Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá basa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ BASA NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN SINH VIÊN THỰC HIỆN MSSV : 107111115 : TRẦN TÚ NHI LỚP : 07DSH3 TP HỒ CHÍ MINH, 2011 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến MỞ ĐẦU A TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI : Trong sản xuất đời sống, loại enzyme nói chung protease nói riêng sử dụng ngày phổ biến Chế phẩm protease sản xuất chủ yếu nhờ vi sinh vật, số có nguồn gốc từ thực vật, mơ động vật Gần đây, yêu cầu vệ sinh an tồn thực phẩm ngày nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng ngày cao Trong chế phẩm protease thu nhận từ mơ động vật thực vật coi tuyệt đối an toàn nên ngày thu hút quan tâm phịng thí nghiệm nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày khan không kinh tế nội tạng động vật thường dùng làm thực phẩm dùng để ghép tạng cho bệnh nhân đặc biệt Protease thể cá, đặc biệt quan tiêu hóa biết đến từ lâu lại chưa nghiên cứu đầy đủ chưa có cơng nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá Vì vậy, cơng trình nghiên cứu protease nội tạng phương pháp chiết rút chúng riết tiến hành nhiều nước có nghề cá phát triển Việt Nam quốc gia có nghề cá phát triển, với 200 lồi cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm Tuy sản lượng lớn phần sử dụng hữu ích từ cá chiếm khoảng gần 50% Nghĩa hàng năm có 700.000 phế liệu, có 30.000 nội tạng cá Theo thói quen, nội tạng cá sử dụng làm bột cá chăn nuôi, phần chế biến nước mắm, phần lớn bị thải bỏ vào mơi trường vừa lãng phí vừa nguồn gây nhiễm mơi trường Tình hình đặt yêu cầu cấp bách cho nhà khoa học sử dụng hợp lý hiệu lượng phế liệu cá lớn nhà máy chế biến cá tạo hàng ngày để sản xuất sản phẩm mới, có giá trị cao SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Với mong muốn góp phần giải yêu cầu trên, em thực đề tài “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá Basa” MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU : B Mục đích chung nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme từ nội tạng cá, tính chất enzyme NỘI DUNG NGHIÊN CỨU : C Xác định quy trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá : - Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu - Xác định dung môi chiết enzyme protease - Xác định thời gian chiết enzyme protease - Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô - Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô - Tinh chế phẩm enzyme thô sắc ký lọc gel - Xác định trọng lượng phân tử phương pháp điện di SDS – PAGE Khảo sát số tính chất enzyme protease nội tạng cá : - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ - Khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn - Khảo sát biến đổi hoạt tính enzyme protease có mặt số ion kim loại, chất đặc hiệu nhóm SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU : D Phương pháp tách chiết, thu nhận tinh enzyme protease : - Chiết rút thu dịch chiết - Thu nhận chế phẩm enzyme protease - Tinh enzyme protease sắc ký lọc gel - Phân tách enzyme protease điện di gel polyacrylamide Các phương pháp phân tích : - Xây dựng đường chuẩn albumin - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford - Xây dựng đường chuẩn tyrosine - Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano KẾT CẤU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP : E Đồ án tốt nghiệp gồm : - Chương : Tổng quan tài liệu - Chương : Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Chương : Kết thảo luận - Chương : Kết luận đề nghị SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp 1.1 GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME : 1.1.1 Giới thiệu chung enzyme : Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein Enzyme tham gia xúc tác cho hầu hết phản ứng hóa học xảy thể sống, đảm bảo cho trình chuyển hóa chất thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều hướng xác định Do đảm bảo cho tồn thể sống Hiện người ta khám phá 2000 enzyme 200 enzyme thu dạng tinh thể Enzyme ngày ứng dụng rộng rãi có hiệu lĩnh vực y dược, chăn nuôi, thú y, số ngành công nghiệp đặc biệt công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm… 1.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme : 1.1.2.1 Bản chất enzyme : Enzyme protein có hoạt tính sinh học nên có đủ tính chất protein Giống với protein hình hạt khác, enzyme hịa tan nước, dung dịch đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý… Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo ưa nước Enzyme dung dịch dễ dàng bị kết tủa tác dụng muối trung hịa sulphatamon dung mơi hữu ethanol, acetone nhiệt độ thấp không bị hoạt tính xúc tác Do đó, dùng tác nhân để thu chế phẩm enzyme Ngược lại tác dụng yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị khả xúc tác Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính phân tử protein – enzyme 1.1.2.2 Cấu trúc enzyme : Phân tử enzyme thành phần hai thành phần chứa phần protein Enzyme cấu tử thành phần phân tử có protein Enzyme hai cấu tử thành phần cấu tạo gồm : protein (“feron” “apoenzyme”) phi protein (“agon” “coenzyme”) Trung tâm hoạt tính enzyme chiếm phần SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến nhỏ với phân tử enzyme có vai trị quan trọng việc tham gia kết hợp đặc hiệu với chất trình xúc tác Ở enzyme cấu tử, trung tâm thường bao gồm tổ hợp nhóm chức acid amin liên kết lại với Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 nhóm nằm cách xa mạch polypeptide, xoắn cuộn mạch mà gần Với enzyme hai cấu tử, ngồi số nhóm chức acid amin cịn có nhóm ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme 1.1.3 Danh pháp phân loại enzyme : Theo quy ước quốc tế, tên enzyme thường gọi theo chất đặc hiệu chúng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo tên enzyme thường có hai phần : phần đầu tên chất, phần sau khái quát thân phản ứng Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế thống phân loại enzyme làm lớp sau : - Oxydoreductase : enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử - Transpherase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị - Hydrolase : enzyme xúc tác cho trình thủy phân - Liase : enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước - Isomerase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp galactose glucose - Ligase : enzyme xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic tạo thành oxaloacetic acid 1.1.4 Cơ chế tác dụng enzyme : Bản chất phản ứng enzyme có tham gia xúc tác enzyme, chất hoạt hóa mạnh, từ làm thay đổi tính chất hóa học chất, kết sau phản ứng tạo sản phẩm phản ứng Do tác dụng SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến enzyme chất có thay đổi khơng cấu trúc hóa học, mà cịn thay đổi tính chất hóa học Q trình xúc tác enzyme xảy giai đoạn : - Giai đoạn thứ : enzyme kết hợp với chất liên kết yếu, nhờ tạo phức hệ enzyme – chất Phức hệ thường không bền Phản ứng tạo phức hệ enzyme – chất thường xảy nhanh địi hỏi lượng - Giai đoạn thứ hai : chất tạo phức với enzyme bị thay đổi cấu hình khơng gian, mức độ bền vững liên kết Kết liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm - Giai đoạn thứ ba : giai đoạn cuối cùng, sản phẩm tạo thành tách khỏi enzyme Cơ chế xúc tác tổng quát enzyme trình bày sau : E + S  ES  E + P E : enzyme ; S : chất ; ES : Phức hệ enzyme – chất ; P : Sản phẩm 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme : Phản ứng enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố : chất nồng độ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, ion kim loại, chất vơ hữu khác ( có tác dụng kìm hãm hay hoạt hóa enzyme) 1.1.5.1 Ảnh hưởng nồng độ chất : Ở giai đoạn đầu phản ứng, nồng độ chất thấp, tốc độ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất Khi nồng độ chất đủ lớn cho tất nồng độ enzyme tham gia phản ứng để tạo phức hợp enzyme – chất, phản ứng tạo vận tốc cực đại Nhưng tiếp tục tăng nồng độ chất lên tốc độ phản ứng khơng tăng 1.1.5.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme : Nói chung, điều kiện thừa chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nhưng tăng nồng độ enzyme lớn, tốc độ phản ứng tăng chậm không tăng SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến 1.1.5.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm chất hoạt hóa : Hoạt tính enzyme thay đổi tác dụng số chất vô hữu khác Các chất làm tăng, làm giảm hoạt tính enzyme Tác dụng chúng đặc hiệu không đặc hiệu thay đổi tùy chất, enzyme khác Chất kìm hãm (chất ức chế) chất có mặt phản ứng enzyme làm cho enzyme bị giảm hoạt tính khơng bị chuyển hóa enzyme Các chất ion, phân tử vơ cơ, hữu kể protein, kìm hãm thuận nghịch không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh Khi biết tác dụng ức chế chất loại enzyme phản ứng cụ thể ta điều chỉnh phản ứng Chất hoạt hóa chất làm tăng hoạt tính xúc tác enzyme Các chất thường có chất hóa học khác nhau, anion, ion kim loại chất hữu Chất hoạt hóa làm tăng hay phục hồi hoạt tính enzyme cách trực tiếp hay gián tiếp Cơ chế kích hoạt có chất tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính enzyme, làm thay đổi cấu hình khơng gian theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác cho gián tiếp thông qua việc loại trừ chất ức chế khỏi hỗn hợp phản ứng, không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme 1.1.5.4 Ảnh hưởng pH mơi trường : pH mơi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất, ion hóa enzyme độ bền protein – enzyme pH thích hợp phần lớn enzyme pH thích hợp enzyme cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác đặc tính nồng độ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng… 1.1.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ : Do chất hóa học enzyme protein nên khác với phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng lên tăng nhiệt độ giới hạn định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho thấy nhiệt độ thích hợp nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500C, 500C hoạt tính thường bị giảm mạnh làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme Các enzyme có nguồn gốc thực vật số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao Nhiệt độ thích hợp enzyme cịn phụ thuộc vào yếu tố khác : thời gian xác định hoạt tính, pH… Ở nhiệt độ thấp 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, hồi phục đưa nhiệt độ bình thường Ở nhiệt độ 700C, phần lớn enzyme bị hồn tồn hoạt tính, gọi nhiệt độ tới hạn Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hồi phục hoạt tính trở lại 1.1.5.6 Ảnh hưởng ion kim loại : Các ion kim loại kìm hãm hoạt hóa enzyme Các ion kim loại nặng nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm khơng thuận nghịch enzyme Tác dụng ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ chúng, mức độ hoạt hóa tăng theo nồng độ ion kim loại nồng độ thấp giới hạn xác định, vượt nồng độ lại có tác dụng kìm hãm enzyme Giới hạn nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme ion kim loại khác nhau, nồng độ, điều kiện phản ứng, enzyme, hai ion có tác dụng trái ngược Hiện tượng thường xảy ion hóa trị 1.2 ENZYME PROTEASE VÀ LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU : 1.2.1 Giới thiệu chung : Protease nhóm enzyme có khả xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptide phân tử protein Trong thể cá sống protease tác nhân xúc tác trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống cá Sau cá chết, khả xúc tác trình thủy phân enzyme SVTH : Trần Tú Nhi MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Fe 26,06 39,71 21,07 55,22 65,13 37,46 Ca 40,00 45,58 22,10 84,75 74,75 39,30 EDTA 31,65 28,99 30,59 67,05 47,54 54,40 Pb 34,96 32,76 22,08 74,07 53,73 39,26 Mg 31,91 30,82 61,79 67,61 50,55 109,87 140 % hoạt tính enzyme 120 100 Tủa muối 80 Tủa cồn 60 Tủa acetone 40 20 H2O Mn CN Cu Hg Zn Ba Mo Fe Ca EDTA Pb Mg Hình 3.14 Ảnh hưởng ion kim loại chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính protease chế phẩm thô Kết thực nghiệm cho thấy : Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính protease chế phẩm thơ Tất chất thêm vào trình ủ làm giảm (ức chế) hay tăng (kích thích) hoạt tính protease nội tạng Trong Mn, Cu, Mg có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme Tuy nhiên mức độ tăng lên khơng nhiều, cao mẫu đối chứng – 15% Bên cạnh đó, kim loại Pb, Fe, Zn lại làm giảm hoạt tính enzyme SVTH : Trần Tú Nhi 80 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến 3.4 TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME THÔ BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL : Kết trình tinh chế phẩm enzyme thô sắc ký lọc gel thể Hình 3.15 , Hình 3.16 Hình 3.17 Sắc ký dùng để tinh enzyme dùng : - Gel Sephadex G - 50 - Cột 50 x 1,5 cm - Thể tích mẫu : ml - Tốc độ dòng chảy : 0,14 ml /phút - Phân đoạn 2ml - Đo OD bước sóng 280 nm Hình 3.15 Sắc ký tủa ethanol SVTH : Trần Tú Nhi 81 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Hình 3.16 Sắc ký tủa acetone SVTH : Trần Tú Nhi 82 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Hình 3.17 Sắc ký tủa muối (NH4)2SO4 Dựa vào sắc ký đồ, ta thu kết sau :  Ở sắc ký tủa muối, ta thu peak : Peak gồm phân đoạn 17 – 22, peak gồm phân đoạn 23 – 31, peak gồm phân đoạn 43 – 61  Ở sắc ký tủa cồn, ta thu peak : Peak gồm phân đoạn 17 – 22, peak gồm phân đoạn 23 – 32, peak gồm phân đoạn 43 – 60  Ở sắc ký tủa acetone, ta thu peak : Peak gồm phân đoạn 17 – 22, peak gồm phân đoạn 23 – 31, peak gồm phân đoạn 38 – 61 Qua ta xác định kết trình tinh enzyme protease từ nội tạng Kết trình tinh thể qua Bảng 3.15 SVTH : Trần Tú Nhi 83 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.15 GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Kết tinh enzyme protease Tổng Enzyme hàm lượng (mg) Trước sắc ký Sau sắc ký Tổng hoạt tính (U) HTR (U/mg) Độ tinh (lần) Hiệu suất (%) 223,529 1401,592 6,27 100 Cồn 46,44 753,3 16,22 2,59 53,75 Acetone 43,84 632,47 14,43 2,30 45,13 Muối 56,65 621,05 10,96 1,75 44,31 Qua bảng số liệu kết tinh protease Các giá trị tổng hàm lượng hoạt tính mẫu quy đổi thể tích dịch chiết thô ban đầu Cụ thể hàm lượng hoạt tính xét tính 20 ml dịch chiết thơ ban đầu Khi tính tốn ta gộp chung kết ba peak vào để tính tổng hàm lượng tổng hoạt tính Kết sau : Sau trình tinh enzyme protease sắc ký lọc gel, ta thấy hoạt tính riêng enzyme tăng lên nhiều Hoạt tính riêng tủa enzyme ethanol tăng cao 2,59 lần, tủa acetone tăng lên 2,30 lần, cuối tủa muối amoni sulphate tăng lên 1,75 lần so với sản phẩm thô ban đầu Hiệu suất thu hồi enzyme đạt, hiệu suất thu hồi enzyme tốt tủa ethanol, cho hiệu suất thu hồi 53,75%, tủa acetone 45,13%, cuối tủa muối amoni sulphate với hiệu suất thu hồi 44,31% SVTH : Trần Tú Nhi 84 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến 3.5 KẾT QUẢ ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE : Da 209.000 124.000 80.000 49.100 34.800 28.900 20.600 7.100 Hình 3.18 Kết chạy điện di mẫu protein Dịch điện di chuẩn bị sau : Giếng : Thang chuẩn Giếng : Tủa muối Giếng : Tủa cồn Giếng : Tủa acetone SVTH : Trần Tú Nhi 85 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.16 Giá trị Rf log (trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn Rf (Thang 0,097 0,177 0,306 0,371 0,452 0,532 0,613 0,710 80000 49100 34800 28900 20600 7100 4,90 4,69 4,54 4,46 4,31 3,85 chuẩn) MW (Da) 209000 124000 Log(MW) 5,32 5,09 Hình 3.19 Đồ thị biễu diễn tương quan log(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với Rf Tiến hành xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính liên quan giá trị Rf log(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn phần mềm Excel ta phương trình sau : Y = -2.166X + 5.529 SVTH : Trần Tú Nhi 86 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp Trong : GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Y = Log (trọng lượng phân tử) X = Rf : tỷ số khoảng cách di chuyển protein khoảng cách di chuyển phẩm màu brommophenol blue Khoảng cách di chuyển Rf Tủa muối Tủa cồn Tủa acetone 0.113 0.120 0.129 0.371 0.274 0.339 0.452 0.323 0.613 0.355 0.435 Theo kết điện di đồ, xác định trọng lượng phân tử enzyme protease ta  Tủa muối : Với Rf = 0.113 Y = log(MW)  MW = 10y = 10 -2.166x0.113 + 5.529 = 192416,362 Da Tương tự ta có : Với Rf = 0.351  MW = 10y = 10 -2.166x 0.351 + 5.529 = 58712,963 Da Với Rf = 0.452  MW = 10y = 10 -2.166x0.452 + 5.529 = 35478,725 Da Với Rf = 0.613  MW = 10y = 10 -2.166x0.613+ 5.529 = 15894,322 Da SVTH : Trần Tú Nhi 87 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến  Tủa cồn : Với Rf = 0.120  MW = 10y = 10 -2.166x0.120 + 5.529 = 185814,67 Da Với Rf = 0.274  MW = 10y = 10 -2.166x0.274 + 5.529 = 86201,73 Da Với Rf = 0.323 MW = 10y = 10 -2.166x0.323 + 5.529 = 67512,159 Da Với Rf = 0.355  MW = 10y = 10 -2.166x0.355 + 5.529 = 57553,269 Da Với Rf = 0.435  MW = 10y = 10 -2.166x0.435 + 5.529 = 38618,019 Da  Tủa acetone : Với Rf = 0.129 MW = 10y = 10 -2.166x0.129 + 5.529 = 177658,504 Da Với Rf = 0.339 MW = 10y = 10 -2.166x0.339 + 5.529 = 62334,144 Da Nhận xét : Dựa vào kết điện di đồ trọng lượng phân tử protein mẫu tủa muối, tủa cồn, tủa acetone ta kết luận : - Trọng lượng phân tử mẫu tủa muối khoảng 15894,322 - 192416,362 Da - Trọng lượng phân tử mẫu tủa cồn khoảng 38618,019 – 185814,67 Da - Trọng lượng phân tử mẫu tủa acetone khoảng 62334,144 – 177658,504 Da SVTH : Trần Tú Nhi 88 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SVTH : Trần Tú Nhi 89 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp 4.1 GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến KẾT LUẬN : Qua nội dung trình bày, đồ án góp phần làm sáng tỏ thêm nghiên cứu cá Basa Đã xác định điều kiện cho trình chiết rút thu enzyme protease từ nội tạng cá Basa Nước cất dung mơi thích hợp cho việc chiết protease từ nội tạng cá Basa với tỷ lệ dung môi / mẫu / 50 phút cho hoạt tính enzyme cao 195,56 U/g Đã xác định điều kiện cho trình kết tủa thu enzyme protease từ nội tạng cá Basa Dung dịch ethanol tác nhân kết tủa cho chế phẩm enzyme với hoạt tính cao 75,41 U/g với tỷ lệ ethanol / dịch chiết / Đã xác định số tính chất chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá Basa  Protease chế phẩm enzyme từ nội tạng cá Basa có pH hoạt tính tối ưu mơi trường pH =  Hoạt tính chế phẩm enzyme nội tạng cá đạt giá trị cực đại 600C Ở nhiệt độ thấp cao hoạt tính enzyme giảm  Ở nồng độ muối ăn 3% hoạt tính protease chế phẩm enzyme đạt giá trị cực đại Khi nồng độ muối ăn cao hoạt tính enzyme giảm, từ nồng độ muối 7% trở hoạt tính giảm nhanh  Các ion kim loại tác nhân khảo sát làm giảm tăng hoạt tính protease, nói cách khác ức chế kích thích enzyme hoạt tính Trong đó, ion Mn, Cu, Mg có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme; ion Pb, Fe, Zn có ảnh hưởng ức chế hoạt tính enzyme Tinh chế phẩm thô sắc ký lọc gel cho độ tinh từ 1,75 – 2,59 lần cho hiệu suất tinh khoảng 44,31 - 53,75% SVTH : Trần Tú Nhi 90 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Đã xác định trọng lượng phân tử protein enzyme protease khoảng 15894,322 – 192416,362 Da 4.2 ĐỀ NGHỊ : Do thời gian thực có hạn, đề tài thực phần việc nghiên cứu hệ enzyme protease nội tạng cá Basa Nhằm có thêm nhiều thông tin hiểu biết đối tượng :  Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease nhiệt độ thấp để hiểu thêm tính chất enzyme  Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl, ion kim loại chất đặc hiệu nhóm đến hoạt tính protease chế phẩm sau sắc ký  Có điều kiện ứng dụng quy mô lớn để tận dụng phần chất thải nhà máy chế biến thủy sản giải vấn đề ô nhiễm môi trường SVTH : Trần Tú Nhi 91 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy Nguyễn Xuân Sâm (2004).Công nghệ enzyme NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [2] Nguyễn Văn Uyển Nguyễn Tiến Thắng (1999) Những kiến thức công nghệ sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội [3] Nguyễn Đức Lượng (2010) Công nghệ enzyme NXB ĐHQG TP.HCM [4] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003) Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập ) – Thí nghiệm hóa sinh học, NXB ĐHQG TP.HCM [5] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003) Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập 2) – Thí nghiệm hóa sinh học, NXB ĐHQG TP.HCM [6] Phạm Thị Ánh Hồng (2003) Kỹ thuật sinh hóa NXB ĐHQG TP.HCM [7] Đỗ An Ninh (2003) Luận án tiến sĩ Tối ưu hóa q trình phân giải protein protease thịt cá thử nghiệm sản xuất sản phẩm từ protein thủy phân Trường Đại học Thủy sản Nha Trang [8] Nguyễn Tiến Thắng (2003) Một số kỹ thuật phịng thí nghiệm sinh học Viện sinh học nhiệt đới [9] Đỗ Thị Tuyến (2008) Giáo trình thực tập Cơng nghệ enzyme protein Viện sinh học nhiệt đới [10] Phạm Thành Hổ (2005) Nhập môn công nghệ sinh học NXB Giáo dục [11] Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006) Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa Tạp chí phát triển KH&CN, số 11 – 2006, 59 – 67 [12] www.agro.gov.vn [13] www.thongtinthuongmaivietnam.vn [14] www.vietsciences2.free.fr [15] www.faculty.ircc.edu [16] www.sinhhocvietnam.com SVTH : Trần Tú Nhi 92 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến PHỤ LỤC Phụ lục A Đường chuẩn Albumine SVTH : Trần Tú Nhi 93 MSSV : 107111115 Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến Phụ lục B Đường chuẩn Tyrosine SVTH : Trần Tú Nhi 94 MSSV : 107111115 ... tài ? ?Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá Basa? ?? MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU : B Mục đích chung nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết tinh enzyme. .. sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease dịch chiết chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa : a Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme protease dịch chiết chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa. .. việc tách chiết tinh enzyme protease từ nội tạng cá ba sa Quá trình nghiên cứu tiến hành theo sơ đồ hình 2.3 Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát trình nghiên cứu Tỷ lệ dung môi : nội tạng Nội tạng cá Nghiền