Phân lập hệ vi khuẩn nội sinh có khả năng phân giải cellulose từ đường ruột ấu trùng tằm bombyx mori l (lepidoptera bombycidae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐƢỜNG RUỘT ẤU TRÙNG TẰM Bombyx mori L (Lepidoptera: Bombycidae) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƢỜNG GVHD: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐƢỜNG RUỘT ẤU TRÙNG TẰM Bombyx mori L (Lepidoptera: Bombycidae) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƢỜNG Chữ ký GVHD LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập rèn luyện dƣới giảng đƣờng trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ từ phía nhà trƣờng, quý Thầy Cơ, gia đình bạn bè Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Ngọc Bảo Châu tận tình giúp đỡ, quan tâm, trực tiếp hƣớng dẫn em suốt trình làm đề tài thực tập tốt nghiệp Em xin cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh q Thầy Cơ khoa Cơng nghệ Sinh học nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập trƣờng Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Thụy Tố Nhƣ, anh Nguyễn Thiện Minh Tâm, bạn Nguyễn Thị Thu Ngân, bạn Vƣơng Gia Thanh dành thời gian giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu hỗ trợ cho em suốt thời gian làm đề tài Ngoài ra, em xin cảm ơn bạn DH18NN81 nhiệt tình góp ý giúp đỡ em lúc khó khăn để em hồn thành đề tài cách tốt Cuối với lời cảm ơn chân thành nhất, xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ, gia đình nuôi dạy, động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt trình học tập thực đề tài khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Trân trọng MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ I Mục tiêu .2 II Nội dung thực PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan vi khuẩn phân hủy cellulose .4 1.2 Tằm Bombyx mori L (tằm ăn dâu) 1.2.1 Giới thiệu .5 1.2.2 Vòng sinh thái tằm dâu (Bombyx mori L.) 1.3 Cây dâu 1.3.1 Phân bố: .7 1.3.2 Đặc tính sinh học: 1.3.3 Sinh thái dâu: PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu 10 2.2 Vật liệu nghiên cứu 10 2.3 Thiết bị dụng cụ, hóa chất môi trƣờng 10 2.3.1 Thiết bị dụng cụ 10 2.3.2 Hóa chất môi trƣờng .11 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .12 2.4.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm Bombyx Mori L 12 2.4.2 Nhuộm Congo Red để sàng lọc hệ vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm có khả phân giải Cellulose 13 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 3.1 mori L 3.2 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm Bombyx 15 Thí nghiệm 2: Nhuộm Congo Red để sàng lọc hệ vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm có khả phân giải Cellulose 18 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 20 4.1 Kết luận 21 4.2 Kiến nghị 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO .22 TRONG NƢỚC: .22 NƢỚC NGOÀI: 22 INTERNET .23 DANH MỤC BẢNG Bảng Các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ đƣờng ruột tằm Bombyx mori L 15 Bảng Kích thƣớc vịng phân giải chủng P2 P4 19 iii DANH MỤC HÌNH ẢNH H nh Hình ảnh phân tử Cellulose ( nguồn: Wikipedia.org) H nh Tằm Bombyx mori L.( nguồn: khoahoc.tv) H nh Vòng đời tằm Bombyx mori L.(nguồn: hoitoluavietnam.net) H nh Cây dâu tằm (nguồn: thamhiemmekong.com) H nh Đƣờng ruột tằm Bombyx mori L 15 H nh Vi sinh vật thủy phân chủng vi khuẩn P2 P4 18 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nƣớc top 10 quốc gia có sản lƣợng lúa gạo lớn giới (2016), với nông nghiệp không ngừng phát triển đất nƣớc ta nay, hàng năm sinh lƣợng rơm rạ khổng lồ Với phế phẩm giàu cellulose này, lƣợng đƣợc sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, vấn đề ô nhiễm vùng nông thôn mức đáng báo động, không từ việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật, phân bón hóa học mà cịn phần ảnh hƣởng khơng nhỏ từ việc sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp chƣa hợp lý phần lớn đƣợc xử lý theo phƣơng pháp truyền thống đốt trực tiếp đồng ruộng, điều gây nhiều hậu nhƣ góp phần nhiễm khơng khí, phá hủy hệ sinh thái đất đất ngày bạc màu Một biện pháp nhằm tận dụng rơm rạ có hiệu sử dụng vi khuẩn có khả phân giải cellulose giúp phân giải rơm rạ thành phân hữu bón cho đất, góp phần cải thiện độ phì nhiêu đất Nhiều nhà nghiên cứu sáng tạo nhiều cách sử dụng nhƣ: làm dƣợc phẩm, sản xuất nhiên liệu sinh học… Cho nên, việc nghiên cứu tìm lồi vi khuẩn phân hủy đƣợc cellulose việc cần thiết Không chế phẩm từ lồi vi khuẩn áp dụng vào sản xuất tạo nhiên liệu sinh học, mà cịn giúp phân hủy cellulose thành phân bón hữu Nhƣ vậy, việc nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải phế phụ phẩm nơng nghiệp làm chất để sản xuất phân hữu đem lại nhiều lợi ích Một mặt, vừa giảm nhiễm mơi trƣờng nơng thơn, giảm phát thải khí nhà kính; mặt khác, cung cấp nguồn dinh dƣỡng thiết yếu cho trồng Vì lồi tằm sử dụng nguồn cellulose từ dâu để chuyển hóa thành lƣợng để sinh trƣởng phát triển Nên, em định chọn thực đề tài: “PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐƢỜNG RUỘT ẤU TRÙNG TẰM Bombyx mori L (Lepidoptera: Bombycidae)” I MỤC TIÊU Phân lập xác định số loài vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột ấu trùng tằm có khả phân giải cellulose II NỘI DUNG THỰC HIỆN Nội dung thực TN1: Phân lập vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm Thời gian Phân lập đƣợc vi khuẩn tháng sinh đƣờng ruột tằm có khả phân giải cellulose nội sinh đƣờng ruột B mori TN2: Sử dụng phƣơng pháp nhuộm congo red để sàng lọc hệ vi khuẩn nội Dự kiến kết Tìm đƣợc vi khuẩn tháng phân giải cellulose nội sinh ruột tằm PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực từ tháng 12/2020 đến tháng 3/2020 phịng thí nghiệm trƣờng đại học Mở TP Hồ Chí Minh cở sở Bình Dƣơng 2.2 Vật liệu nghiên cứu - Tằm bombyx mory 2, tuổi đƣợc thu huyện Lâm Hà , tỉnh Lâm Đồng - Lá dâu tằm 2.3 Thiết bị dụng cụ, hóa chất môi trƣờng 2.3.1 Thiết bị dụng cụ - Tủ cấy vơ trùng - Nồi hấp (autoclave) - Kính hiển vi - Microwave - Bếp điện - Cân kỹ thuật - Ống nghiệm - Đĩa petri - Lame - Pipet (thủy tinh micropitet) - Becher - Máy vortex - Tủ sấy - Tủ lạnh - Tủ ấm - Erlen - Ống đong - Phễu - Đũa thủy tinh - Que cấy vòng - Que cấy trang - Đèn cồn - Kẹp gắp dài - Cân phân tích - Kệ đựng ống nghiệm - Quẹt - Đầu tuýp - Bơng y tế - Bơng khơng thấm nƣớc - Lị vi sóng - Nhíp - Lƣỡi dao vơ trùng, cán dao Hóa chất mơi trường 2.3.2  Mơi trƣờng: - NA (Nutrient Agar) - PDA ( Potato Dextrose Agar) - Mơi trƣờng NB (Nutrient Broth)  Hóa chất: - Thuốc nhuộm: nhộm Gram - Hóa chất: - NANO3 - MgSo4 - K2HPO4 - Agar - CMC - FeSO4 - MnSO4 - CaCl2 - Ethanol 70o - Ethanol 96o - Nutrient Broth - Nƣớc cất Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4 2.4.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh đường ruột tằm Bombyx Mori L Tiến hành thu thập mẫu tằm dâu Bombyx mori L Huyện Lâm Hà, Tỉnh Lâm Đồng  Phƣơng pháp: o Khử trùng mẫu: Cắt, rút đƣờng ruột tằm (ấu trùng tuổi 2, tuổi) lƣỡi dao vô trùng rửa dung dịch NaCl (0,85%), cho vào ống falcon chứa 40 ml nƣớc muối vortex phút.đồng ủ 30 phút 37°C o Phần phía đƣợc lấy pha loãng lần lƣợt 1000–10.000 lần o Hút, cấy trang môi trƣờng sinh học thạch Berg (tính g/100 ml) có chứa 0,2g NaNO3; 0,05g MgSO3; 0,005g K2HPO2; 1mg FeSO4; 2mg CaCl2; 0,2mg MnSO4; thạch 2% o Làm vi khuẩn nội sinh phƣơng pháp cấy ria môi trƣờng NA(Nutrient Agar) o Quan sát đặc điểm khuẩn lạc: màu sắc, hình dáng, …  Nhuộm Gram  Nguyên tắc: Sự khác vách tế bào Gram (+) Gram (-) làm cho khả bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác hai nhóm vi khuẩn Dựa vào đặc điểm ngƣời ta phân thành hai nhóm vi khuẩn  Tiến hành thực  Nhỏ giọt nƣớc lên phiến kính Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính khơ  Phủ hồn tồn vết bơi với crystal violet Để yên - phút nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dƣ nƣớc  Nhỏ dung dịch lugol khoảng 30 giây lại rửa nhẹ nhàng với nƣớc  Tẩy cồn 96o từ 15 - 30 giây, sau rửa nƣớc Phủ hồn tồn vết bơi với safranin O để yên phút Rửa với nƣớc  Thấm khơ phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khơ hồn tồn, đặt lamen lên quan sát dƣới kính hiển vi với vật kính x100  Đọc kết 2.4.2 Nhuộm Congo Red để sàng lọc hệ vi khuẩn nội sinh đường ruột tằm có khả phân giải Cellulose Các khuẩn lạc cho thấy khả phân hủy đƣợc kiểm tra cách sàng lọc đĩa sử dụng phƣơng pháp phủ đỏ Congo Red  Các bƣớc tiến hành: Nuôi tăng sinh môi trƣờng NB 48 30o Ly tâm lạnh 10000 vòng 15 phút 4o C, hút 100 μm phần lên bên nhỏ vào giếng đục ni 48 Sau đĩa mơi trƣờng đƣợc nhuộm với dung dịch Lugol Vi khuẩn thủy phân tạo vùng không màu xung quanh khuẩn lạc (halo) Cơng thức tính khả thủy phân: – PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm Bombyx mori L H nh 3.1 Đƣờng ru ột tằm Bombyx mori L Kết phân lập đƣợc chủng vi khuẩn từ đƣờng ruột tằm dâu Bombyx mori L Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ đƣờng ruột tằm Bombyx mori L Hình thái khuẩn lạc Ký STT Khuẩn hiệu chủng Hiển vi Hiển vi lạc Màu Hình Bề sắc dạng mặt Hình Rìa dạng tế bào Nội bào tử Gram P1 Vàng Tròn Nhẵn Răng Trực cƣa khuẩn Có - Có + Nguyên P2 Trắng đục Méo Nhẵn vẹn Trực khuẩn P3 P4 Trắng đục Trắng đục Tròn Nhẵn Méo Nhẵn Nguyên Trực Khôn vẹn khuẩn g Nguyê Trực Khôn n vẹn khuẩn g Đánh giá nhận xét dựa tài liệu Trần Linh Thƣớc (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất giáo dục để xác định hình thái khuẩn lạc + + 3.2 Thí nghiệm 2: Nhuộm Congo Red để sàng lọc hệ vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm có khả phân giải Cellulose H nh 3.2 Vi sinh vật thủy phân chủng vi khuẩn P2 P4 Bảng 3.2 Kích thƣớc vịng phân giải chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Vòng phân giải(cm) P2 1.66 ± 0.05a P4 1.61 ± 0.07a DC 0.71 ± 0.0b Trong cột giá trị có mẫu tự không khách biệt mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Ducan Đƣờng kính vịng kháng cảu vi sinh vật nội sinh đƣờng ruột tằm: Giá trị đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm đƣợc chuyển đổi Ѵ(x=0,05) trƣớc xử lí thống kê Đƣờng kính vịng kháng có khác biệt có ý nghĩa giữ nghiệm thức qua thống kê (p=0) đƣờng kính vịng kháng nghiệm thức P2(1.66) cao Khả phân giải cellulose chủng P2 cao P4 vịng phân giải lớn với đƣờng kính 1.66cm Chủng P1 chủng P3 khơng có kết khơng thấy vịng phân giải chúng Dựa báo thí nghiệm Vũ Thị Dinh, Phan Thị Thu Nga, Hồng Trung Dỗn, Trần Liên Hà, “ phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ cao, thích nghi giải pH rộng, có hoạt tính cellulose cao vả bƣớc đầu ứng dụng xử lí nƣớc thải nhà máy giấy” tạp chí khoa học Ngô Thanh Phong, Nguyễn Thị Cẩm Vân, Nguyễn Huỳnh Thúy Diệu Bùi Thế Vinh “ xác định khả phân giải cellulose chủng vi khuẩn từ ruột mối (Microcerotermes.sp) thu nhận Quận Bình Tân, Tỉnh Vĩnh Long” có sử dụng phƣơng pháp đục lỗ thạch nhuộm lugol để xác định vi khuẩn có khả phân giải cellulose PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 - Kết luận Thí nghiệm , phân lập đƣợc loại vi khuẩn làm chúng Đa số trực khuẩn - Thí nghiệm giúp tìm vi khuẩn phân giải cellulose dựa vịng không màu giếng đục 4.2 Kiến nghị Để đề tài đƣợc hồn thiện trơn tru hơn, em có số kiến nghị sau: - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lặp lại nhiều lần để có kết xác, sử dụng nhiều kiểu cấy đĩa ống nghiệm, để vi khuẩn đƣợc làm - Tiến hành thử nghiệm test sinh hóa vi khuẩn phân lập đƣợc để có kết xác, xác định đƣợc họ, chi vi khuẩn TÀI LIỆU THAM KHẢO TRONG NƢỚC: Nguyen Thi Thu Thuy, Long Nguyễn Tiến (2018), VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE MẠNH TRONG SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ TỪ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA CHÚNG ĐỐI VỚI GIỐNG LẠC L14 TẠI HƢƠNG TRÀ, THỪA THIÊN HUẾ, Tập 127, Số 3B, 2018 Vo Tinh Thien (2015), VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE, Pp.1-5, pp Nguyễn Hồ Cát Dung, Nguyễn Xuân Bình, Phan Thị Mỹ Hạnh(2017), PHÂN LẬP VÀ LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MÀU DỆT NHUỘM CONGO RED, Pp.552-553 Võ Văn Phƣớc Quệ, Cao Ngọc Diệp (2011), PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE, Pp 180-181 Vũ Thị Dinh, Phan Thị Nga, Hoàng Trung Doãn, Trần Liên Hà (2018), PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHỮNG VI KHUẨN CHỊU NHIỆT ĐỘ CAO, THÍCH NGHI VỚI DẢI Ph RỘNG, CĨ HOẠT TÍNH CELLULOSE CAO VÀ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG XỬ LÍ NƢỚC THẢI NHÀ MÁY GIẤY, PP.4 Trần Linh Thƣớc (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất giáo dục NƢỚC NGOÀI: Prem Anand, A Alwin, et al "Isolation and characterization of bacteria from the gut of Bombyx mori that degrade cellulose, xylan, pectin and starch and their impact on digestion." Journal of Insect Science 10.1 (2010): 107 Trang Kandylis, Kostas, I Hadjigeorgiou, and P Harizanis "The nutritive value of mulberry leaves (Morus alba) as a feed supplement for sheep." Tropical animal health and production 41.1 (2009): 17-24 Byeon GM, Lee KS, Gui ZZ, Kim I, Kang PD, Lee SM, Sohn HD, Jin BR 2005 A digestive h-glucosidase from the silkworm, Bombyx mori: cDNA cloning, expression and enzymatic characterization Comparative Biochemistry and Physiology 141(B): 418 Horie Y 1959 Physiological studies on the alimentary canal of the silkworm, Bombyx mori-II Carbohydrases in the digestive fluid and in the midgut tis Minami M, Indrasith LS, Hori H Characterization of ATPase Activity in Brush Border Membrane Vesicles from the Silkworm, Bombyx mori Agricultural and Biological Chemistry 1991;55(11):2693–2700 INTERNET Vi sinh vật phân giải Cellulose.http://psb.vn/vi-sinh-vat-phan-giai-cellulose/ Tằm : https://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%B1m Bombyx Mori, Mimir bách khoa toàn thƣ: https://mimirbook.com/vi/0e045eb0f9b PHỤ LỤC Bảng đo vòng phân giải Cenllulose chủng vi sinh vật P2 P4 ... TIÊU Phân l? ??p xác định số loài vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột ấu trùng tằm có khả phân giải cellulose II NỘI DUNG THỰC HIỆN Nội dung thực TN1: Phân l? ??p vi khuẩn nội sinh đƣờng ruột tằm Thời gian Phân. .. thành l? ?ợng để sinh trƣởng phát triển Nên, em định chọn thực đề tài: “PHÂN L? ??P HỆ VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐƢỜNG RUỘT ẤU TRÙNG TẰM Bombyx mori L (Lepidoptera: Bombycidae)? ??... TẬP TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN L? ??P HỆ VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐƢỜNG RUỘT ẤU TRÙNG TẰM Bombyx mori L (Lepidoptera: Bombycidae) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG