vi khuẩn E carotovora, bệnh thơng báo có mặt tất vùng trồng khoai tây nước Đặc biệt thời gian bảo quản khoai tây nước ta tương đối dài (8-9 tháng), điều kiện thời tiết nóng ẩm khiến cho bệnh mối nguy hiểm nghiêm trọng gây thiệt hại đến suất chất lượng củ khoai tây Khoai tây giống sau tháng bảo quản thường bị hao hụt khoảng 30-50%, chí có nơi hao hụt lên tới 70% tổng số khoai bảo quản Một nguyên nhân gây thiệt hại sâu bệnh nấm mốc, có bệnh thối nhũn (Vũ Quốc Trung, 2005) Một nghiên cứu chi tiết diễn biến bệnh trình bảo quản khoai tây sau 14 thu hoạch cho thấy bệnh xuất với tỷ lệ thấp tháng đến tháng nhiệt độ không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh Trong tháng mùa hè bệnh thối nhũn củ phát triển mạnh nhất, cao bệnh vào tháng 6, 7, Bệnh tiếp tục phát sinh gây hại mức độ bệnh giảm dần điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi (tháng 10 đến tháng 12) (Trần Thị Thúy) Bệnh thối nhũn củ khoai tây đặt danh sách bệnh cần phải kiểm nghiệm củ giống khoai tây theo tiêu chuẩn quốc gia Bộ NN & PTNT Bộ Khoa học Công nghệ ban hành (TCVN 8549-2011) 1.2.2 Quorum sensing (QS) mối liên quan đến khả gây bệnh thối nhũn khoai tây tác nhân gây bệnh Vi khuẩn Gram âm (trong có Erwinia) sử dụng dạng “giao tiếp vi khuẩn” gọi Quorum Sensing (QS) QS dựa sở tổng hợp, giải phóng, phát phản ứng với phân tử tín hiệu AHLs tế bào vi khuẩn liền kề Khi mật độ tế bào vi khuẩn tăng lên, phân tử tích lũy mơi trường ngoại bào thơng qua giúp vi khuẩn kiểm sốt số lượng tế bào diện loài vi khuẩn khác Những phân tử đạt đến ngưỡng định kích hoạt tín hiệu bên vi khuẩn cực đại hóa hoạt động số gen đặc hiệu Điều hịa biểu gen thơng qua chế QS có tham gia gen luxR luxI mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR AHL synthase (LuxI) Phân tử tín hiệu AHL đóng vài trị chất tự cảm ứng (autoinducer) kiểm sốt q trình tổng hợp thân phân tử AHLs thơng qua vịng điều khiển gen sinh tổng hợp AHL synthase Hầu hết vi khuẩn gây bệnh sử dụng hệ QS nghiên cứu cho thấy QS có liên quan đến gen gây bệnh (Hình 1.4) (Coutteau Goossens, 2013; Dong cs., 2000; Whitehead cs., 2001) 15 Hình 1.4 Cơ chế Quorum Sensing vi khuẩn Gram âm (r: gen mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR (R); i: gen mã hóa cho AHL synthase LuxI (I) Ở lồi vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Erwinia có tồn hai hệ thống QS xác định chất tín hiệu hóa học liên quan: Nacyl homoserine lactones (AHLs; cịn gọi tín hiệu AI-1), tổng hợp nhóm protein LuxI; tín hiệu AI-2, tổng hợp nhóm protein tương đồng LuxS Hệ thống QS số lồi Erwinia đóng vai trò quan trọng điều hòa biểu gen, tổng hợp chất trao đổi thứ cấp khả gây bệnh chủ Nghiên cứu chúng tơi tập trung vào khả sản sinh phân tử tín hiệu AHLs lồi vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora có liên quan đến khả gây bệnh thối nhũn khoai tây (Barnard Salmond, 2006; Engebrecht cs., 1983; Nasser cs., 1998; Schaefer cs., 1996) 16 N-acyl homoserine lactone (AHL) Hình 1.5 Cấu trúc phân tử N-acyl homoserine lactones (Barnard Salmond, 2006) Phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactones (AHLs) đặc trưng vòng homoserine lactone bất biến gắn với chuỗi bên N-acyl Các phân tử tín hiệu AHLs khác cấu trúc chuỗi bên N-acyl thay đổi (Hình 1.5) Mỗi tế bào quần thể vi khuẩn có khả sản sinh tín hiệu QS, cho biết diện chúng với tế bào khác quần thể AHLs tạo từ phản ứng enzyme hóa, xúc tác LuxI autoinducer synthase LuxI tổng hợp N-AHLs: N-(3-oxohexanoyl)-Lhomoserine lactone (3-oxo-C6-HSL), sử dụng S-adenosyl methionine protein mang nhóm hexanoyl acyl làm chất cho phản ứng Các đồng phân LuxI khác xúc tác cho phản ứng tương tự để tạo AHLs cần thiết như: N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-hexanoylL-homoserine lactone (C6-HSL)… (Toth cs., 2003; Val Cronan, 1998) 17 Bảng 1.2: Hệ thống QS sử dụng phân tử tín hiệu N-AHLs số loài Erwinia (Barnard Salmond, 2006) Chủng vi khuẩn Erwinia nhóm Ecc EC153 Tín hiệu QS Đồng phân LuxI Đồng phân LuxR Tác động QS 3-oxo-C8-HSL 3-oxo-C6-HSL 3-oxo-C8-HSL 3-oxo-C6-HSL AhlI ExpR AhlI ExpR1(ExpR)*, Gây bệnh, tổng ExpR2 hợp enzyme ngoại bào Erwinia nhóm Ecc ATCC39048 3-oxo-C6-HSL CarI CarR, EccR(ExpR)*, VirR Ecc SCRI193 3-oxo-C6-HSL Ecc 71 3-oxo-C6-HSL Eca SCRI1043 3-oxo-C6-HSL Ecc SCC3193 Tổng hợp enzyme ngoại bào Tổng hợp kháng sinh, gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào AhlI ExpR, VirR, Gây bệnh, tổng [CarR hợp enzyme ngoại (cryptic)] bào AhlI ExpR1(ExpR)*, Gây bệnh, tổng (HslI)* ExpR2 hợp enzyme ngoại bào ExpI ExpR, VirR Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào Erwinia amylovora OMP-BO 1077/7 3-oxo-C6-HSL EamI Erwinia chrysanthemi 3937 3-oxo-C6-HSL, ExpI C6-HSL, C10-HSL *Danh pháp thay 18 EamR ExpR Tổng hợp enzyme pectinase Theo bảng 1.2 hầu hết lồi thuộc chi Erwinia có mối quan hệ mật thiết khả sản sinh phân tử tín hiệu AHLs khả gây bệnh chủ Đây sở để chúng tơi tiến hành nghiên cứu 1.2.3 Các biện pháp phòng trừ bệnh Bệnh thối nhũn củ khoai tây vi khuẩn Ecc gây chủ yếu lây qua củ giống sẵn sàng lan rộng củ nhiễm tiềm tàng Bên cạnh vi khuẩn lây qua khơng khí, trùng, động vật (côn trùng, chuột, ) dụng cụ lao động Nhiều phương pháp phòng trừ tổng hợp mức độ thành công khác (Czajkowski cs., 2011) Phương pháp tránh lây nhiễm cấp chứng củ giống: Đây xem phương pháp sử dụng rộng rãi có thành công định Sử dụng nguồn củ giống khỏe, cấp chứng bệnh Trong trình canh tác, dụng cụ phải rửa Loại bỏ củ thối đồng ruộng thu hoạch Tránh làm xây sát củ Trước bảo quản không đổ khoai tây thành đống củ, cần phải giàn thành lớp, hong nhẹ ánh sáng tán xạ để giảm bớt lượng nước, vỏ củ khô dần chuyển thành màu xanh Khoai tây phải bảo quản điều kiện thơng gió, tốt phịng lạnh để làm giảm nguồn nhiễm tránh bệnh lây lan Chế độ dinh dưỡng ảnh hưởng lên tính chống chịu bệnh Dinh dưỡng ảnh hưởng đến phát triển cây, tương tác trồng với tác nhân gây bệnh với vi sinh vật khác Canxi đóng vai trị quan trọng định đến tính chống chịu bệnh ion canxi cải thiện cấu trúc độ cứng thành tế bào thực vật Đất tự nhiên thiếu canxi bổ sung CaSO4 (gypsum) khơng làm tăng tính chống chịu với bệnh thối đen (blackleg) mà với bệnh thối nhũn củ khoai tây Tuy nhiên chế độ dinh dưỡng cân với việc tăng hàm lượng Ca 19 đất không đủ để ngăn chặn bệnh mà cần phải kết hợp với nhiều biện pháp khác phương pháp phòng trừ tổng hợp Biện pháp chọn tạo giống: Chọn tạo giống phương pháp truyền thống xem biện pháp khả thi Trong tự nhiên khơng có giống khoai tây mang tính chống chịu với bệnh thối đen thối nhũn có số giống chống chịu cục bộ, với đa dạng di truyền nguyên liệu chọn giống bố mẹ sử dụng, Trong việc tạo trồng biến đổi gen lại xem phương pháp hứa hẹn để thay cho phương pháp truyền thống Tuy có nhiều nghiên cứu khả thi thực tế chưa có dịng khoai tây chuyển gen thương mại hóa Mọi nghiên cứu dừng quy mơ nhà lưới, nhà kính nhằm kiểm tra tiến trình đánh giá nguy hiểm tiềm đến môi trường chuyển gen Sử dụng biện pháp lý học (xử lý nước nóng): Biện pháp áp dụng trước bảo quản củ khoai tây Đây xem biện pháp thân thiện với mơi trường Biện pháp giúp loại trừ vi khuẩn gây bệnh thối nhũn với số vi khuẩn gây bệnh bề mặt củ khác Tuy nhiện hạn chế khơng diệt vi khuẩn nằm sâu bên củ mà không làm tổn thương củ, giá thành đắt không áp dụng quy mơ lớn Biện pháp hóa học: Biện pháp nhằm loại bỏ tận gốc tác nhân gây bệnh tạo môi trường không thuận lợi cho bệnh phát triển Một bệnh phát triển, phịng trừ bệnh gặp khó khăn nhân nhanh lây lan vi khuẩn, chất hóa học khó xâm nhập vào bên mơ củ Tuy nhiên, biện pháp khơng kiểm sốt chặt chẽ gây hại đến môi trường, sức khỏe người tạo tính kháng thuốc tác nhân gây bệnh Biện pháp sinh học: Biện pháp thay biện pháp hóa học, lý học chọn tạo giống chống chịu tương lai Đã có nhiều nghiên cứu thực nhằm sàng lọc phát vi sinh vật có khả ức chế 20 ... ti? ?n hành ch? ?n nghi? ?n cứu đề tài ? ?Ph? ?n l? ??p xác định đặc tính enzyme N- acyl- L- homoserine lactone (AHL) lactonase vi khu? ?n nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nh? ?n củ khoai tây? ?? với hy vọng hướng... VÀ ĐÀO TẠO VI? ? ?N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ? ?N SINH THÁI VÀ TÀI NGUY? ?N SINH VẬT *** PH? ?N L? ??P VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N- ACYL- L- HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHU? ?N NỘI... N- acyl- Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vi khu? ?n nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nh? ?n củ khoai tây Yêu cầu đề tài - Ph? ?n l? ??p xác định khả ph? ?n hủy AHLs vi khu? ?n nội sinh từ cà dại - Thử nghiệm