Đồ án tốt nghiệp khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU LỰC DIỆT SÂU VÀ KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA HAI CHỦNG TUYẾN TRÙNG S – XT VÀ H – CP16 TRÊN SÂU XANH DA LÁNG Spodoptera exigua VÀ XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÔN TRÙNG CỦA TUYẾN TRÙNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực : LÊ QUỐC VŨ MSSV: 1151110545 Lớp: 11DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm năm cuối Trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh, vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hồn tất chương trình học Tơi cam đoan nghiên cứu tơi tiến hành phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh Những số liệu, hình ảnh hồn tồn trung thực chưa có cơng bố Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 Sinh viên thực Lê Quốc Vũ LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng xin ghi khắc cơng lao cha mẹ gian khó ni dạy thành người Cha mẹ chỗ dựa vững nhất, người nâng dậy sau lần vấp ngã, động lực để tiếp tục phấn đấu sống Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh nhiệt tình truyền đạt cho em kiến thức quý giá từ ngày bước vào giảng đường đại học Đặc biệt, xin chân thành biết ơn Nguyễn Hồi Hương, người thầy đáng kính, ln dạy để hồn thành đồ án Và lời khuyên, học sống cô dạy bảo, hành trang quý báu cho sau Con xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai tận tình hướng dẫn phương pháp ni sâu, tuyến trùng người cho nguồn nấm bệnh thí nghiệm Con chân thành Đỗ Thị Tuyến cho vi khuẩn thị hố chất để hồn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phịng thí nghiệm Cảm ơn tất bạn lớp 11DSH ln khích lệ giúp đỡ suốt trình học tập trường Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Nguyễn Ngọc Phong, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn Phan Nguyễn Hương Thảo, Phạm Hải Hậu, Đinh Thị Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương em Lê Thị Ngọc Dung 12DSH01 đồng hành, sát cánh ngày làm đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 SVTH: Lê Quốc Vũ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 1.1.1 Khái niệm EPN 1.1.2 Vai trò ƣu EPN .4 1.2 Khái quát tuyến trùng ký sinh côn trùng 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Chu trình sống tuyến trùng Steinernema Heterorhabditis 1.3 Khái quát vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus Xenorhabdus .7 1.3.1 Một số đặc điểm họ Enterobacteriaceae .8 1.3.2 Phân loại Photorhabdus Xenorhabdus 1.3.3 Một số đặc điểm phân biệt 11 1.4 Tổng quan Serratia marcescens 16 1.4.1 Lịch sử phát Serratia marcescens 16 1.4.2 Phân loại Serratia marcescens 17 1.4.3 Đặc điểm Serratia marcescens 17 1.4.3.1 Đặc điểm sinh lý 17 1.4.3.2 Đặc điểm sinh hóa 18 1.4.3.3 Đặc điểm phân bố .20 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp Serratia marcescens 20 1.4.4.1 Sắc tố 20 1.4.4.2 Biosurfactants .21 1.4.4.3 Acid béo .22 1.4.4.4 Enzyme 22 1.4.5 Yếu tố độc lực Serratia marcescens 22 1.5 Mối quan hệ cộng sinh .23 1.5.1 Vai trò tuyến trùng 23 1.5.2 Vai trò vi khuẩn cộng sinh 24 1.5.3 Tổng quát mối quan hệ tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn 24 1.5.4 Mối quan hệ cộng sinh tuyến trùng EPN Serratia sp 28 1.6 Khái qt lồi trùng bị EPN vi khuẩn tiêu diệt 29 1.6.1 Đặc trƣng côn trùng bị EPN tiêu diệt 29 1.6.2 Các lồi trùng bị EPN tiêu diệt .29 1.7 Khái quát SXDL Spodoptera exigua 30 1.7.1 Đặc điểm hình thái 30 1.7.2 Đặc điểm sinh học sinh thái .30 1.6.2.1 Vòng đời (30 – 40 ngày) 30 1.7.2.2 Thiên địch .31 1.7.3 Một số biện pháp phòng trừ 32 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.1.1 Thời gian 33 2.1.2 Địa điểm 33 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2 Vật liệu – thiết bị - hoá chất .33 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 33 2.2.2 Môi trƣờng ni cấy hóa chất sử dụng .33 2.3 Bố trí thí nghiệm 36 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm .38 2.4.1 Phƣơng pháp ni sâu phịng thí nghiệm 38 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo 38 2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 38 2.4.2.2 Phƣơng pháp bẫy nƣớc thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927) 39 2.4.2.3 Phƣơng pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) 39 2.4.2.4 Phƣơng pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 40 2.4.2.5 Phƣơng pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) 40 2.4.2.6 Phƣơng pháp xác định hoạt động tuyến trùng (Albrecht M Koppenhofer, 2007) 41 2.4.2.7 Thí nghiệm xác định LD50 cho chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 đối tƣợng SXDL tuổi 41 2.4.2.8 Thí nghiệm khảo sát tƣơng quan số lƣợng gây nhiễm - sản lƣợng IJ chu kì kí sinh – phát tán chủng tuyến trùng vật chủ SXDL .43 2.4.2.9 Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 phƣơng pháp tiêm bƣớc đầu xác định tác nhân gây chết 44 2.4.3 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn .46 2.4.3.1 Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp Akhurst (1980) Sun Ho Park Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) 46 2.4.3.2 Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp Lawrwnce A Lacey (2011) .48 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.3 Phƣơng pháp chứng minh nội sinh 48 2.4.3.4 Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn nội sinh 49 2.4.4 Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phân lập .49 2.4.4.1 Phƣơng pháp kiểm tra độ khiết 49 2.4.4.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái, sinh lý 50 2.4.4.3 Thử nghiệm sinh hoá 50 2.4.4.4 Phƣơng pháp định danh APIKIT 20E 50 2.4.4.5 Giải trình tự 16S rRNA 50 2.4.5 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học 50 2.4.5.1 Phƣơng pháp định tính enzyme 50 2.4.5.2 Phƣơng pháp khảo sát khả kháng kháng sinh .51 2.4.5.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phƣơng pháp cấy chéo 51 2.4.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng nấm 53 2.4.5.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu phƣơng pháp tiêm .53 2.4.5.6 Khảo sát tính tƣơng tác tổ hợp vi khuẩn tuyến trùng EPN 54 CHƢƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 56 3.1 Kết đánh giá LD50 hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 56 3.1.1 Chủng S – XT 57 3.1.2 Chủng H – CP16 .58 3.2 Khả sinh sản tuyến trùng S – XT H – CP16 SXDL .60 3.2.1 Khả nhân chủng tuyến trùng SXDL tuổi 62 3.2.1.1 Chủng S – XT .62 3.2.1.2 Chủng H – CP16 63 3.2.2 Mối tƣơng quan số lƣợng IJ gây nhiễm sản lƣợng IJ sinh .63 iv Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.1 Chủng S – XT .64 3.2.2.2 Chủng H – CP16 66 3.2.3 Chu kỳ kí sinh phát tán hai chủng tuyến trùng EPN S – XT H – CP16 SXDL .68 3.2.3.1 Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT H – CP16 SXDL 68 3.2.3.2 Chu kỳ phát tán hai chủng tuyến trùng EPN S – XT H – CP16 SXDL 69 3.3 Xác định tác nhân gây chết sâu 72 3.4 Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng 75 3.5 Kết định lƣợng tổng số vi khuẩn tuyến trùng (cfu/IJ) .79 3.6 Quan sát hình thái, sinh lý 80 3.7 Thử nghiệm sinh hóa 83 3.8 Kết định danh KIT API 20E (Biomerieux) .85 3.9 Kết giải trình tự rRNA 16S 86 3.10 Khả tiết enzymme ngoại bào 88 3.11 Khả kháng kháng sinh .91 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn .94 3.14.1 Đối kháng không tiếp xúc .95 3.14.2 Đối kháng tiếp xúc 96 3.13 Hoạt tính kháng nấm 98 3.14 Hiệu lực diêt sâu .101 3.17 Khảo sát tƣơng tác tuyến trùng vi khuẩn 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 v Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO .109 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PTSH : P òng trừ sinh học IJ EPN : Ấu trùng xâm nhiễm (viết tắt tên tiếng Anh: Infective juveniles) : tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh: entomopathogenic nematodes) S-XT : Steinernema guangdongense XT H-CP16: Heterorhabditis indica CP16 VKCS : Vi khuẩn cộng sinh BSL : Bƣớm sáp lớn SB : Serratia marcescens SB HB : Serratia marcescens HB VSV : Vi sinh vật SXDL : Sâu xanh da láng vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng Bảng 1.2 Phân loại chi Photorhabdus Xenorhabdus Bảng 1.3 Đặc điểm phân biệt hai chi Photorhabdus Xenorhabdus 11 Bảng 1.4.Một số đặc điểm phân biệt hai pha sơ cấp thứ cấp Xenorhabdus / Photorhabdus 12 Bảng 1.5 Các đặc điểm sinh hóa Photorhabdus 14 Bảng 1.6 Các đặc điểm sinh hóa Xenorhabdus 15 Bảng 1.7 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 19 Bảng 1.8 Vòng đời tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh 27 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 đối tƣợng SXDL tuổi 42 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm tƣơng quan số lƣợng gây nhiễm sản lƣợng IJ sinh chủng tuyến trùng 43 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 phƣơng pháp tiêm 45 Bảng 3.1 Hiệu lực gây chết SXDL tuổi chủng S – XT 57 Bảng 3.2 Hiệu lực gây chết SXDL tuổi chủng H – CP16 59 Bảng 3.3 Khả sinh sản chủng S – XT SXDL 61 Bảng 3.4 Khả sinh sản chủng H – CP16 SXDL 61 Bảng 3.5 Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 SXDL 68 Bảng 3.6 Số lƣợng IJ phát tán qua ngày chủng S – XT 70 Bảng 3.7 Số lƣợng IJ phát tán qua ngày chủng H – CP16 71 Bảng 3.8 Kết diệt sâu số nồng độ gây nhiễm hai chủng S – XT H – CP16 phƣơng pháp tiêm 73 Bảng 3.9 Kết khử trùng bề mặt tuyến trùng 76 viii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10 Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng phân lập 84 Bảng 3.11 Kết định danh KIT API 20E hai chủng SB HB 85 Bảng 3.12 Khả tiết enzyme ngoại bào SB HB 89 Bảng 3.13 Tỷ lệ đối kháng nấm chủng SB, HB 100 Bảng 3.14 LD50, LD90 chủng SB HB sau 48 đƣợc tiêm vào sâu 103 Bảng 3.15 Tỷ lệ chết S – XT sau 12 ngày 104 Bảng 3.16 Tỷ lệ chết H – CP16 sau 12 ngày 104 ix Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vịng đời tuyến trùng thể trùng Hình 1.2 Phân loại chủng Photorhabdus Xenorhabdus 10 Hình 1.3 Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 17 Hình 1.4 Khuẩn lạc Serratia marcescens môi trƣờng nutrient agar 25oC sau 48 (David, 2012) 18 Hình 1.5 Vịng đời SXDL da láng 31 Hình 2.1 Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng kí chủ SXDL phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng 36 Hình 2.2 Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh vi khuẩn 37 Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập 37 Hình 2.4 Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN 47 Hình 3.1 Dấu hiệu sâu chết tuyến trùng 56 Hình 3.2 Tƣơng quan nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết chủng S – XT SXDL tuổi 58 Hình 3.3 Tƣơng quan nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết chủng H – CP16 SXDL tuổi 60 Hình 3.4 Tƣơng quan số lƣơng gây nhiễm sản lƣơng IJ sinh chủng S – XT 65 Hình 3.5 Tƣơng quan số lƣơng gây nhiễm sản lƣơng IJ sinh chủng H – CP16 67 Hình 3.6 Số lƣợng IJ phát tán qua ngày chủng S – XT 70 Hình 3.7 Số lƣợng IJ phát tán qua ngày chủng H – CP16 72 Hình 3.8 Sâu chết tuyến trùng phƣơng pháp tiêm 74 Hình 3.9 Khuẩn lạc vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu môi trƣờng NBTA 75 Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ tuyến trùng khử trùng bề mặt NBTA, MacConkey, NA PGA 78 x Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc chủng SB 80 Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc chủng HB 81 Hình 3.13 Kết nhuộm Gram hai chủng SS1 SH1 83 Hình 3.14 Cây phát sinh loài SB HB 88 Hình 3.15 Khả tiết enzyme ngoại bào 90 Hình 3.16 Kết kháng sinh đồ 92 Hình 3.17 Kết đối kháng không tiếp xúc 95 Hình 3.18 Kết đối kháng tiếp xúc (mặt trên) 96 Hình 3.19 Kết đối kháng tiếp xúc (mặt dƣới) 97 Hình 3.20 Kết đối kháng với chủng nấm 100 Hình 3.21 Khả diệt sâu SB, HB sau 48 tiêm vào sâu 102 Hình 3.22 Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 tiêm SB vào SXDL 102 Hình 3.23 Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 tiêm HB vào SXDL 103 Hình 3.24 Tỷ lệ chết chủng tuyến trùng S – XT 105 Hình 3.25 Tỷ lệ chết chủng tuyến trùng H – CP16 105 xi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày ngành nông nghiệp Việt Nam đà phát triển mạnh mẽ số lƣợng chất lƣợng, số mặt hàng nơng sản nhƣ cà phê, lúa gạo có kim nghạch xuất cao có vị thị trƣờng quốc tế Nhu cầu tăng sản lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đƣợc đặt ra, đơi với ln địi hỏi kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn Tuy nhiên riêng Việt Nam mà hầu nhƣ tất nƣớc nơng nghiệp ngƣời nơng dân đƣợc trang bị đầy đủ kiến thức sản xuất để đảm bảo tính bền vững Vì khơng nơi ngƣời nông dân sử dụng ạt loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học khơng hiểu biết hay biết đƣợc tác hại nhƣng cố ý sử dụng để tăng sản lƣợng, thu lợi nhuận Chính việc sử dụng mà khơng tuân thủ quy định liều lƣợng cách thức làm dịch bệnh trở nên nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp Trong đó, SXDL da láng (Spodoptera exigua) loài sâu ăn tạp phổ biến, phá hoại nhiều loại trồng nhƣ họ bầu bí, họ thập tự, hành, lạc, nho,… có khả kháng thuốc hóa học cao ngƣời dùng lạm dụng nhiều thuốc trừ sâu hóa học khơng cách Vì xu hƣớng sử dụng biện pháp phòng trừ sinh học trở nên hữu ích tiết kiệm chi phí, có tác dụng phịng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho ngƣời, đồng thời tính an tồn mơi trƣờng cao Trong biện pháp sinh học đƣợc sử dụng dùng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema Heterorhabditis đƣợc nƣớc giới Việt Nam đặc biệt ý Tuy nhiên, loài tuyến trùng EPN không thực phát huy hiệu khơng có mặt VKCS ruột chúng ngun nhân gây chết trùng Hai loài VKCS phổ biến đƣợc nghiên cứu biết đến nhiều gồm Photorhabdus, Xenorhabdus nhƣng theo số báo cáo gần Serratia macescens có vai trò này.Với vai trò đặc biệt, VKCS trở thành mấu chốt mối quan hệ sâu hại – tuyến Đồ án tốt nghiệp trùng – vi khuẩn Đây đƣợc coi lồi vi khuẩn có đời sống đặc biệt cộng sinh vật chủ gây hại cho vật chủ khác thông qua vật chủ mà cộng sinh Mặt khác thấy đƣợc khả kháng mạnh với loài vi khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc lồi nấm gây hại cho nơng nghiệp, điều mở ứng dụng lớn Tuy nhiên Việt Nam có số nghiên cứu Hà Nội có liên quan đến VKCS tuyến trùng EPN, tỉnh thành miền Nam chƣa có nghiên cứu vấn đề phân lập ứng dụng vi khuẩn cộng sinh Trong nghiên cứu sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm Heterorhabditis indica (H – CP16) Steinernem guangdongense (S – XT), H – CP16 S – XT hai chủng tuyến trùng chƣa có nghiên cứu chủng VKCS với nhƣ việc đánh giá hiệu lực diệt sâu chúng đối tƣợng SXDL (Spodoptera exigua) Vì lợi ích quan trọng hai chủng tuyến trùng VKCS ngƣời tiến hành đề tài chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp : “Khảo sát hiệu lực diệt sâu khả sinh sản hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 sâu xanh da láng Spodoptera exigua xác định tác nhân gây bệnh côn trùng tuyến trùng ” Mục đích nghiên cứu Ứng dụng khả phịng trừ sâu hại nhân ni in vivo tuyến trùng EPN đối tƣợng SXDL Spodoptera exigua hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 Xác định chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh côn trùng hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 ứng dụng chúng đấu tranh sinh học bảo vệ thực vật Nhiệm vụ nghiên cứu Đánh giá hiệu lực diệt sâu khả sinh sản hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 đối tƣợng SXDL Phân lập chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh côn trùng hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 Đồ án tốt nghiệp Khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập bƣớc đầu xác định mối quan hệ chúng với hai loài tuyến trùng khảo sát Các kết đạt đƣợc đề tài Xác định đƣợc số LD50 khả sinh sản hai chủng tuyến trùng đối tƣợng SXDL Phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn SB, HB lần lƣợt tuyến trùng S – XT H – CP16 Kết định danh cho thấy chủng SB, HB thuộc lồi Serratia macescens Định tính khả kháng khuẩn, kháng kháng sinh, hoạt tính enzyme, tỉ lệ ức chế nấm bệnh gây hại trồng, hiệu lực diệt sâu tƣơng tác với kí chủ tuyến trùng hai chủng vi khuẩn SB, HB Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 1.1.1 Khái niệm EPN EPN viết tắt từ Entomopathogenic Nematodes, thuật ngữ dùng để loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema Heterorhabditis, chúng vừa có khả ký sinh lại vừa có khả gây bệnh giết chết côn trùng Thực chất lồi tuyến trùng kí sinh tổ hợp đƣợc hình thành tự nhiên có chun hóa cao, lồi tuyến trùng thuộc giống Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, cịn Heterorhabditis cộng sinh với vi khuẩn Photorhabdus Sở dĩ đƣợc gọi cộng sinh vi khuẩn tuyến trùng dựa vào để tồn tại, phát triển, sinh sản Đây tƣợng cộng sinh bắt buộc, tuyến trùng vi khuẩn tồn độc lập tự nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 1.1.2 Vai trò ưu EPN Vai trò EPN đƣợc thấy trƣớc tiên nhƣ thiên địch tự nhiên có tác dụng điều chỉnh mật độ quần thể trùng, có nhiều lồi sâu hại Thực tế cho thấy, tự nhiên nơi đâu có tồn EPN nơi hầu nhƣ khơng bùng phát dịch hại côn trùng gây (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) EPN nhận đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng chúng có ƣu sau : a Phƣơng pháp s đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng chúng có ƣu sau :t độ quần thể b EPN có kháp s đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng chúng có ƣu sau c Các lồi sâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng d Có khồi sâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng chúng e Áp dhoài sâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng chúng có ƣu Đồ án tốt nghiệp f Có khồi sâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng chúng có g Có khồi sâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng h Tó khoà bsâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu in vitro in vivo to ƣu sau :t độ quần thể côn trù i Dà bsâu hđƣợc quan tâm nghiên cứu in vitro in v 1.2 Khái quát tuyến trùng ký sinh côn trùng 1.2.1 Phân loại Tuyến trùng ký sinh côn trùng đƣợc tìm thấy sáu tuyến trùng: - Aphelenchida - Diplogasterida - Mermithida - Oxyurid - Rhabditida - Tylenchida Trong Rhabditida, Mermithida Tylenchida quan trọng Trong Rhabditida, tuyến trùng hai họ sau đƣợc đề cập: - Hrong Rhabditida, tuyến trùng tSteinernema Neosteinernema - Heosteinernemaitida, tuyến trùng Heterorhabditis Steinernema đƣợc Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, tên đƣợc sử dụng trƣớc đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema, trƣớc năm 1982 nhiều loài tuyến trùng có tên khác Neoaplectana Hiện có khoảng 56 lồi đƣợc mơ tả Neosteinernema đƣợc Nguyễn Smart mô tả năm 1994, tuyến trùng có lồi ký sinh mối Heterorhabditis đƣợc Poinar mơ tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 lồi Đây đƣợc đánh giá nhóm tuyến trùng quan trọng bảo vệ mùa màng, có nhiều nghiên cứu tập trung giống Đồ án tốt nghiệp Vòng đời EPN khoảng 10 - 12 ngày trung bình từ vật chủ cho khoảng 5×104 ấu trùng tùy thuộc vào lồi trọng lƣợng vật chủ Bảng 1.1 Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng Tên Phân loại Ngành Nematoda Lớp Chromadorea Phân Chromadoria lớp Bộ Rhabditida Phân Panagrolaimomorpha Họ Giống Steinernematidae Steinernema Neosteinernema Heterorhabditiae Heterorhabditis 1.2.2 Chu trình sống tuyến trùng Steinernema Heterorhabditis Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi (IJ) mang vi khuẩn cộng sinh ruột Khi vào đến bên vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng phóng thích vi khuẩn cộng sinh từ ruột chúng vào máu côn trùng Vi khuẩn phát triển nhanh nhờ huyết tƣơng côn trùng tạo tƣợng ngộ độc máu làm côn trùng chết khoảng từ 24 đến 48 đồng hồ Vi khuẩn phân hủy mô thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh dƣỡng để phát triển sang tuổi thành thành trùng hệ Phụ thuộc vào nguồn dinh dƣỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác thể trùng nhƣ hình 2.1 ... tranh sinh h? ??c bảo vệ thực vật Nhiệm vụ nghiên cứu Đánh giá hiệu lực diệt s? ?u khả sinh s? ??n hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 đối tƣợng SXDL Phân lập chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh côn trùng. .. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi chủng S – XT 57 Bảng 3.2 Hiệu lực gây chết SXDL tuổi chủng H – CP16 59 Bảng 3.3 Khả sinh s? ??n chủng S – XT SXDL 61 Bảng 3.4 Khả sinh s? ??n chủng H – CP16 SXDL... côn trùng hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 Đồ án tốt nghiệp Khảo s? ?t hoạt tính sinh h? ??c chủng vi khuẩn phân lập bƣớc đầu xác định mối quan h? ?? chúng với hai loài tuyến trùng khảo s? ?t Các kết