Nguyễn Văn Bình Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): - NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH TRÍCH LY HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TOÀN PHẦN TRONG NẤM LINH CHI ĐỎ Nguyễn Văn Bình*, Phạm Thị Phương, Nguyễn Tá Lợi Trường Đại học Nơng Lâm - ĐH Thái Ngun TĨM TẮT Nấm Linh chi tồn Trung Quốc Nhật Bản từ hàng ngàn năm nay, loại dược liệu quý từ thiên nhiên sử dụng từ hàng ngàn năm bồi bổ sức khỏe hỗ trợ chữa bệnh Nấm Linh chi nghiên cứu nhiều chúng có chứa chất có hoạt chất sinh học Nấm Linh chi có chứa nhiều hợp chất quý phải kể đến nhóm hợp chất polysaccharide có tác dụng chống ung thư, giảm đường máu, ngăn ngừa thối hóa tế bào, thiết lập hệ thống miễn dịch, giải độc thể Thành phần chủ yếu có nhóm hợp chất polysaccharide gồm hầu hết beta glucan Nghiên cứu thực sở khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi gồm kích thước nguyên liệu, thời gian trích ly, tỷ lệ ngun liệu/dung mơi dung mơi trích ly nước, nhiệt độ trích ly 90oC Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi thu 1,1% so với tổng khối lượng nguyên liệu, kích thước nguyên liệu 0,4 cm, tỷ lệ ngun liệu/dung mơi 1/20, thời gian trích ly cho hàm lượng polysaccharide 0,92% hiệu suất trích ly đạt 83,64% Q trình trích ly hợp chất polysaccharide toàn phần thực phương pháp trích ly sử dụng dung mơi nước nóng áp suất thường Từ khóa: Dịch chiết, hiệu suất trích ly, nấm Linh chi đỏ, polysaccharide, trích ly ĐẶT VẤN ĐỀ* Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) từ lâu coi thảo dược quý có nhiều tác dụng cho sức khỏe [2] Hiện nay, giới Việt Nam nấm Linh chi có nhiều loại nấm Linh chi xanh, nấm Linh chi đỏ, nấm Linh chi vàng, nấm Linh chi trắng, nấm Linh chi tím, nấm Linh chi đen Tuy nhiên, Nấm Linh chi đỏ có chứa nhiều thành phần quý, cung cấp lượng lớn chất có hoạt tính sinh học polysaccharide, triterpenoid, steroid, saponin [3], [4], [6] Trong hoạt chất polysaccharide xem nhóm chất quan trọng có tác dụng chống ung thu, giảm đường máu, ngăn ngừa thối hóa tế bào, thiết lập hệ thống miễn dịch, giải độc thể [5], [7], [8] Việc trích ly hoạt chất nấm Linh chi đỏ phụ thuộc vào nhiều yếu tố dung mơi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, tỷ lệ nguyên liệu dung môi, phương pháp trích ly,… Để trích ly hàm * Tel: 0977 966445, Email: Binhnguyen313@gmail.com lượng polysaccharide cho hiệu suất cao an tồn ứng dụng thực phẩm, dược phẩm dung mơi nước xem tốt nước khơng độc, không dễ cháy, giá thành rẻ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Nấm Linh chi đỏ Viện Khoa học Sự sống Đại học Thái Nguyên cung cấp Phương pháp nghiên cứu Phương pháp bố trí thí nghiệm Xác định thành phần nấm Linh chi đỏ Nấm Linh chi đỏ cắt nhỏ 0,2 cm đưa sấy nhiệt độ 60oC đến độ ẩm đạt - 8%, tiến hành nghiền nhỏ, sau cân 10 g mẫu gói vào giấy lọc cho vào cột chiết, tiến hành chiết dung môi ethanol 85oC Dịch chiết cô chân khơng đến 10 ml, phân tích thành phần polysaccharide tồn phần từ dịch đặc Xác định ảnh hưởng kích thước nguyên liệu Nấm Linh chi đỏ cắt nhỏ theo kích thước 0,2 cm; 0,4 cm; 0,6 cm tiến hành sấy nhiệt độ Nguyễn Văn Bình Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 60oC đến độ ẩm - 8% Cân 10 g mẫu tiến hành trích ly điều kiện dung mơi nước; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15; thời gian trích ly giờ; nhiệt độ trích ly 90oC Dịch trích ly đem lọc chân khơng lần, sau tiến hành đặc chân khơng đến 10 ml Dịch đặc phân tích hàm lượng polysaccharide tồn phần Dựa vào hàm lượng polysaccharide xác định kích thước nguyên liệu thích hợp cho hiệu suất trích ly cao Xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi Nấm Linh chi đỏ cắt nhỏ theo kích thước từ kết thí nghiệm trước; tiến hành sấy nhiệt độ 60oC đến độ ẩm 6-8% Cân 10 g mẫu tiến hành trích ly điều kiện dung mơi nước; thời gian trích ly giờ; nhiệt độ trích ly 90oC; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thay đổi 1/10, 1/15, 1/20, 1/25 Dịch trích ly đem lọc chân khơng lần, sau tiến hành đặc chân khơng đến 10 ml Dịch đặc phân tích hàm lượng polysaccharide toàn phần Dựa vào hàm lượng polysaccharide xác định tỷ lệ ngun liệu/dung mơi thích hợp cho hiệu suất trích ly cao Xác định ảnh hưởng thời gian trích ly Nấm Linh chi đỏ cắt nhỏ theo kích thước từ kết thí nghiệm trước; tiến hành sấy nhiệt độ 60oC đến độ ẩm 6-8% Cân 10 g mẫu đưa trích ly điều kiện dung mơi nước; nhiệt độ trích ly 90oC; tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi chọn từ thí nghiệm trước; thời gian trích ly thay đổi giờ, giờ, Dịch trích ly đem lọc chân khơng lần, sau tiến hành đặc chân khơng đến 10 ml Dịch đặc phân tích hàm lượng polysaccharide tồn phần Dựa vào hàm lượng polysaccharide xác định tỷ lệ ngun liệu/dung mơi thích hợp cho hiệu suất trích ly cao Xác định hàm lượng polysaccharide toàn phần phenol – sunfuric [9] 180(04): - Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị mẫu chuẩn (D – Glucose): - Cân 0,25 g D–Glucose tinh khiết, hòa tan bình định mức 250 ml nước cất dung dịch D–Glucose nồng độ mg/ml Từ dung dịch D – Glucose gốc tiến hành pha dãy mẫu chuẩn cho q trình phân tích có nồng độ 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 µg/ml Mỗi mẫu chuẩn lấy ml vào ống nghiệm, ống thêm ml dung dịch phenol 5% vào 20 ml dung dịch H2SO4 96%, lắc Sau đặt ống nghiệm vào cốc nước đun sôi cách thủy vòng phút, làm lạnh nhiệt độ phịng 30 phút Lấy mẫu 100 µg/ml phân tích UV – VIS chế độ toàn dải, xác định bước sóng dung dịch hấp thụ cực đại 486 nm Tiếp theo đo độ hấp thụ dung dịch chuẩn bước sóng 486 nm dựng đường chuẩn y = ax+b Cách tiến hành Cân lượng xác cao dịch chiết (thường khoảng 0,01 – 0,06 g với mẫu), đưa vào bình định mức 100 ml Định mức đến vạch nước Lấy 4ml dung dịch cao cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 4ml dung dịch phenol 5% 20 ml dung dịch H2SO4 96% lắc Sau đặt ống nghiệm đun cách thủy cốc nước nhiệt độ sôi nước phút, để nguội nhiệt độ phòng 30 phút Các mẫu đem đo độ hấp thụ quang bước sóng 486 nm Cơng thức tính Hàm lượng polysaccharide tồn phần tính theo cơng thức sau: F(%) = Cx10610 10 100% Trong đó: F: Là hàm lượng polysaccharide tồn phần tính theo glucose có mẫu (%) Cx: Là nồng độ polysaccharide tồn phần có mẫu tính theo glucose (µg/ml) Nguyễn Văn Bình Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ h: Độ ẩm nấm Linh chi (được xác định cân hàm ẩm là: 10,6%) m: Là khối lượng mẫu ban đầu (g) 10 10: Là độ pha loãng Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm SPSS 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thành phần hóa học nấm Kết xác định thành phần hóa học nấm Linh chi trình bày bảng Bảng Thành phần hóa học nấm Linh chi Thành phần Nước (%) Polysaccharide (%) Chất khơ hịa tan (oBx) Hàm lượng 7,2 1,1 0,9 Theo tác giả G-Bing hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi từ 1– 1,2%, hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi khô không 0,5% xem tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng dược liệu nấm Linh chi (theo Dược điển Trung Quốc 2005) Qua kết từ bảng cho thấy nấm Linh chi đủ tiêu chuẩn để tiến hành nghiên cứu [1], [10] Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polysaccharide Kích thước nguyên liệu yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly chất nấm Linh chi Bình thường hợp chất giữ tế bào, chúng khó tách khơng có tác động yếu tố bên ngồi Việc cắt nhỏ ngun liệu có tác dụng làm cho tế bào bị phá vỡ, từ giải phóng chất, tạo điều kiện cho trình trích ly dễ dàng triệt để Kết nghiên cứu ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polysaccharide nấm Linh chi thể bảng Từ kết nghiên cứu bảng ta thấy kích thước nguyên liệu lớn hàm lượng 180(04): - polysaccharide thu thấp, nguyên liệu nhỏ hiệu suất trích ly, hàm lượng polysaccharide cao Nguyên liệu có kích thước d = 0,2 cm cho hàm lượng polysaccharide cao đạt giá trị 0,86%, hiệu suất trích ly q trình đạt 78,18% Ngun liệu kích thước 0,4 cm cho hàm lượng polysaccharide đứng thứ hai với giá trị 0,85%, hiệu suất trích ly q trình đạt 77,27% Ngun liệu kích thước d = 0,6 cm cho hiệu suất thấp nhất, hàm lượng polysaccharide đạt 0,83%, với hiệu suất trích ly đạt 75,45%, so với kích thước d = 0,2 cm hàm lượng polysaccharide thu thấp 0,03% Ở kích thước lớn mức độ phá vỡ tế bào ngun liệu thấp, dẫn đến dung mơi khó thấm sâu vào bên nguyên liệu làm cho hiệu trích ly thấp Ngun liệu có kích thước nhỏ dung môi dễ dàng thấm sâu vào tế bào nguyên liệu giúp giải phóng chất hịa tan tế bào ngun liệu ngồi, dẫn đến hiệu trích ly cao Tuy nhiên dựa vào bảng ta thấy hàm lượng polysaccharide kích thước d = 0,2 cm d = 0,4 cm chênh lệch hiệu suất trích ly khơng có chênh lệch Vậy nên để tối ưu q trình trích ly tiết kiệm thời gian lượng để nghiền nhỏ nguyên liệu dễ dàng cho q trình lọc dịch trích ly, chúng tơi lựa chọn ngun liệu kích thước d = 0,4 cm cho thí nghiệm sau Ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến hiệu suất trích ly polysaccharide Lượng dung mơi nhiều hay ảnh hưởng tới trình chiết tách hợp chất nguyên liệu Nếu lượng dung mơi q đủ để thấm ướt ngun liệu hiệu suất trích ly thấp Ngược lại, lượng dung môi nhiều gây hao phí dung mơi, nhiên liệu chi phí khác Vì việc tìm tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi cần thiết cho q trình trích ly Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thể bảng Nguyễn Văn Bình Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 180(04): - Bảng Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polysaccharide Cơng thức Kích thước (cm) Hàm lượng polysacharide (%) Hiệu suất trích ly (%) CT1 0,2 0,86a 78,18 CT2 0,4 0,85a 77,27 CT3 0,6 0,83b 75,45 Ghi chú: Trên cột giá trị mang số mũ khác khơng có ý nghĩa mức ý nghĩa α = 0,05 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất trích ly polysaccharide Cơng Hàm lượng Hiệu suất trích ly (%) Tỷ lệ ngun liệu/dung mơi thức polysacharide (%) CT1 1/10 0,83c 75,45 CT2 1/15 0,85b 78,45 CT3 1/20 0,88a 80,00 CT4 1/25 0,89a 80,91 Ghi chú: Trên cột giá trị mang số mũ khác khơng có ý nghĩa mức ý nghĩa α = 0,05 Bảng Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trích ly polysaccharide Cơng thức CT1 CT2 CT3 CT4 Thời gian (giờ) Hàm lượng polysaccharide (%) 0,83c 0,88b 0,92a 0,93a Hiệu suất trích ly (%) 75,45 80,00 83,64 84,55 Ghi chú: Trên cột giá trị mang số mũ khác khơng có ý nghĩa mức ý nghĩa α = 0,05 Bảng cho thấy tỷ lệ ngun liệu/dung mơi nhỏ hàm lượng polysaccharide thu lớn Nguyên liệu trích ly dung môi nước với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/25 hàm lượng polysaccharide thu cao đạt 0,89%, hiệu suất trích ly 80,91% Tiếp đến tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/20 cho hiệu suất đứng thứ với hàm lượng polysaccharide thu 0,88% Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15 cho hiệu suất đứng thứ với hàm lượng polysaccharide đạt 0,85% Với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 hàm lượng polysaccharide thu thấp đạt 0,83% Tuy nhiên giới hạn định tiếp tục tăng lượng dung mơi vào q trình trích ly hàm lượng polysaccharide thu có tăng khơng có khác biệt CT3 CT4 Khi sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/25 gây tốn kinh tế khó khăn cho trình lọc sau mà hàm lượng polysaccharide thu nhỏ, khơng đáng kể trích ly gần hồn tồn với tỷ lệ ngun liệu/dung mơi 1/20 Để đảm bảo hiệu suất trình trích ly tối thiểu chi phí (nguyên liệu, lượng…) lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 làm kết cho thí nghiệm Ảnh hưởng thời gian trích ly tới hiệu suất trích lypolysaccharide Thời gian trích ly có ảnh hưởng mạnh mẽ tới hiệu trích ly chi phí lượng Nếu thời gian trích ly ngắn hoạt chất giải phóng ít, thời gian trích ly dài lại làm hao tổn lượng, trình sản xuất kéo dài Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát mức thời gian sau giờ, giờ, điều kiện Kết nghiên cứu trình bày bảng Kết bảng cho thấy thời gian trích ly dài hàm lượng polysaccharde hiệu suất trích ly cao Tuy nhiên đến thời gian trích ly định lượng hoạt chất tăng lên chậm khơng tăng Khi trích ly thời gian hàm lượng Nguyễn Văn Bình Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ polysaccharide thu thấp, đạt 0,83% Hàm lượng polysaccharide tăng nhanh trích ly thời gian giờ, với hàm lượng polysaccharide thi 0,88%, đạt hiệu suất trích ly 80% Sau trích ly, lượng polysaccharide thu 0,92% đạt hiệu suất 83,64%, tiếp tục trích ly hàm lượng polysaccharide có tăng khơng có chênh lệch so với trích ly Do trích ly nhiều thời gian thực hiệu suất trích ly khơng khác nhiều so với trích ly Do chúng tơi chọn thời gian trích ly cho hàm lượng polysaccharide 0,92% hiệu suất trích ly đạt 83,64% KẾT LUẬN Kết nghiên cứu ảnh hưởng đến q trình trích ly hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi thu sau: Hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi 1,1% so tổng khối lượng nguyên liệu Một số điều kiện trích ly thích hợp với dung mơi nước kích thước nguyên liệu 0,4 cm, tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi 1/20, thời gian trích ly Với điều kiện trích ly hàm lượng polysaccharide thu 0,92% hiệu suất trích ly đạt 83,64% 180(04): - TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Vũ Duy Khánh (2009), Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi (Ganoderma lucidum), Trường Cao đẳng Kinh tế Công nghệ TP.Hồ Chí Minh, tr 6-7 Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bao X., Liu C., Fang J., Li X., (2001), “Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst”, Carbohydr Res., 332, pp 67–74 Bao X., Wang X., Dong Q., Fang J., Li X., (2002), “Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 59, pp 175–181 Benzie I F F, Wachtel-Galor S., ( 2009), “Biomarkers of long-term vegetarian diets”, Adv Clin Chem., 47, pp.169–220 Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L., (2007), “Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds”, Biotechnol Annu Rev.,13, pp 265–301 Borchers A T., Stern J S., Hackman R M., Keen C L., Gershwin M E (1999), “Minireview: Mushrooms, tumors and immunity”, Proc Soc Exp Biol Med., 221, pp 281–293 Cao L Z, Lin Z B, (2002), “Regulation on maturation and function of dendritic cells by Ganoderma lucidum polysaccharides”, Immunol Lett, 83, pp 163–169 Foster D S and Cornella T S (1961), Colorimetric Method of Analysis, Nostrand Company Inc New Jersey, 08, pp 162 10 Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2005), Chinese Pharmacopoeia Commission, Vol 1, pp 117-118 Nguyễn Văn Bình Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 180(04): - ABSTRACT STUDY ON THE FACTORS AFFECTING THE EXTRACTION OF POLYSACCHARIDE CONTENT FROM RED LINGZHI Nguyen Van Binh*, Pham Thi Phuong, Nguyen Ta Loi TNU - University of Agricalture and Forestry Ganoderma lucidum is a precious medicine from nature that has been used for thousands of years in health and healing support Ganoderma lucidum contains many precious compounds, including the polysaccharide compounds that have anti-cancer effects, reduce blood sugar, prevent cell degeneration, set the immune system, detoxify the body The effects of material size, extraction time and material/solvent ratio on extraction process of polysaccharide content from red lingzhi were studied Selection of the conditions of the extraction processis water and extraction temperature at 90oC The results showed that the concentration of polysaccharide in the red lingzhi was 1.1% compared to the raw material, the material size (0.4 cm), the material/ solvent ratio (1/20), the extraction time (5 hours) for the polysaccharide content of 0.92% and the extraction efficiency is 83.64% Keywords: Extract, extraction efficiency, red lingzhi mushroom, polysaccharides, extraction Ngày nhận bài: 28/12/2017; Ngày phản biện: 22/01/2018; Ngày duyệt đăng: 27/4/2018 * Tel: 0977 966445, Email: Binhnguyen313@gmail.com ... gian trích ly cho hàm lượng polysaccharide 0,92% hiệu suất trích ly đạt 83,64% KẾT LUẬN Kết nghiên cứu ảnh hưởng đến q trình trích ly hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi thu sau: Hàm lượng polysaccharide. .. NGHỆ polysaccharide thu thấp, đạt 0,83% Hàm lượng polysaccharide tăng nhanh trích ly thời gian giờ, với hàm lượng polysaccharide thi 0,88%, đạt hiệu suất trích ly 80% Sau trích ly, lượng polysaccharide. .. phần Nước (%) Polysaccharide (%) Chất khơ hịa tan (oBx) Hàm lượng 7,2 1,1 0,9 Theo tác giả G-Bing hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi từ 1– 1,2%, hàm lượng polysaccharide nấm Linh chi khơ khơng