ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn TS Ngu[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực MSSV: 1211100227 : Trịnh Thị Cẩm Tú Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu , kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thơng tin trích dẫn Đồ án rõ nguồn gốc Học viên thực đồ án Trịnh Thị Cẩm Tú i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hồn thành tốt khóa học 2012 – 2016 Em xin cảm ơn thầy Khoa CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG tận tình dạy truyền đạt cho em kiến thức quan trọng tạo tảng kiến thức vững để hoàn thành tốt Đồ án sau ứng dụng vào công việc thực tiễn Em xin cảm ơn thầy phụ trách phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Và em gửi lời cảm ơn đến bạn khóa tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần , trải qua khó khăn suốt trình thực Đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình ln bên cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo điều kiện để hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp TP HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thục Trịnh Thị Cẩm Tú ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại hạt 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại hạt ngũ cốc 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch 1.1.4 Độc tố nấm 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản 11 1.2.1 Kháng nấm phương pháp hóa học 11 1.2.2 Kháng nấm phương pháp sinh học: 12 1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả đối kháng nấm gây bệnh nơng sản 15 1.3.1 Nấm Trichoderma spp 15 1.3.2 Lactobacillus spp 17 1.3.3 Bacillus subtilis spp 19 1.4 Cơ chế kháng nấm vi khuẩn 21 1.4.1 Cấu tạo thành tế bào số nấm gây hại nông sản 21 1.4.2 Cơ chế tác động số enzyme ngoại bào 23 1.4.3 Cơ chế kháng nấm số hợp chất 25 1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn 26 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao bảo quản hạt 30 1.6 Một số nghiên cứu nước ứng dụng hợp chất thứ cấp Bacillus spp 31 1.7 Một số nghiên cứu nước ứng dụng hợp chất thứ cấp Bacillus spp 32 iii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 33 2.2.1 Vật liệu 33 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 33 2.2.3 Mơi trường - Hóa chất 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Mục đích 35 2.3.2 Mục tiêu 35 2.3.3 Nội dung 35 2.4 Bố trí thí nghiêm phương pháp 36 2.4.1 Khảo sát khả đối kháng nấm 36 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp CS1b 50 3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả đối kháng nấm CĐP1 cực đại 51 3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm 51 3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt 53 3.2.3 So sánh khả đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 dịch nuôi cấy CS1b thời gian nuôi cấy điều kiện xử lý nhiệt 53 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm 55 3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học 55 3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 𝜷- glucanase protein kết tủa 56 3.3.3Khảo sát khả đối protein kết tủa với CĐb1 59 3.4 Khảo sát khả đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1 60 3.4.1 Quá trình thu cao EA 60 iv Đồ án tốt nghiệp 3.4.2 Khảo sát ức chế cao EA với nấm CĐP1 61 3.5 Khảo sát thành phần hóa học sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Bacillus sp CS1b có hoat tính kháng nấm 64 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1 Kết luận 76 4.2 Kiến nghị 76 TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC 78 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 78 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar EA: ethyl acetate NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MT: Môi trường PDA: Potato dextrose agar HPLC: High pressure liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography UV: Ultraviolet VK: vi khuẩn vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ảnh hưởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật nuôi Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin đường sinh học 13 Bảng 1.3: Các thành phần thành tế bào số nấm 22 Bảng 1.4: Cơ chế tác động mộ số hợp chất thứ cấp 26 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng 47 Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1 53 Bảng 3.2: Đường kính phân giải enzyme protein kết tủa ethanol .56 Bảng 3.3: Khả đối kháng với CĐP1 protein kết tủa ethanol 58 Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo nồng độ cao ethyl acetate với nấm CĐP1……………………………………………………………………………….63 Bảng 3.5: Định tính số chất có dịch sau ly tâm, protein kết tủa cao ethyl acetate 63 Bảng 3.6: Khả ức chế nấm mốc vi khuẩn phát triển hạt đậu phộng bao màng chitosan sản phẩm trao đổi chất CS1b 66 Bảng 3.7:Kết ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng……………… 71 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả kháng nấm CĐP1 dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm 36 Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1 37 Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa ethanol 960 40 Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA 42 Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng màng bao chitosan 46 Hình 3.1: Nấm CĐP1 môi trường PDB 49 Hình 3.2: Kết đối kháng dịch sau ly tâm VK CS1b với nấm CĐP1 .51 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả đối kháng nấm CĐP1 dịch nuôi cấy CS1b thời gian nuôi cấy điều kiện xử lý dịch sau ly tâm 54 Hình 3.4: Khả phân giải chitin protein kết tủa 56 Hình 3.5: Khả phân giải casein protein kết tủa .57 Hình 3.6 Khả phân giải 𝛽 − 𝑔𝑢𝑐𝑎𝑛 protein kết tủa…………………… 57 Hình 3.7: Khả ức chế nấm mốc CĐP1 dung dịch protein kết tủa……… 59 Hình 3.8: Khả đối kháng nấm CĐP1 cao EA…………………………….61 Hình 3.9: : Khả đối kháng nấm CĐP1 cao EA, 62 Hình 3.10: Định tính số chất có dịch nuôi cấy ly tâm (i), protein kết tủa (ii),……………………………………………………… .64 Hình 3.11: Định tính lipid .65 Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1………………………………… 72 Hình 3.13: Quy trình cơng nghệ sản xuất cao EA………………………………….73 viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lương thực, thực phẩm đặc biệt nơng sản thóc, gạo, ngơ, khoai, sắn, đậu, đỗ lạc nguồn lượng ni sống lồi người Vì thế, việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản vấn đề tổ chức quốc tế quan khoa học lương thực, thực phẩm giới đặc biệt quan tâm Việc nâng cao chất lượng nơng sản bao gồm kỹ thuật bảo quản gìn giữ giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn chất độc hại nhiễm nơng sản đó, đồng thời chế biến nơng sản thành thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phần cần thiết ngành nông nghiệp nước ta Độc tố aflatoxin chủ yếu loài vi nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus tạo ra, độc tố nguy hiểm thường nhiễm nông sản, gây độc cho người gia súc, gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao dẫn tới tử vong Trong nhiều loại aflatoxin tự nhiên aflatoxin B1 coi chất độc nguy hiểm Mặc dù diện Aspergillus flavus lúc gắn liền với việc tồn aflatoxin với hàm lượng gây độc, thể nguy lớn việc nhiễm aflatoxin Ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm khơng khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa, phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo, thoáng mát điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc cho thực phẩm thức ăn chăn nuôi Khi phát triển lương thực nấm mốc sử dụng chất dinh dưỡng gây tổn thất lượng chất hạt Khơng thế, số lồi nấm mốc phát triển sinh loại độc tố khác gọi chung mycotoxin Đồ án tốt nghiệp Nguy hiểm độc tố có khả theo thức ăn vào thể, gây độc cho người động vật, gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao dẫn tới tử vong Việc sử dụng biện pháp phòng trừ độc tố nấm mốc khuyến cáo sử dụng Tuy nhiên, nhiễm nấm mốc độc tố nấm mốc nói chung nhiễm aflatoxin nông sản mức độ cao giới hạn cho phép khơng thể tránh Chính cần phải có biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc độc tính nguy gây ung thư Bảo quản nơng sản áp dụng chất chống mốc hóa học có giá thành cao,thường có mùi khó chịu cho nơng sản bị xử lý ảnh hưởng xấu lên sức khỏe người tiêu dùng Để áp dụng “ bảo quản sinh học” việc bảo quản hạt nông sản, sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường áp dụng Đó lý chúng tơi chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin Bacillus spp (CS1b) ứng dụng bảo quản nông sản” Mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu Khảo sát khả đối kháng nấm sinh aflatoxin sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp CS1b ứng dụng việc bảo quản hạt đậu phộng 2.2 Nội dung Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp CS1b Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp CS1b để khả đối kháng nấm CĐP1 dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 cực đại Khảo sát khả đối kháng nấm protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả đối kháng nấm cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm Khảo sát thành phần hóa học sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Bacillus sp CS1b có hoạt tính kháng nấm Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn việc bảo vệ hạt đậu phộng Kết cấu đồ án Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung đề cập đến nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến dụng cụ, thiết bị phương pháp nghiên cứu đồ án Chương 3: Kết thảo luận – nội dung chương đưa kết mà đề tài thực đưa thảo luận, biện chứng cho kết thu Chương 4: Kết luận kiến nghị - nội dung chương tóm lại kết mà đề tài đạt đề nghị cho hướng cần cải thiện thêm đề tài Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại hạt 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại hạt ngũ cốc Thế giới Sự nhiễm nấm mốc nơng sản trở thành vấn đề tồn cầu Ví dụ: Ở Đức có 84% 1000 mẫu nơng sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13 % số mẫu lương thực lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin Ở Đan Mạch 19 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin Ở Ấn Độ có % số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời hai loại độc tố T-2 ochratoxin Ở Mỹ có nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy nhiễm vomitoxin ( DON) mức 1000 ppb Ở Úc kiểm tra bắp thấy có loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin zearalenon Theo Tiến sĩ Bangalore ( Ấn Độ) loại mycotoxin khác có ưu vùng khác giới: Ở Bắc Âu có ochratoxin vomitoxin ( DON) vấn đề quan tâm Cịn Nam Mỹ mycotoxin có ưu lại aflatoxin fumonisin Việt Nam Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bọng thủ cơng, độ ẩm cịn cao, sau xếp thành chồng Giữa lớp bánh dầu có độ ẩm cao mơi tường thích hợp cho nấm phát triển Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm khơng khí có nhiều bào tử nấm công nhanh nguyên liệu sinh nhiều độc tố thức ăn Nấm sinh kho dự trữ phổ biến Aspergillus Penicillium Độc tố chúng sinh chủ yếu aflatoxin, sau ochratoxin, rubratoxin citrinin Nó gây tổn hại nặng động vật, làm hư gan, thận, tạo màng bọc ống tiêu hóa tế bào niêm mạc bị chết bong giảm hấp thu dưỡng chất, gây tử vong số lớn gia cầm heo Đồ án tốt nghiệp Riêng trại gà giống độc tố nấm gây chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm thấp Theo kết kiểm tra 29 mẫu bánh dầu đậu phộng 25 mẫu bắp mức aflatoxin bánh dầu phộng 1200 ppb ( tối đa 5000 ppb), bắp 205 ppb ( tối đa 600 ppb) Các nguyên liệu lại đậu nành hạt khơ bánh đầu cơng nghiệp nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50 ppb 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch Trong lương thực phát triển đồng hay sau thu hoạch trước hạt đập tuốt bị nấm mốc xâm nhập Tùy loại ngũ cốc, vùng địa lý, thời tiết mà nấm mốc phát triển nhiều hay Các loại lúa mì, lúa gạo, đại mạch, kiều mạch, ngơ thường nhiễm loại nấm đồng Alternaria, Cladosporium, Helininthosporium Furarium Tất nấm ngồi đồng địi hỏi độ ẩm cao hạt để phát triển Độ ẩm trạng thái cân với độ ẩm tương đối 90% hay điều kiện cho nấm phát triển Các nấm mốc ngồi đồng sống qua nhiều năm hạt khô, chết tương đối nhanh hạt có độ ẩm trạng thái cân với độ ẩm tương đối 70%, hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều có nghĩa độ ẩm 14% Tóm lại, nấm mốc ngồi đồng ảnh hưởng đến bề ngồi chất lượng hạt Thông thường, tổn thất gây nên nấm mốc đồng xảy trước thu hoạch phát phương pháp giám định thơng thường khơng tiếp tục tăng lên q trình bảo quản 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch Theo Christensen [1] nấm mốc bảo quản gồm mười hai lồi Aspergillus, có năm lồi phổ biến Một số loài Penicillium, loài riêng lẻ Sporendonema số lồi nấm men có giai đoạn Những lồi có khả phát triển hạt lương thực có độ ẩm cân với độ ẩm tương đối 70% - 90% Đa Đồ án tốt nghiệp số nấm thường nguyên liệu giàu chất hữu vô cơ, đặc biệt rau thối rữa, sản phẩm thực phẩm Chúng xuất khắp nơi giới nhiễm tất hạt lương thực hạt giống Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh hạt khoảng 300C - 320C tốc độ phát triển chúng giảm nhiệt độ giảm Một vài chủng nhóm A.glaucus phát triển chậm nhiệt độ 100C – 150C Một vài lồi Aspergillus đề kháng với khơ cạn, phát triển vài độ điểm đóng băng 1.1.4 Độc tố nấm Một số loại độc tố nấm Độc tố nấm gọi mycototoxin nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, tạo trao đổi chất thứ cấp nấm mốc gây ngộ độc với động vật có vú, cá, gia cầm Sự sinh trưởng phát triển phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái ( Morrau 1974) [2] Những điều kiện vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm khơng khí, lượng nước có chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc kết tác động qua lại kiểu gen ( genotype) điều kiện phát triển chúng ( Scheoedes Ashworth) Độc tố nấm sản phẩm phụ tiết trình chuyển hóa Cho đến nay, 300 loại độc tố nấm phát nghiên cứu Một loại độc tố nhiều lồi nấm khác sản sinh loại nấm đồng thời sản sinh nhiều loại độc tố Điều đáng ý có 20 loại mycotoxin có thực phẩm mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm tạo năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria, Claviceps ❖ Các độc tố Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, acid cyclopianzoic Đồ án tốt nghiệp ❖ Các độc tố Penicillium: patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin, moniliformin ❖ Các độc tố Furarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin ❖ Các độc tố Alternaria: acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion ❖ Các độc tố Claviceps: alkaloid Ergot.[1] Những số liệu có giá trị mycotoxin bệnh mycotoxin thu nhận từ lĩnh vực thú y học Các nghiên cứu độc vật thực nghiệm cho thấy độc tính mycotoxin lớn Hầu hết sản phẩm thực vật chất cho phát triển nấm mốc tạo mycotoxin Vì tạo khả khơng cho nhiễm trực tiếp mà nguồn mang mycotoxin vào nguồn sữa, thịt Độc tố Aflatoxin: Cơ chế gây độc Aflatoxin Aflatoxin có khả liên kết với DNA nhân tế bào Sự liên kết gây ức chế enzym polymerase RNA Nó gây tác dụng hạn chế tổng hợp RNA ức chế polymerase t-RNA Đây nguyên nhân gây hạn chế tổng hợp protein tế bào Người ta chứng minh vòng α, β -lacton khơng bão hịa có phân tử aflatoxin làm cho hợp chất có hoạt tính gây ung thư vịng lacton gây ức chế tổng hợp DNA nhân tế bào, làm rối loạn tăng trưởng bình thường tế bào Để gây độc với tế bào gan tạo khối u, aflatoxin phải trải qua trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) gan, hợp chất nguyên nhân gây hủy hoại gan nhanh Nhóm Đồ án tốt nghiệp dialdehyd phản ứng với nhóm amin protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA gây nhiễm độc cấp tính Độc tính Aflatoxin Theo Dương Thanh Liêm (2002) [1], aflatoxin gây tác hại lớn cho thể người động vật Những tác hại sau: Gây tổn thương tế bào gan: tất trường hợp xác nhận ngộ độc aflatoxin có bệnh tích giống gan động vật bị nhiễm hư hại nặng Tùy theo mức độ nhiễm hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích gan có khác Biểu chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng Sau gan sưng to lên, mật căng phồng bắt đầu mụt nhỏ bề mặt gan làm cho gồ ghề đơi có nốt hoại tử màu trắng Sau nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể Thận bị sưng to làm cho việc thải chất độc khỏi thể trở nên khó khăn Từ làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả tiêu hóa chất dinh dưỡng thức ăn Đôi thấy tổn thương miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn Làm giảm khả đề kháng động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể Do nhiễm aflatoxin thể mẫn cảm với bệnh thơng thường, gây tử vong cho thú Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản Làm giảm thèm ăn thức ăn phát triển nấm mốc làm mùi thức ăn Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển Làm giảm thấp sinh trưởng giá trị kinh tế vật nuôi Hậu cuối gây chết cho vật ni Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Ảnh hưởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật ni (Allcroff, 1969 trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc, 2003) [2] Loại gia súc Lượng Thời kỳ nuôi Tổn thương Ảnh hưởng tới aflatoxin dưỡng (tuần) gan phát triển thức ăn hàng hiệu thức ngày (mg/kg) ăn Lợn 0.14 12 Trung bình Bình thường (20 – 70 kg) 0.28 12 Nhẹ Giảm sút 0.41 12 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.28 20 Nhẹ Giảm sút (40 – 100 kg) 0.41 20 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.69 Trung bình Bình thường Lợn nái 0.3 Rõ Suy giảm (có chửa) 0.55 (70 – 100 kg) số chết Gà tây 0.25 Rõ (1 ngày tuổi) Chậm phát triển giảm trọng lượng Gà tây 0.2 Nhẹ Giảm trọng (1 ngày tuổi) 0.42 Nhẹ lượng 0.5 Nặng tuần 0.03 Đặc điểm điển Giảm trọng hình nhiễm lượng, chết aflatoxin 50% Trung bình Giảm trọng Vịt (7 ngày tuổi) Bê 0.2 16 Đồ án tốt nghiệp lượng từ – (4 ngày tuổi) tháng Bị sữa 15 Trung bình Giảm lượng sữa Aflatoxin M1 có mặt sữa Tình hình nhiễm độc Aflatoxin: Aflatoxin có mặt nhiều sản phẩm nơng nghiệp, đặc biệt loại hạt có dầu lạc, đậu tương ngơ (Blaney, 1985 trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) [2] Ở vùng Đông Nam Á Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin sản phẩm nông nghiệp đáng kể Nhiễm aflatoxin điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập sâu mọt bảo quản tạo điều kiện thuận lợi cho lây lan phát triển nhanh chóng Aspergillus flavus Trong điều kiện thuận lợi, Asp Flavus tăng nhanh sau – ngày bảo quản Nhiễm độc aflatoxin lợn vấn đề quan trọng, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu Smith (1976) số 94 trường hợp phát aflatoxin có thức ăn chăn ni có đến 83 trường hợp gây ngộ độc lợn, trường hợp bò trường hợp gia cầm Hàm lượng aflatoxin trung bình có thức ăn chăn ni 389 ppb ngô nguyên liệu làm thức ăn 518 ppb (Trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2] Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét Ginting (1985) Widiastut (1988), ngô thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb Ở Úc, theo Barry J Balaney, 161 mẫu thức ăn cho gia cầm phân tích có 13 mẫu 10 Đồ án tốt nghiệp chứa aflatoxin, có mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến 50 ppb (Trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2] 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nơng sản 1.2.1 Kháng nấm phương pháp hóa học Tình trạng sử dụng thuốc diệt nấm hóa học tác hại Hiện sử dụng thuốc Bảo vệ thực vật nói chung thuốc trừ nấm bệnh hại trồng nói riêng, phần lớn bà làm theo cảm tính, cẩu thả, khơng khoa học, việc bà nông dân sử dụng không hợp lý chí lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật sản xuất nông nghiệp gây hậu nghiêm trọng Thuốc diệt nấm gián tiếp có hại cho sức khỏe người loại lương thực, rau thu từ loại trồng người sử dụng gây dị ứng nhiều triệu chứng khác đau đầu, tiêu chảy, tổn hại cho quan gây rối loạn nghiêm trọng loại bệnh tật liên quan đến hệ thần kinh Nó nguy hiểm cho hệ sinh thái gây ô nhiễm môi trường nước đất tích lũy sinh học làm gia tăng độc tính thể sống hệ sinh thái Một số loại chất diệt nấm hóa học Amphotericin B (fungizon) Nystatin (fungicidin, mycostatin, monoral, nystan) Candicidin Ketoconazol Econazol Thuốc dẫn chất Imidazol 11 ... việc bảo quản hạt nông sản, sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường áp dụng Đó lý chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin Bacillus spp (CS1b) ứng dụng bảo quản nông sản? ??... đại Khảo sát khả đối kháng nấm protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả đối kháng nấm cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm Khảo sát. .. 2.4.1 Khảo sát khả đối kháng nấm 36 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất VK có hoạt tính kháng nấm bảo quản hạt 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sản xuất sinh