BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ BASA NGÀ[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ BASA NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN SINH VIÊN THỰC HIỆN MSSV : 107111115 : TRẦN TÚ NHI LỚP : 07DSH3 TP HỒ CHÍ MINH, 2011 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến MỞ ĐẦU A TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI : Trong sản xuất đời sống, loại enzyme nói chung protease nói riêng sử dụng ngày phổ biến Chế phẩm protease sản xuất chủ yếu nhờ vi sinh vật, số có nguồn gốc từ thực vật, mơ động vật Gần đây, yêu cầu vệ sinh an tồn thực phẩm ngày nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng ngày cao Trong chế phẩm protease thu nhận từ mơ động vật thực vật coi tuyệt đối an toàn nên ngày thu hút quan tâm phịng thí nghiệm nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày khan không kinh tế nội tạng động vật thường dùng làm thực phẩm dùng để ghép tạng cho bệnh nhân đặc biệt Protease thể cá, đặc biệt quan tiêu hóa biết đến từ lâu lại chưa nghiên cứu đầy đủ chưa có cơng nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá Vì vậy, cơng trình nghiên cứu protease nội tạng phương pháp chiết rút chúng riết tiến hành nhiều nước có nghề cá phát triển Việt Nam quốc gia có nghề cá phát triển, với 200 lồi cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm Tuy sản lượng lớn phần sử dụng hữu ích từ cá chiếm khoảng gần 50% Nghĩa hàng năm có 700.000 phế liệu, có 30.000 nội tạng cá Theo thói quen, nội tạng cá sử dụng làm bột cá chăn nuôi, phần chế biến nước mắm, phần lớn bị thải bỏ vào mơi trường vừa lãng phí vừa nguồn gây nhiễm mơi trường Tình hình đặt yêu cầu cấp bách cho nhà khoa học sử dụng hợp lý hiệu lượng phế liệu cá lớn nhà máy chế biến cá tạo hàng ngày để sản xuất sản phẩm mới, có giá trị cao SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Với mong muốn góp phần giải yêu cầu trên, em thực đề tài “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá Basa” MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU : B Mục đích chung nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme từ nội tạng cá, tính chất enzyme NỘI DUNG NGHIÊN CỨU : C Xác định quy trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá : - Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu - Xác định dung môi chiết enzyme protease - Xác định thời gian chiết enzyme protease - Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô - Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô - Tinh chế phẩm enzyme thô sắc ký lọc gel - Xác định trọng lượng phân tử phương pháp điện di SDS – PAGE Khảo sát số tính chất enzyme protease nội tạng cá : - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ - Khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease có mặt số ion kim loại, chất đặc hiệu nhóm SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU : D Phương pháp tách chiết, thu nhận tinh enzyme protease : - Chiết rút thu dịch chiết - Thu nhận chế phẩm enzyme protease - Tinh enzyme protease sắc ký lọc gel - Phân tách enzyme protease điện di gel polyacrylamide Các phương pháp phân tích : - Xây dựng đường chuẩn albumin - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford - Xây dựng đường chuẩn tyrosine - Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano KẾT CẤU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP : E Đồ án tốt nghiệp gồm : - Chương : Tổng quan tài liệu - Chương : Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Chương : Kết thảo luận - Chương : Kết luận đề nghị SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp 1.1 GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME : 1.1.1 Giới thiệu chung enzyme : Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein Enzyme tham gia xúc tác cho hầu hết phản ứng hóa học xảy thể sống, đảm bảo cho trình chuyển hóa chất thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều hướng xác định Do đảm bảo cho tồn thể sống Hiện người ta khám phá 2000 enzyme 200 enzyme thu dạng tinh thể Enzyme ngày ứng dụng rộng rãi có hiệu lĩnh vực y dược, chăn nuôi, thú y, số ngành công nghiệp đặc biệt công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm… 1.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme : 1.1.2.1 Bản chất enzyme : Enzyme protein có hoạt tính sinh học nên có đủ tính chất protein Giống với protein hình hạt khác, enzyme hịa tan nước, dung dịch đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý… Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo ưa nước Enzyme dung dịch dễ dàng bị kết tủa tác dụng muối trung hịa sulphatamon dung mơi hữu ethanol, acetone nhiệt độ thấp không bị hoạt tính xúc tác Do đó, dùng tác nhân để thu chế phẩm enzyme Ngược lại tác dụng yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị khả xúc tác Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính phân tử protein – enzyme 1.1.2.2 Cấu trúc enzyme : Phân tử enzyme thành phần hai thành phần chứa phần protein Enzyme cấu tử thành phần phân tử có protein Enzyme hai cấu tử thành phần cấu tạo gồm : protein (“feron” “apoenzyme”) phi protein (“agon” “coenzyme”) Trung tâm hoạt tính enzyme chiếm phần SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến nhỏ với phân tử enzyme có vai trị quan trọng việc tham gia kết hợp đặc hiệu với chất trình xúc tác Ở enzyme cấu tử, trung tâm thường bao gồm tổ hợp nhóm chức acid amin liên kết lại với Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 nhóm nằm cách xa mạch polypeptide, xoắn cuộn mạch mà gần Với enzyme hai cấu tử, ngồi số nhóm chức acid amin cịn có nhóm ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme 1.1.3 Danh pháp phân loại enzyme : Theo quy ước quốc tế, tên enzyme thường gọi theo chất đặc hiệu chúng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo tên enzyme thường có hai phần : phần đầu tên chất, phần sau khái quát thân phản ứng Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế thống phân loại enzyme làm lớp sau : - Oxydoreductase : enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử - Transpherase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị - Hydrolase : enzyme xúc tác cho trình thủy phân - Liase : enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước - Isomerase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp galactose glucose - Ligase : enzyme xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic tạo thành oxaloacetic acid 1.1.4 Cơ chế tác dụng enzyme : Bản chất phản ứng enzyme có tham gia xúc tác enzyme, chất hoạt hóa mạnh, từ làm thay đổi tính chất hóa học chất, kết sau phản ứng tạo sản phẩm phản ứng Do tác dụng SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến enzyme chất có thay đổi khơng cấu trúc hóa học, mà cịn thay đổi tính chất hóa học Q trình xúc tác enzyme xảy giai đoạn : - Giai đoạn thứ : enzyme kết hợp với chất liên kết yếu, nhờ tạo phức hệ enzyme – chất Phức hệ thường không bền Phản ứng tạo phức hệ enzyme – chất thường xảy nhanh địi hỏi lượng - Giai đoạn thứ hai : chất tạo phức với enzyme bị thay đổi cấu hình khơng gian, mức độ bền vững liên kết Kết liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm - Giai đoạn thứ ba : giai đoạn cuối cùng, sản phẩm tạo thành tách khỏi enzyme Cơ chế xúc tác tổng quát enzyme trình bày sau : E + S ES E + P E : enzyme ; S : chất ; ES : Phức hệ enzyme – chất ; P : Sản phẩm 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme : Phản ứng enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố : chất nồng độ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, ion kim loại, chất vơ hữu khác ( có tác dụng kìm hãm hay hoạt hóa enzyme) 1.1.5.1 Ảnh hưởng nồng độ chất : Ở giai đoạn đầu phản ứng, nồng độ chất thấp, tốc độ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất Khi nồng độ chất đủ lớn cho tất nồng độ enzyme tham gia phản ứng để tạo phức hợp enzyme – chất, phản ứng tạo vận tốc cực đại Nhưng tiếp tục tăng nồng độ chất lên tốc độ phản ứng khơng tăng 1.1.5.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme : Nói chung, điều kiện thừa chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nhưng tăng nồng độ enzyme lớn, tốc độ phản ứng tăng chậm không tăng SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến 1.1.5.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm chất hoạt hóa : Hoạt tính enzyme thay đổi tác dụng số chất vô hữu khác Các chất làm tăng, làm giảm hoạt tính enzyme Tác dụng chúng đặc hiệu không đặc hiệu thay đổi tùy chất, enzyme khác Chất kìm hãm (chất ức chế) chất có mặt phản ứng enzyme làm cho enzyme bị giảm hoạt tính khơng bị chuyển hóa enzyme Các chất ion, phân tử vơ cơ, hữu kể protein, kìm hãm thuận nghịch không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh Khi biết tác dụng ức chế chất loại enzyme phản ứng cụ thể ta điều chỉnh phản ứng Chất hoạt hóa chất làm tăng hoạt tính xúc tác enzyme Các chất thường có chất hóa học khác nhau, anion, ion kim loại chất hữu Chất hoạt hóa làm tăng hay phục hồi hoạt tính enzyme cách trực tiếp hay gián tiếp Cơ chế kích hoạt có chất tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính enzyme, làm thay đổi cấu hình khơng gian theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác cho gián tiếp thông qua việc loại trừ chất ức chế khỏi hỗn hợp phản ứng, không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme 1.1.5.4 Ảnh hưởng pH mơi trường : pH mơi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất, ion hóa enzyme độ bền protein – enzyme pH thích hợp phần lớn enzyme pH thích hợp enzyme cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác đặc tính nồng độ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng… 1.1.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ : Do chất hóa học enzyme protein nên khác với phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng lên tăng nhiệt độ giới hạn định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho thấy nhiệt độ thích hợp nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500C, 500C hoạt tính thường bị giảm mạnh làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme Các enzyme có nguồn gốc thực vật số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao Nhiệt độ thích hợp enzyme cịn phụ thuộc vào yếu tố khác : thời gian xác định hoạt tính, pH… Ở nhiệt độ thấp 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, hồi phục đưa nhiệt độ bình thường Ở nhiệt độ 700C, phần lớn enzyme bị hồn tồn hoạt tính, gọi nhiệt độ tới hạn Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hồi phục hoạt tính trở lại 1.1.5.6 Ảnh hưởng ion kim loại : Các ion kim loại kìm hãm hoạt hóa enzyme Các ion kim loại nặng nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm khơng thuận nghịch enzyme Tác dụng ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ chúng, mức độ hoạt hóa tăng theo nồng độ ion kim loại nồng độ thấp giới hạn xác định, vượt nồng độ lại có tác dụng kìm hãm enzyme Giới hạn nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme ion kim loại khác nhau, nồng độ, điều kiện phản ứng, enzyme, hai ion có tác dụng trái ngược Hiện tượng thường xảy ion hóa trị 1.2 ENZYME PROTEASE VÀ LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU : 1.2.1 Giới thiệu chung : Protease nhóm enzyme có khả xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptide phân tử protein Trong thể cá sống protease tác nhân xúc tác trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống cá Sau cá chết, khả xúc tác trình thủy phân enzyme SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến nguyên nhân gây biến đổi thịt cá sau chết, tách khỏi thể cá protease giữ khả xúc tác trình thủy phân Do đó, cần nghiên cứu đặc tính protease nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme từ phế liệu cá công nghiệp chế biến thủy sản, tạo sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá 1.2.2 Phân loại enzyme protease : Theo Baret Donald (1986) protease chia thành hai nhóm lớn endopeptiase (proteinase) exopeptidase Nhóm endopeptiase Là enzyme phân giải liên kết chuỗi mạch polypeptide Theo phân loại Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa Sinh quốc tế, enzyme nhóm gồm phân nhóm : - Phân nhóm : Proteinase – xerin : gồm enzyme tripsin, chimotripsin - Phân nhóm : proteinase – xistein hay proteinase – thiol : gồm enzyme cathepsin - Phân nhóm : aspactic – protease hay protease acid : gồm enzyme pepsin, gastricsin… - Phân nhóm : metalo – proteinase colagenase, calpain… Nhóm exopeptidase : Là enzyme thủy phân liên kết peptide đầu mút chuỗi mạch peptide Các enzyme thuộc nhóm gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase, dipeptidase Các exopeptidase khơng có khả thủy phân liên kết peptide trung tâm mà tác dụng thủy phân liên kết chuỗi polypeptide, đầu amin, đầu cacboxyl, tách acid amin khỏi chuỗi polypeptide 1.2.3 Protease nội tạng cá động vật thủy sản : Hệ tiêu hóa cá gồm nhiều phận khác Mỗi phận có chức đặc điểm riêng q trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn Do đó, hệ enzyme SVTH : Trần Tú Nhi 10 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến protease phận khác Tuy nhiên hoạt tính enzyme chủ yếu diễn dày ruột cá Enzyme dày Dạ dày cá quan có pepsin xúc tác cho q trình thủy phân protein môi trường acid mạnh Trong dày có hai loại enzyme pepsin parapepsin Pepsin enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein dày, sinh tổng hợp tế bào màng nhày dày tiết dạng khơng hoạt tính gọi pepsinogen Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền mơi trường trung tính acid yếu, tác dụng acid clohydric có mặt lượng nhỏ pepsin tự dày, chuyển hóa thành pepsin dạng hoạt tính chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da Pepsin có tác dụng proteinase, transpeptidase esterase chủ yếu có tác dụng endopeptidase thủy phân chủ yếu liên kết peptide sát gốc Lα – acid amin thơm dicacboxyl Enzyme đường ruột Trong màng nhày ruột dịch ruột, người ta xác định có 22 enzyme tham gia vào q trình tiêu hóa thức ăn Trong enzyme protease gồm : enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase, cacboxylpeptidase Enterokinase Là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen chymotripsinogen Enterokinase tổng hợp từ tế bào màng ruột, nhờ tác dụng muối mật mà xâm nhập vào khe ruột hoạt hóa tripsinogen bề mặt màng nhày ruột khoang ruột Dưới tác dụng enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt đoạn acid amin vùng lysin isoleusin chuyển thành dạng hoạt tính Ngồi ra, tuyến tụy cịn tiết lượng enterokinase cân với tripsin để hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin SVTH : Trần Tú Nhi 11 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Chymotripsin Là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử khoảng 25.000 Da gồm chuỗi polypeptide gắn với hai cầu nối sulfua Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide có nhóm – CO - acid amin thơm methionin Nó xúc tác cho phản ứng thủy phân este acid amin Tripsin chymotripsin có khả cắt đứt liên kết mạch polypeptide phân tử protein, kết hoạt tính thủy phân protein chúng tạo thành đoạn polypeptide Các đoạn vào khoang ruột protease khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối acid amin 1.2.4 Lược sử nghiên cứu protease : Loài người sử dụng enzyme protease sản xuất đời sống từ lâu đời trước biết đến chúng 5000 năm trước công nguyên, người sử dụng renin có dày bê chất đông tụ để sản xuất phomat Các thổ dân Nam Mỹ cổ đại sử dụng đu đủ để làm mềm thịt phương pháp kế thừa, phát triển thành kỹ thuật làm mềm thịt nhân tạo papain enzyme protease khác Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông cha ta chế biến nước mắm sở trình tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có sẵn nội tạng thịt cá, điều kiện nồng độ muối cao Đến kỷ 18, Reomur phát dịch dày lồi chim ăn thịt có khả tiêu hóa thịt Năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease dịch vị dày chó Năm 1857, Corvisart tách chế phẩm thơ tripsin từ dịch tụy Năm 1862, Danilevxki tách tripsin amylaza từ tụy tạng Từ năm 50 kỷ 20, nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận ứng dụng enzyme protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển hồn thiện cơng nghệ thu nhận protease từ mô động vật thực vật Từ đến nay, hàng loạt protease từ vi sinh vật, từ động vật thực vật sản xuất ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất đời sống Đặc biệt, năm cuối kỷ 20, đầu kỷ SVTH : Trần Tú Nhi 12 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến 21, công nghệ enzyme phát triển vơ nhanh chóng, loại protease sử dụng hầu hết lĩnh vực sản xuất, đời sống, y học nghiên cứu khoa học Nếu năm 1980, giới sản xuất tiêu thụ khoảng 1300 enzyme loại có protease chiếm 40,7% đến năm 1985, thị trường enzyme giới có sản lượng mua bán 45000 tấn, trị giá gần 650 triệu USD đến năm 1990, doanh thu từ enzyme công nghệ giới đạt 1,5 tỷ USD, thị phần enzyme protease 48% Như có khoảng năm, lượng enzyme sản xuất tiêu thụ tồn giới tăng gấp đơi, lượng enzyme protease chiếm khoảng 50% Các cường quốc sản xuất tiêu thụ enzyme protease công nghiệp Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch, Trung Quốc… hầu hết thuộc nước công nghiệp phát triển Dự báo, kỷ 21, sản xuất tiêu thụ enzyme giới tăng với tốc độ hàng năm khoàng 20% Tuy protease sản xuất từ nhiều nguồn khác năm gần đây, protease sử dụng công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật, protease có nguồn gốc từ thực vật động vật có vị trí thứ yếu 1.3 ỨNG DỤNG PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA CÁ TRONG CHẾ BIẾN THỦY SẢN : 1.3.1 Giới thiệu chung : So với protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật động vật cạn, protease động vật thủy sinh nói chung, cá nói riêng quy mơ cơng nghiệp Những ngun nhân tình trạng là: Nguồn nguyên liệu thủy sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định nên việc cung cấp nguồn thu enzyme khơng ổn định, khó tổ chức sản xuất chế phẩm enzyme quy mô công nghiệp Trong thể động vật thủy sản, quan tập trung enzyme lớn có hoạt tính cao nội tạng nên thường sử dụng làm nguồn thu enzyme Tuy SVTH : Trần Tú Nhi 13 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến nhiên, nội tạng cá thường có mùi hôi, không hấp dẫn công nhân sản xuất, lại khó bảo quản điều kiện tự nhiên Protease động vật thủy sản hệ gồm nhiều loại protease khác Để tách riêng làm tinh enzyme cần trải qua hàng chục bước khác với kỹ thuật phức tạp Chính vậy, nay, thị trường chưa có protease thương mại từ nguyên liệu thủy sản Để phát triển sản xuất chế phẩm enzyme từ thủy sản phải nghiên cứu, hồn thiện cơng nghệ giảm giá thánh sản phẩm Từ năm 50 kỷ trước, nhiều nước phát triển công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Hàng trăm loại chế phẩm protease từ chủng vi sinh vật khác sản xuất mua bán thị trường sản lượng chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục tỷ trọng protease từ vi sinh vật tổng doanh số enzyme thị trường giới mức cao với protease từ nguồn khác Việc sản xuất chế phẩm protease thương mại từ vi sinh vật có ưu điểm : - Có nhiều chủng vi sinh vật có khả tổng hợp protease, chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn, thu nhận enzyme hàng chục lần năm, chủ động nguyên liệu - Có thể dễ dàng điều hịa, định hướng q trình sinh tổng hợp enzyme cần thiết sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc gây đột biến chủng vi sinh vật - Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme môi trường nuôi cấy tổng hợp cao việc thu nhận enzyme thuận lợi - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme hạ Tuy nhiên, việc sử dụng chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme công nghiệp gặp phải số trở ngại Các chủng vi sinh vật protease phải đánh giá, kiểm tra nghiêm ngặt độc tính để bảo đảm an tồn, vệ sinh cho sản phẩm Việc phân tích, kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ SVTH : Trần Tú Nhi 14 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến xác cao nên cần phải có phịng thí nghiệm, phân tích chun dùng, trang bị dụng cụ đại, chi phí đầu tư lớn Trong đó, enzyme protease có nguồn gốc từ động vật thực vật ln đánh giá an tồn, sau thu nhận sử dụng vào q trình chế biến mà khơng cần kiểm tra độc tính Với sản lượng 100 triệu cá biển 30 triệu cá nước năm, giới có tới 6,5 – triệu nội tạng đưa vào để thu nhận enzyme protease, nguồn lợi thu không nhỏ 1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng protease chế biến thủy sản Việt Nam : Đến phạm vi quốc gia, ngành thủy sản chưa có quan, đơn vị chuyên nghiên cứu ứng dụng enzyme chế biến thủy sản Các Viện nghiên cứu, trường đào tạo cán khoa học công nghệ chuyên ngành thủy sản chưa có chương trình nghiên cứu ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thủy sản nói riêng Chính vậy, nói Việt Nam, kết nghiên cứu enzyme cá động vật thủy sinh hướng ứng dụng chúng vào sản xuất đời sống, vào chế biến thủy sản chưa có Những năm gần đây, số nhà khoa học công nghệ bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nỗ lực cá nhân, chưa quan tâm nhiều người, chưa đầu tư tài, lực cho nghiên cứu nên kết bước đầu khiêm tốn Các tài liệu, số liệu enzyme thủy sản ứng dụng enzyme ngành thủy sản nghèo nàn, thiếu hệ thống Tuy nhiên có ngành chế biến có truyền thống lâu đời chế biến nước mắm Các cơng trình nghiên cứu nước mắm đến kết luận nước mắm sản phẩm trình thủy phân protein thịt cá tác dụng hệ enzyme protease thân nguyên liệu Quá trình thủy phân thịt cá enzyme thực điều kiện có muối ăn nồng độ cao, để ngăn hoạt tính vi khuẩn gây thối rữa, tạo thành chất đạm hòa tan, chủ yếu acid amin peptide ngắt mạch Do thủy phân thịt cá hệ enzyme thân nguyên liệu điều kiện muối mặn nên trình chế biến nước mắm điều kiện tự nhiên có thời SVTH : Trần Tú Nhi 15 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến gian dài, từ 10 tháng tới - năm Trong trình lâu dài ấy, đồng thời với q trình thủy phân thịt cá cịn có q trình lên men khác với tham gia hệ vi sinh vật yếm khí hình thành hợp chất bay hơi, acid hữu cơ… Làm cho nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc trưng, có giá trị dinh dưỡng cảm quan đặc biệt Bên cạnh ứng dụng protease chế biến nước mắm, nhà khoa học công nghệ nước ta quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng protease chế biến thủy sản Các lĩnh vực sử dụng protease chế biến thủy sản chủ yếu tập trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu sử dụng phế liệu thủy sản nguồn cá tạp, cá giá trị kinh tế So với kết nghiên cứu enzyme protease thực vật, động vật máu nóng vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm việc nghiên cứu, ứng dụng enzyme protease cá chế biến thủy sản tập trung vào việc tận dụng enzyme protease có sẵn nguyên liệu Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng dụng protease chế biến thủy sản hạn chế, dừng phịng thí nghiệm, chưa chuyển giao cơng nghệ để sản xuất công nghiệp Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản để sử dụng chế biến cung cấp cho ngành khác đặt trực tiếp cấp bách Các cơng trình nghiên cứu protease cá lĩnh vực ứng dụng tăng lên nhanh chóng nhiều nước có nghề cá phát triển Tiềm phát triển sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản ứng dụng để chế biến sản phẩm to lớn Trong thời đại bùng nổ thông tin, hội nhập trao đổi thông tin khẩn trương thuận lợi, nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu thành tựu lĩnh vực để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển nhanh chóng cơng nghệ chế biến thủy sản đất nước SVTH : Trần Tú Nhi 16 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến 1.3.3 Nguồn thu enzyme protease : Enzyme nói chung enzyme protease nói riêng thu nhận chủ yếu từ ba nguồn : mô quan động vật, mô quan thực vật, tế bào vi sinh vật Enzyme tách từ mô : tụy tạng, dày, ruột … số động vật thủy sản (mực , cá…) thường trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin… Từ thực vật thu nhận số enzyme thủy phân : papain từ nhựa đu đủ, bromelin từ thân, vỏ dứa Ngồi cịn thu nhận số enzyme khác : amylase, urease, peroxydase… 1.3.4 Ứng dụng enzyme protease : Enzyme nói chung enzyme protease nói riêng sử dụng theo hai hướng sau : Hướng : Sử dụng trình thủy phân thể Các enzyme enzyme nội bào Chúng tham gia vào trình trao đổi chất tế bào sống, sinh vật chết trình thủy phân protein diễn Như vậy, protease tham gia vào q trình thủy phân protein ngun liệu chứa Việc sử dụng enzyme theo hướng đơn giản, làm tăng hương vị, màu sắc sản phẩm Tuy vậy, sử dụng enzyme loại quy trình chế biến nguyên liệu chứa Hướng : Tách enzyme khỏi nguyên liệu dạng chế phẩm sử dụng chúng vào trình sản xuất Việc tách chiết enzyme dựa vào tính chất chúng : enzyme tan nước, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm Dịch chiết thu chứa enzyme, protein tạp, chất hữu vô nên phải tiến hành tinh để thu chế phẩm Các chế phẩm enzyme sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác a Trong công nghiệp thực phẩm : - Enzyme protease sử dụng chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội SVTH : Trần Tú Nhi 17 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến tạng động vật để thủy phân làm mềm nguyên liệu, thủy phân nguyên liệu tạo thành dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hóa - Trong chế biến nước giải khát, công nghiệp bia, chế phẩm protease sử dụng làm dịch quả, dịch bia - Dùng protease công nghiệp chế biến sữa, làm mát - Protease dùng làm tăng giá trị sản phẩm mặt thương mại sản phẩm có giá trị thấp Ví dụ dùng protease để thủy phân protein phế liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen…) thành dạng hòa tan, thu dịch đạm thủy phân làm thức ăn cho người thức ăn chăn nuôi - Dùng protease để thủy phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá b Trong công nghiệp dệt : Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, khơng ảnh hưởng đến độ bền tơ c Trong công nghệ phim ảnh : Protease sử dụng để sản xuất gellatin bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh ảnh, giấy ảnh phim chụp X – quang d Trong công nghiệp da : Sử dụng protease để tẩy sơ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông thu hồi (tỷ lệ thu hồi tăng 25 – 30 % so với dùng phương pháp hóa học), da có chất lượng cao e Trong cơng nghệ sản xuất xà phịng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm : Protease thêm vào để sản xuất xà phịng, kem đánh răng… có tác dụng tẩy vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt để loại lớp biểu bì chết, làm mịn da f Trong cơng nghiệp dược phẩm : Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa, thuốc tiêu mủ vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm vết thương giảm đau cho người bệnh SVTH : Trần Tú Nhi 18 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến g Trong chế biến thủy sản : Nước mắm hình thành từ trình thủy phân protein thịt cá tác dụng hệ enzyme protease có sẵn nguyên liệu điều kiện muối mặn thời gian dài Người ta sử dụng chế phẩm protease để bổ sung trình sản xuất nước mắm với lượng định nhằm rút ngắn thời gian chế biến Nhờ mà làm tăng hiệu kinh tế, tăng ln chuyển vốn Ngồi ra, người ta cịn sử dụng enzyme protease vào việc sản xuất bột đạm cá, bột đạm hòa tan, … từ loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá tạp…) Sở dĩ làm hướng sản xuất tận dụng phế liệu trình chế biến, tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản phẩm, … đem lại hiệu kinh tế cao 1.4 SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ LỌC GEL : 1.4.1 Bản chất phương pháp : Phương pháp sử dụng để tinh protein, xác định trọng lượng phân tử phân tích định lượng tương tác phân tử Hình 1.1 Tách phân tử lọc gel SVTH : Trần Tú Nhi 19 MSSV : 107111115 ... tài ? ?Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá Basa? ?? MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU : B Mục đích chung nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme. .. enzyme từ nội tạng cá, tính chất enzyme NỘI DUNG NGHIÊN CỨU : C Xác định quy trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá : - Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu - Xác định dung môi chiết enzyme. .. PHÁP NGHIÊN CỨU : D Phương pháp tách chiết, thu nhận tinh enzyme protease : - Chiết rút thu dịch chiết - Thu nhận chế phẩm enzyme protease - Tinh enzyme protease sắc ký lọc gel - Phân tách enzyme