BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRÊN SẢN PHẨM TÔM TƯƠI TẠI CHỢ BÀ CHIỂU Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ S[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRÊN SẢN PHẨM TÔM TƯƠI TẠI CHỢ BÀ CHIỂU Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS PHẠM MINH NHỰT ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 0851110258 : NGUYỄN THÁI TRƯƠNG Lớp: 08DSH3 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày với tốc độ phát triển xã hội, đời sống người ngày cải thiện, nhu cầu dinh dưỡng bữa ăn hàng ngày trọng Việc đòi hỏi thực phẩm cung cấp vừa bảo đảm chất lượng, vừa an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng điều vô thiết yếu Tuy nhiên, vài năm trở lại đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm nước ta mức đáng báo động Bằng chứng có nhiều vụ ngộ độc xảy ra, nguyên nhân từ việc sử dụng loại hóa chất bảo quản thực phẩm, thực phẩm bị ôi thiu dẫn đến phát triển vi sinh vật gây bệnh sản sinh độc tố Bên cạnh nguồn thực phẩm truyền thống mà người sử dụng bữa ăn ngày thịt heo, thịt bị, cá … hải sản người ngày ưa chuộng có hàm lượng chất dinh dưỡng cao nguồn hải sản tơm.Tuy nhiên, ngồi việc chứa nhiều chất dinh dưỡng, tôm môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, tác nhân làm hư hỏng, biến chất thực phẩm gây tình trạng ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng ba triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệt hại 200 triệu USD Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm vi sinh vật 42,2%, hoá chất 24,9%, độc tố tự nhiên 25,2% [13] Chính thế, việc đánh giá chất lượng tơm thị trường giúp giảm tình trạng ngộ độc loại thực phẩm gây người tiêu dùng Xuất phát từ tình hình trên, chấp thuận khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kĩ Thuật Công Nghệ Tp.HCM hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt ThS Nguyễn Thị Thu Hương, tiến hành thực đề tài: “Đánh giá tiêu vi sinh sản phẩm tôm tươi chợ Bà Chiểu” Đề tài thực Phịng thí nghiệm Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Cơng nghệ Tp.HCM Mục đích Đồ án tốt nghiệp Tìm hiểu nguyên nhân biến chất hư hỏng mẫu tôm, đánh giá số tiêu vi sinh vật mẫu tôm quầy chợ Bà Chiểu Mục tiêu đề tài: - Khảo sát mức độ nhiễm tồng vi sinh vật hiếu khí (TPC), Coliforms, E.Coli, Listeria monocytogenes mẫu tơm tươi lấy quầy thủy sản chợ Bà Chiểu - Đề biện pháp xử lí thích hợp cho quầy tơm nói riêng cho khu vực buôn bán thủy hải sản chợ Bà Chiểu nói chung Phạm vi nghiên cứu - Tiến hành lấy mẫu tôm tươi ngẫu nhiên quầy chợ Bà Chiểu - Phân tích tiêu vi sinh có khả diện mẫu: TPC Coliforms E Coli Listeria monocytogenes - Đánh giá ghi nhận kết dựa tiêu phân tích Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan tôm [1] Tôm đối tượng quan trọng nghành thủy sản nước ta, chiếm tỷ lệ khoảng 70 – 80% kim nghạch xuất nghành thủy sản Tơm có giá trị dinh dưỡng cao, tổ chức cơ, thịt rắn chắc, có mùi vị thơm ngon đặc trưng hấp dẫn Nghề chế biến tôm đặc biệt tôm đông lạnh phát triển để đáp ứng cho nhu cầu xuất phần cho thực phẩm nước Một số loại tôm sử dụng phổ biến thực phẩm: 1.1.1 Họ tôm he [1] 1.1.1.1 Tôm sú (Penaeus monodon): loại tơm có kich thước lớn, ngực tơm có vân ngang Tơm sú phân bố rồng đầm nước lợ hay vùng biển có độ sâu 40m, tập trung nhiều độ sâu 10 – 25m 1.1.1.2 Tơm he mùa (Penaeus merguiensis): hay cịn gọi tôm bạc, phân bố khắp nơi tập trung chủ yếu Nam Trung Bộ, Vũng Tàu, Rạch Giá, Vịnh Thái Lan Thân tơm dẹt, đầu có cưa, dài, khơng có gai màu vàng nhạt phớt xanh, có nhiều đốm đen đỏ, thân màu vàng nhạt phớt xanh, tơm có chiều dài 140 – 200mm, khối lượng 25 – 80g, mùa vụ từ tháng 11 đến tháng năm sau, từ tháng đến tháng 1.1.1.3 Tơm thẻ (Penaeus seminelcatus): cịn gọi tơm sú vằn, tơm có mảu đặc trưng xanh thẳm, có vằn ngang vùng bụng, râu tơm có màu vàng đỏ nhạt, phân bố độ sâu 60m, tập trung chủ yếu 30 – 40m, tập trung chủ yếu khu vực Trung Bộ, tập trung chủ yếu Phú Khanh, Nghĩa Bình, mùa vụ từ tháng tháng – 9, tơm có chiều dài từ 120 – 250mm, với khối lượng từ 120 – 145g 1.1.2 Họ tôm hùm (Homaridae) họ tôm rồng (Palinuridae) Chưa có phân biệt rõ lồi này, thường gọi chung tơm hùm, tơm hùm có thịt thơm ngon, có giá trị kinh tế cao 1.1.2.1 Tơm hùm (Panulirus ornatus): cịn gọi tơm hùm bong, có kích thước lớn, chiều dài khai thác 250 – 450mm, với khối lượng 1230 – 2310g Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.2 Tôm hùm đỏ (P longipes): chiều dài khai thác 160 – 280mm với khối lượng 245 – 495g 1.1.2.3 Tơm hùm sỏi (P homarus): cịn gọi tôm hùm đá, chiều dài khai thác 165 – 350mm với khối lượng 45 – 85g 1.1.3 Tôm xanh (Palaemonidae) Là đối tượng khai thác nhiều, sinh sống sơng ngịi, kênh rạch, đồng ao Nam Bộ Tôm sống môi trường nước lợ nước ngọt, mùa vụ quanh năm tập trung chủ yếu tháng 10 – 12 Thân tơm trịn, có màu xanh lơ đậm, chùy đầu phát triển, tơm có sọc đen dài, phần có màu vàng da cam Tơm có chiều dài 110 – 200mm, khối lượng 30 – 120g 1.1.4 Họ tơm vỗ (Scyllaridae) Có lồi, lồi có giá trị kinh tế lớn Ibacus ciliates, tơm vỗ cịn gọi tơm Mũ Ni Tơm vỗ có đầu to dẹt, thân ngắn, tơm có màu vàng xám hay đen xám, tơm vỗ loại tơm thịt thơm ngon, có giá trị kinh tế, chiều dài khai thác 140 – 210mm với khối lượng 80 – 300g 1.2 Thành phần hóa học tơm [1][2] 1.2.1 Thành phần hóa học tơm Thành phần hóa học gồm: nước, protein lipid, muối vô cơ, vitamin Các thành phần khác nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống Thành phần hóa học động vật thủy sản thường khác theo giống lồi, loại, có hồn cảnh sống khác thành phần hóa học khác nhau, thành phần hóa học cịn phụ thuộc vào trạng thái sinh hóa, lý hóa, giới tính, mùa vụ, thời tiết Thành phần hóa học tơm so với cá nói chung nước nhiều protit hơn, lượng mỡ phần lớn 2% thay đổi theo thời tiết Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Thành phần hóa học tôm [2] (theo trọng lượng tôm) Thành phần Đơn vị Tôm Protit g/ 100g 19 – 33 Lipid - 0,3 – 1,4 Nước - 76 – 79 Tro - 1,3 – 1,87 Gluxit - - Canxi mg/ 100g 29 – 50 Photpho - 33 – 67,6 Sắt - 1,2 – 5,1 Na - 11 – 127 K - 127 – 565 Bảng 1.2: Hàm lượng vitamin tôm he A (UI/g) B1 (mg %) B2 (mg %) PP (mg %) 360 0,01 0,11 1,7 Ngoài ra, thành phần hóa học động vật thủy sản cịn có thành phần không phần quan trọng sắc tố - thể rõ lớp da, tế bào sắc tố (chromatophore) Trong tế bào có nhiều sắc tố, màu sắc khác theo họ Thuộc họ sắc tố mơ (lipochrome) có màu đỏ, hồng, vàng, vàng xậm, thuộc họ sắc tố đen (lipochrome) có màu đen, tím đen, nâu đen Trong mẫu tơm có huyết cầu màu xanh (hemocyanin) Đặc biệt gia nhiệt vỏ tơm biến thành màu vàng, đỏ hay tím đỏ, sắc tố astacin (C40H48O) 1.2.2 Hệ vi sinh vật tôm [2] Đồ án tốt nghiệp Hệ vi sinh vật tôm cá gồm chủ yếu vi sinh vật gây thối rữa Trong đầu tôm thường chứa nhiều vi khuẩn Pseudononas flourescens, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificus, Proteus vugaris… Hệ vi sinh vật tôm phụ thuộc vào điều kiện sống, điều kiện đánh bắt, vận chuyển, bảo quản sơ chế Hình 1.1: Mật độ vi khuẩn có tơm Vi khuẩn diện lồi thân mềm giống với vi khuẩn cá biển số lượng vi khuẩn G+ Bacillus, Micrococcus, Enterobacteriaceae , Streptococcus chiếm số lượng lớn 1.3 Đặc điểm chung tơm [1][2] 1.3.1 Hình dạng Nhìn từ bên ngồi, tơm gồm phận sau: Chủy: dạng lưỡi kiếm, cứng, có cưa Với tơm sú, phía chủy có 78 chủy có Mũi khứu giác râu: quan nhận biết giữ thăng cho tôm cặp chân hàm: lấy thức ăn bơi lội cặp chân ngực: lấy thức ăn bò Cặp chân bụng: bơi Đi: có cặp chân để tơm nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao hay xuống thấp Bộ phận sinh dục (nằm bụng) Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, có kích thước to đực Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái, thông qua quan sinh dục phụ bên Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Tỷ trọng tôm Gần tỉ trọng nước, thay đổi tùy theo phận thể tôm, phụ thuộc vào thân nhiệt tơm, tơm có nhiệt nhỏ tỉ trọng nhỏ 1.3.3 Điểm băng Là điểm nhiệt độ làm cho tơm bắt đầu đóng băng, nước thể tơm tồn dạng dung dịch điểm băng tuân theo định luật Raun Dung dịch lỗng đóng băng nhanh, điểm đóng băng tơm gần điểm đóng băng nước (0oC) Thơng thường điểm băng lồi tơm từ -0,6oC ÷ -2,6oC Điểm băng tơm tỉ lệ nghịch với pH dung dịch thể tôm Áp suất thẩm thấu động vật thủy sản nước thấp nước mặn điểm băng thủy sản nước cao nước mặn 1.3.4 Yếu tố hóa học a Trimethylamin oxyt (TMAO) TMAO thành phần đặc trưng quan trọng nhóm chất chứa nitơ phi protein Hàm lượng TMAO cá khác tùy theo lồi, điều kiện sinh sống, kích cỡ Cá hoạt động bơi lội nhiều, kích cỡ lớn chứa nhiều TMAO cá nhỏ, bơi lội nước Theo Tokunaga (1970), hàm lượng TMAO tôm tập trung cao thịt sẫm (vùng tối), TMAO có vai trị điều hịa áp suất thẩm thấu tơm, giúp tơm chống lại áp suất thẩm thấu gây chênh lệch nồng độ muối nước biển b Các axit amin tự Các axit amin tự chiếm khoảng 0,5-2% trọng lượng thịt, chúng góp phần tạo nên mùi vị thơm ngon đặc trng nguyên liệu Hàm lượng axit amin tự nhiều vi khuẩn gây hư hỏng phát triển nhanh sinh mùi ammoniac Các lồi tơm có thịt sẫm thường vận động, có hàm lượng histidine cao Cơ thịt sẫm chứa histidin nhiều thịt trắng Trong thời gian bảo quản, histidine bị vi sinh vật khử nhóm carboxyl hình thành độc tố histamine Đồ án tốt nghiệp c Urê Urê có phổ biến tất thịt tơm, nói chung có 0,05% thịt Trong q trình bảo quản, urê phân huỷ thành NH3 CO2 tác dụng enzym urease vi sinh vật Do urê hoà tan nước thấm qua màng tế bào nên dễ tách khỏi miếng phi lê Amoniac có mùi đặc trưng (mùi khai) Trong thịt tơm tươi có lượng nhỏ amonia, lượng amoniac thấp bị hư hỏng vi sinh vật lượng amoniac tăng nhanh Khi hư hỏng tiến triển, pH thịt chuyển sang môi trường kiềm lượng amoniac tăng lên tạo nên mùi ươn thối tôm e Creatine Là thành phần hợp chất phi protein Cá trạng thái nghỉ ngơi creatine tồn dạng mạch vòng phospho cung cấp lượng 1.4 Tác hại vi sinh vật lên động vật thủy sản Tác hại chủ yếu vi sinh vật vào động vật thủy hải sản gây thối rửa, ươn hỏng Khi cá bị ươn hỏng ln có hệ vi sinh vật tồn (spoilage flora) Hệ vi sinh vật gồm nhiều loại khác có số loại gây sư ươn hỏng (spoilage bacteria) Là vi khuẩn đặc trưng gây nên biến mùi vị có liên quan với hư hỏng Một lượng lớn vi khuẩn cá ươn khơng có vai trị q trình hư hỏng Mỗi sản phẩm cá có vi khuẩn gây hỏng đặc trưng riêng lượng vi khuẩn (so với lượng vi khuẩn tổng số) có liên quan đến thời hạn bảo quản * Chỉ tiêu vi sinh vật sản phẩm tôm (TCVN 5289 – 1992) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3: Giới hạn tiêu vi sinh sản phẩm tôm đông lạnh xuất Chỉ tiêu vi sinh Giới hạn TSVKHK (TPC) ≤ 106 CFU/ g sản phẩm Coliform ≤ 102 CFU/ g sản phẩm Staphylococcus 1*102 CFU/ g sản phẩm Samonella Không cho phép E.Coli 1*102 CFU/ g sản phẩm Vibrio paraheamolyticus 1*102 CFU/ g sản phẩm 1.5 Một số dạng hư hỏng tôm [2] 1.5.1 Sự biến đỏ tôm Khi tôm bị ươn, thối kèm theo biến đỏ Biến đỏ xảy tôm bị gia nhiệt hay bảo quản môi trường axit Cơ chế biến đỏ giải thích sau: tơm tươi vỏ thịt chứa chất astaxanthin có màu xanh tím, bình thường astaxanthin kết hợp với protein tạo thành phức bền tác dụng nhiệt, axit, phân huỷ thịt tôm làm cho astaxanthin bị tách khỏi protein Astaxnthin bị oxi hoá tạo thành astaxin có màu đỏ gạch Cơ chế q trình thối rửa: Protein peptone axit amin ammoniac, sunfuahydro, indol, cadaverin, mercaptal… 1.5.2 Sự biến đen tôm Hiện tượng biến đen tôm hai nguyên nhân khác Thứ vi khuẩn phát triển mạnh tôm sau đánh bắt tạo thành khuẩn lạc màu đen Thứ hai triozin bị oxi hoá tạo thành melanin, tích tụ melanin làm cho tơm có màu đen Sự biến đen tôm làm giảm giá trị cảm quan chất lượng dinh dưỡng đảm bảo 1.6 Các phương pháp bảo quản [2] 1.6.1 Bảo quản nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp có tác dụng kìm hãm hoạt động vi sinh vật Mức độ ức chế tùy thuộc vào loài vi sinh vật Đa số vi sinh vật ngừng phát triển nhiệt độ lạnh, Đồ án tốt nghiệp khô có số phát triển chung quanh 0oC chí phát triển chậm nhiệt độ -6oC đến -10oC (Micrococcus cereus) Song từ 0oC vi sinh vật phát triển khả phân giải chất đạm, chết béo Vì mà bảo quản nhiệt độ thấp đươc sử dụng nhiều việc bảo quản thủy hải sản Có hai phương pháp bảo quản nhiệt độ thấp ướp lạnh lạnh đơng Tùy vào thời gian bào quản loại hải sản mà ta lựa chọn phương pháp cho phù hợp 1.6.2 Ướp lạnh Là trình làm ức chế trình hoạt động enzyme vi sinh vật gây thối Ướp lạnh khơng làm ngừng q trình phân huỷ cá mà làm trình chậm lại Trong ướp thân nhiệt động vật thủy sản chưa đến điểm đóng băng dịch tế bào Đây điểm khác phương pháp ướp lạnh phương pháp đông lạnh Do phưng pháp bảo quản thời gian ngắn nên sản phẩm thường gặp phương pháp loài thủy sản ướp lạnh đánh bắt cá ướp lạnh, tôm ướp lạnh Phương pháp thường sử dụng nước đá kết hợp thêm số hóa chất tỉ lệ thích hợp 1.6.3 Lạnh đơng Mục đích q trình lạnh đơng thủy sản hạ nhiệt độ xuống thấp Vì làm chậm lại ươn hỏng sản phẩm không bị thay đổi tính chất ban đầu nguyên liệu tươi Nhiệt độ bảo quản phương pháp thường -18oC trở 1.6.4 Bảo quản trạng thái khô Vi sinh vật thường phát triển mơi trường có ẩm độ định, độ ẩm tới hạn cho sinh trưởng vi khuẩn 30%, nấm mốc 15% Khi mơi trường có ẩm độ thấp ngưỡng chúng khơng thể phát triển Vì để hạn chế vi sinh vật phát triển hư hại cho thủy hải sản trình bảo quản người ta thường sấy khô thủy hài sản Hiện thị trường có nhiều sản phẩm đươc bảo quản theo phương pháp cá khô, tôm khô, mực khô … Hiện người ta dùng phương pháp sấy chân không nhiệt độ thấp, sản phẩm sấy không 10 Đồ án tốt nghiệp bị thay đổi màu sắc, giữ nguyên giá trị dinh dưỡng, vitamin khống chất ổn định Tuy nhiên q trình khô tiêu diệt tất tế bào vi sinh vật , bào tử vi khuẩn nấm mốc bền với trạng thái khô hạn 1.7 Giới thiệu số vi sinh vật gây bệnh diện sản phẩm tôm tươi [3][6] 1.7.1 Salmonella sp Hình 1.2: Salmonella vi khuẩn chuyên chở bệnh thương hàn 1.7.1.1 Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella sp 1.7.1.2 Đặc điểm [3][5] Salmonella trực khuẩn Gram âm Hầu hết lồi Salmonella có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum Salmonella pullorum), có khả di động, khơng sinh bào tử Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3µm Salmonella vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, thích hợp 370C, pH tối ưu 7,2 - 7,6 Đặc điểm sinh hóa: Salmonella lên men glucose có sinh (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, Indol âm tính, Methyl Red dương tính, VP 11 Đồ án tốt nghiệp âm tính, Citrat thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính) Lên men sinh đường glucose, manit, sorbitol, lên men không sacharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose … (Tô Minh Châu Trần Bích Liên, 1999) 1.7.1.3 Yếu tố độc lực [4][5][6] Có hai loại độc tố nội độc tố ngoại độc tố Ngoại độc tố đường ruột (entero toxin) có hai loại LT ST Độc tố LT khơng bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcuclase tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-monophosphate), cAMP kích thích tiết Cl- HCO3- khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na+ vào bên tế bào Hậu tích nước ống ruột dẫn đến tiêu chảy Độc tố ST bền với nhiệt, chế tác động tương tự LT ST hoạt hóa enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cycle guanosine 5-monophosphate) tế bào dẫn tới tượng tiêu chảy 1.7.1.4 Khả gây bệnh [6] Salmonella xâm nhập vào thể qua đường miệng hầu hết ăn phải thức ăn bị nhiễm thực phẩm, sữa, nước uống… Sau xuyên qua hàng rào acid dày, vi khuẩn di động phía ruột non sinh sản đó, tiếp tục chui qua màng nhày vào thành ruột Salmonella nhiễm vào thể từ hai nguồn: từ phân người động vật, từ người bệnh Trong phải kể đến tác động động vật lông vũ, trứng phân chúng làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng Ngoài chuột, mèo, ruồi tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi phân chúng nhiễm vào thực phẩm khơng bảo quản kỹ Trong q trình giết mổ củng cần đề phịng nhiễm Salmonella khơng thực quy trình an tồn thực phẩm Bệnh thương hàn 12 Đồ án tốt nghiệp Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu S typhi, sau đến S paratyphi A, S paratyphi B S paratyphi C gặp Bệnh lây từ người sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn Sinh bệnh học: Trực khuẩn thương hàn vào thể qua đường tiêu hóa đến ruột non chui qua niêm mạc ruột vào hạch mạc treo ruột Ở chúng nhân lên phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng nội độc tố, nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm bụng, gây thương tổn, xuất huyết tiêu hóa, gây thủng ruột Các bệnh khác Các bệnh thương hàn Salmonella gây thường nhiễm trùng giới hạn ống tiêu hóa trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà Salmonella typhimurium tác nhân hay gặp nhất, sau Salmonella enteritidis Nhiễm trùng nhiễm độc Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 đến 48 giờ, bệnh biểu có sốt, nơn, tiêu chảy, bệnh khỏi sau - ngày, khơng có biến chứng 1.7.2 Escherichia Coli [3][5] Hình 1.3: Escherichia Coli 1.7.2.1 Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae 13 Đồ án tốt nghiệp Chi: Escherichia Loài: E Coli 1.7.2.2 Đặc điểm Hình thái đặc điểm nuôi cấy E.coli trực khuẩn Gram âm, di động có lơng quanh thân, số chủng E.coli có vỏ polysaccharide, không sinh bào tử E.coli vi khuẩn hiếu khí kỵ khí khơng bắt buộc, phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường, số phát triển mơi trường tổng hợp đơn giản Thường sống ruột già người động vật theo phân Đây vi sinh vật có khả phát triển nhiệt độ từ – 500C Nhiệt độ thích hợp 370C, pH tối ưu 4,4, phát triển mạnh môi trường Mac Conkey, EMB Trên môi trường EMB, E coli cho khuẩn lạc có màu ánh kim, trịn, bờ đều, đường kính khoảng lớn 0,5µm Trong môi trường lỏng, E coli làm đổi màu môi trường, sinh làm đục mơi trường Đặc tính sinh hóa E.coli lên men nhiều loại đường sinh axit sinh như: Glucose, lactose, ramnose; khử nitrat thành nitric, gây nhầy nhớt hư hỏng thực phẩm, indol dương tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính 1.7.2.3 Yếu tố độc lực Nhóm STEC STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), gọi Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm không phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Trong Stx1 có tính bảo tồn cao Stx2 thay đổi trình tự, tạo nhiều subtype Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g Một dịng STEC sản sinh Stx1, Stx2 Stx1 Stx2, chí nhiều dạng Stx2 Nhóm EPEC Các yếu tố độc lực bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần thiết cho việc tạo tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP ( 14 Đồ án tốt nghiệp bundle – forming pilus ), PER ( plasmid – encoded regulator ) Ler ( LEE – encorded regulator) Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG MAP (mitochondria – associated protein), EAST – có khả phá hủy tế bào biểu mô CDT ( Cytolethan distending toxin ) Nhóm ETEC Nhóm ETEC có hai nhóm định độc lực độc tố ruột (enterotoxin) yếu tố định vị (colonization factor – CF) Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC gồm E Coli tạo hai loại độc tố đường ruột ST LT ETEC gây bệnh cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non tiết độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua tiết độc tố đường ruột LT ST E.Coli nhóm tiết độc tố LT, tiết ST, tiết LT ST Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT E.Coli oligopeptide có liên hệ gần gũi mặt cấu trúc chức với độc tố tả (cholera toxin - CT) Vibrio cholerae tiết LT CT giống nhiều đặc tính cấu trúc, trình tự acid amin (giống khoảng 80%), tương đồng receptor, hoạt tính enzym, tác động thú hay nuôi cấy tế bào Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ cầu nối disulfur giải thích cho khả chịu nhiệt độc tố ST chia thành nhóm STa STb, khác cấu trúc chế hoạt động Gen mã hóa cho nhóm tìm thấy chủ yếu plasmid vài gen mã hóa ST tìm thấy transposon Sta (hay gọi ST-I) tạo ETEC vài vi khuẩn Gram âm khác Yersinia enterocolitica V cholerae non – O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 EAEC Gần đây, cịn có báo cáo cho vài dịng ETEC sản sinh độc tố EAST1 ngồi độc tố STa Cịn STb tìm thấy ETEC 15 Đồ án tốt nghiệp Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính cư trú lớp màng nhầy ruột nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông bề mặt vi khuẩn, gọi yếu tố định vị (CF) Gen CFA thường mã hóa plasmid, nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT Nhóm EAEC Những yếu tố độc lực EAEC bao gồm diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hịa bám dính kết tập aggR, protein Pet độc tố EAST – (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1) AFF xem yếu tố định độc lực Nhóm EYIC EIEC gây bệnh chủ yếu khả xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Khả xâm nhập mã hóa gen plasmid 140 MDa Các gen plasmid mã hóa cho kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa : Invasion plasmid antigen) EIEC cịn có khả sản xuất độc ruột giống số Shigella Gen mã hóa cho độc tố có tên sen (Shigella enterotoxin), chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu túi thực bào nhân lên bào tương, phá hủy tế bào xâm lấn sang tế bào khác 1.7.2.3 Khả gây bệnh Khả gây bệnh đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với thể yếu gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy - Bệnh tiêu chảy E.coli - Các nhiễm khuẩn khác E.coli E coli gây nên nhiễm khuẩn đường tiết niệu: ứ động nước tiểu sỏi, thai nghén tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu dễ xảy Mặt khác, thông niệu đạo, người ta gây nhiễm khuẩn ngược dịng 16 Đồ án tốt nghiệp E coli gây nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn gan mật, viêm màng não trẻ bú, nhiễm khuẩn huyết 1.7.3 Giới thiệu Listeria monocytogenes [3][4][5][7] 1.7.3.1 Lịch sử phát L monocytogenes lần mô tả E.G.D Murray vào năm 1926 dựa sáu trường hợp đột tử trẻ Murray giới thiệu Vi khuẩn monocytogenes trước JH Harvey Pirie thay đổi tên chi Listeria năm 1940 Mãi năm 1981 L monocytogenes xác định nguyên nhân gây bệnh từ thực phẩm Listeria xem vấn đề nghiêm trọng nhiễm vào sản phẩm thịt thịt gia cầm vào năm 1980 Năm 1999, loài L monocytogenes đặc biệt cực độc tiến triển báo động viên chức y tế họ buộc nhà sản xuất thực phẩm phải giải vấn đề Năm 2006, nỗ lực bảo vệ cộng đồng, Cơ quan lương thực dược phẩm FDA phê chuẩn tán thành việc sử dụng thuốc xịt khử trùng giúp giảm nhiễm khuẩn sản phẩm thịt thịt gia cầm chế biến sẵn Thuốc phun bao gồm hỗn hợp gồm loại virus vô hại diệt khuẩn L monocytogenes 1.7.3.2 Phân loại Theo George M Garrity, Julia A.Bell Timothy G.Lilburn, phân loại học Listeria spp Trong giới vi sinh vật sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Listeriaceae Giống: Listeriaceae Lúc đầu Listeria biết đến với hay hai loài chủ yếu Listeria monocytogenes, sau xác định lồi gồm: Listeria monocytogenes 17 Đồ án tốt nghiệp Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria ivanovii Listeria grayi Listeria welshimeri Đến có lồi L monocytogenes cho thấy tác nhân gây bệnh cho người động vật, L invanovii chi gây bệnh cho động vật đặc biệt thú 1.7.3.3 Đặc điểm Hình 1.4: L monocytogenes Đặc điểm chung L monocytogenes trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi phát triển nhiệt độ từ - 45oC, khơng tạo bào tử có chuyển động điển hình cấy nhiệt độ 20 - 25oC phát triển tế bào Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 12µm Phản ứng catalase dương tính, sau nhuộm Gram ta thấy tế bào hình que riêng lẻ tế bào nối với thành chuỗi tế bào Vi khuẩn tồn pH rộng từ 4,3 - 9,6 18 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5: Tế bào vi khuẩn L monocytogenes Gram (+) Vi khuẩn L monocytogenes sống dai khác với đa số vi khuẩn khác L monocytogenes tăng trưởng chậm tủ lạnh nhiệt độ 4°C Hiện nhà khoa học cho đường nhiễm L monocytogenes phổ biến qua thực phẩm Đặc điểm sinh hóa Tùy lồi hay kiểu huyết mà Listeria spp có biểu sinh hóa khác Đặc điểm sinh hóa chung Listeria spp thể sau Bảng 1.4: Đặc điểm sinh hóa số lồi Listeria Loài Acid sản sinh từ -Hemolysis1 Manitol Rhamnose Xylose + - + - Độc tính2 + + - - + + - - V4 - - - - V4 + - + - - + - V4 - - L monocytogenes L ivanovii L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi + (1) Thử nghiệm môi trường thạch máu cừu (2) Thử nghiệm chuột Những chủng lên men ribose phân thành L ivanovii subsp Invanovii không lên men L ivanovii Lomdiniesis (3) V4: biotypes thay đổi 19 ... tiêu vi sinh vật sản phẩm tôm (TCVN 5289 – 1992) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3: Giới hạn tiêu vi sinh sản phẩm tôm đông lạnh xuất Chỉ tiêu vi sinh Giới hạn TSVKHK (TPC) ≤ 106 CFU/ g sản phẩm Coliform... tài: ? ?Đánh giá tiêu vi sinh sản phẩm tôm tươi chợ Bà Chiểu? ?? Đề tài thực Phịng thí nghiệm Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Cơng nghệ Tp.HCM Mục đích Đồ án tốt nghiệp. .. mẫu tôm, đánh giá số tiêu vi sinh vật mẫu tôm quầy chợ Bà Chiểu Mục tiêu đề tài: - Khảo sát mức độ nhiễm tồng vi sinh vật hiếu khí (TPC), Coliforms, E.Coli, Listeria monocytogenes mẫu tôm tươi