Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nito trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm phục vụ nuôi trồng thủy sản

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNƠNGLÂMTHÀNHPHỐHỒCHÍMINH TRƯƠNGPHƯỚCTHIÊNHỒNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CHUYỂN HĨA NITƠ TRONGNỀNĐÁY VÙNGNITƠMHÙM(Panulirussp.) PHỤCVỤ NITRỒNG THỦYSẢN Chunngành:CơngNghệSinhHỌcMã sớ:9.42.02.01 LUẬNÁNTIẾNSĨNGÀNHCƠNGNGHỆSINHHỌC TP.HCM-Năm2022 BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠI HỌCNƠNGLÂMTHÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNGPHƯỚC THIÊNHỒNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CHUYỂN HĨA NITƠ TRONGNỀNĐÁY VÙNG NITƠM HÙM(Panulirussp.) PHỤCVỤ NITRỒNG THỦYSẢN Chunngành :CơngnghệsinhhỌcMã sớ : 9.42.02.01 LUẬNÁNTIẾNSĨNGÀNHCƠNGNGHỆSINHHỌC NgườihướngdẫnkhoahỌc: PGS.TS.Nguyễn PhúHịa PGS.TS PhạmCơngHoạt TP.HCM-Năm 2022 LỜICẢMƠN Trong suốt thời gian học tập, thực hoàn thành luận án này, tơi nhậnđượcsựhướngdẫn,giúpđỡtậntìnhcủatậpthểQThầyCơ,cáccơquan,c ácanhchịvàcácbạn.Vớilịngkínhtrọngvàbiếtơnsâusắc,tơixinđượcbàytỏlờicảm ơn chân thànhđến: PSG.TS Nguyễn Phú Hịa và PGS.TS Phạm Cơng Hoạt tận tình hướngdẫn, giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức q báo giúp tơi hồnthành tốt luậnán TS Hoàng Quốc Khánh, PGS.TS Nguyễn Bảo Quốcđã động viên, hỗ trợnhiệt tình vềchun mơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM, Viện Công nghệ sinhhọc Môi trường, Khoa Khoa học Sinh học, Khoa Thủy Sản, Phòng Đào tạo SauĐại học giúp đỡ tạo điều kiện tốt giúp đỡ tơi q trình thựchiện luận án Tập thể bạn nghiên cứu viên, học viên cao học, sinh viên từ phịng thínghiệmCơngnghệVisinh,ViệnNghiêncứuCơngNghệSinhhọcvàM i Trường, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM hỗ trợ, giúp đỡ để tơi học tập,thựchiện vàhồn thành tốt luận án Tất bạn bè đồng nghiệp người động viên, giúp đỡ chân thànhtơitrongq trình làm luận án Ba Mẹ người thân gia đình, chồng ủng hộ,độngviên vàlàđiểmtựa tinhthần cho tơitrong suốt q trìnhthựchiện luận án Nghiêncứusinh Trương PhướcThiên Hoàng LỜICAMĐOAN Tôi cam đoan công bố luận văn trung thực phầnkết nghiên cứu thuộc đề tài cấp nhà nước mã số ĐTĐL.CN-60/15 PGS TS.Nguyễn Phú Hòa làm chủ nhiệm Những số liệu luận văn phép cơng bốvớisựđồngýcủachủnhiệmđề tài.Tấtcảcácsốliệuvà kếtquảtrìnhbàytrong luậnán làchưa đượccơng bố trongthờigiantrướcđâybởi tácgiảkhác TRƯƠNGPHƯỚC THIÊNHỒNG TĨM TẮT Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ đáy vùng nuôi tôm hùm(Panulirussp.)phụcvụnuôitrồngthủysảnđượcthựchiệnvớicácnộidungs au: (1)Nghiên cứu tiến hành phân lập định danh vi khuẩn từ mẫu bùn đượclấy từ đáy lồng bè nuôi tôm hùm vùng Vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yêntrongthờigian12tháng;(2)Nghiên cứu tạo môi trường lên men dạng lỏng dạngbán rắn phù hợp cho chủng vi khuẩn có khả tạo chế phẩm sinh học xử lýmôi trường;(3)Đánh giá chế phẩm vi sinh xử lý môi trường mô hình ươngtơmthẻchân trắnggiaiđoạn post5 qui mơ1m3 Kết nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có khả chuyểnhóa ammonia nitrite Các chủng vi khuẩn định danh phương phápkiểm tra đặc điểm hình thái, sinh hóa kit API 20E, 20NE, phương pháp giảitrình tự vùng 16S – rRNA xác định khả chuyển hóa ammonia nitrite;trong có chủng vi khuẩnBacillus licheniformisB85,Pseudomonas stutzeriKL15,Rhodococcus rhodochrousT9có khả chuyển hóa ammonia, nitrite tốtnhất Luận án nghiên cứu thành phần môi trường dạng lỏng phù hợp cho sựphát triển chủng vi khuẩn mơ hình Box – Behnken sau: thành phầnmôi trường cho vi khuẩnB.licheniformisB85 mật số 3,14 x 1011CFU/mL baogồm 3,94 g/L mật rỉ đường, 15,56 g/L cao nấm men 1,13 g/L NaCl; Mật độ vikhuẩnP.stutzeriKL15 2,37 x 1011CFU/mL với thành phần môi trường gồm 4,95g/L mật rỉ đường, 19,08 g/L cao nấm men 1,13 g/L MgSO 4;Đối với chủng vikhuẩnR.rhodochrousT9,thành phần môi trường 7,93 g/L glucose, 6,1 g/L peptonvà2,95g/LNaClvớimậtsố vi khuẩn là2,52 x1010CFU/mL Ba chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường bán rắn với tỷ lệ giống,thời gian độ ẩm thích hợp, sau sấy nghiền mịn để tạo chế phẩm visinh dạng bột với mật số vi khuẩn 10 9CFU/g Chế phẩm vi sinh dạng bột bảoquảnở i kh oả n g nhiệ t đ ộ: nh iệ tđ ộlạ nh -8 oCvà nh iệ tđ ộp hò ng 28 32 oC.Ở nhiệt độ - 8oC, mật số vi khuẩn bảo quản tốt hơn, sau 360 ngày mật độ vikhuẩnP stutzeriKL15,R.rhodochrousT9có giảm từ 109CFU/g cịn 106CFU/g, vikhuẩnB.licheniformisB85 giảm từ 109CFU/g 107CFU/g Đối với bảo quản ởnhiệt độ phòng 28-32oC, sau 360 ngày, mật độ vi khuẩnP stutzeriKL15 vàR.rhodochrousT9có giảmtừ109CFU/gcịn105CFU/g,mậtsốvikhuẩnB.licheniformicsB85 giảm từ 109CFU/g cịn 106CFU/g Vi khuẩnB licheniformicsB85 nhóm vi khuẩn sinh bào tử nên có mật độ vi khuẩn cao so với chủng vikhuẩncòn lại Kết đánh giá hiệu xử lý mơi trường chế phẩm vi sinh mơ hìnhươnggiốngtơmthẻchântrắngởgiaiđoạnpostlarvae5trongbểximăng1m 3chothấy khả kiểm soát tốt hàm lượng TAN,NO2và NO3với tỷ lệ chế phẩm là0,5%vớimậtđộ 108CFU/g, sử dụngđịnh kỳ 6ngày/1lần SUMMARY Thestudyonnitrogen-metabolizingbacteriainthebottomoflobster(Panulirussp.) culture area for aquaculture was carried out with the followingcontents: (1) The study was conducted to isolate and identify bacteria from sludgesamples which were taken from the bottom of lobster cages in Xuan Dai Bay, PhuYen province during 12 months (2) Research on create suitable liquid and semisolidmediaforbacterialstrainstomakebiologicalproductstotreattheenvironment; (3)Experimentingwiththeuseofmicrobiologicalproductsforenvironmental treatment in the 5-day old postlarvae of white leg shrimp rearing in1m 3-cement tanks The results shown that bacterial strains capable of metabolizing ammonia andnitrite in the bottom sludge, strains were identified by morphological, biochemicaland DNA marker characterization by API 20E, 20NE kit and 16S rRNA regionsequencingmethodanddeterminedtheabilitytometabolizeammonia,n i t r i t e ThreestrainsofBacilluslicheniformisB85,PseudomonasstutzeriKL15,andRhodococc usrhodochrousT9wereabletometabolizeammoniaandnitriteinhighest efficience The thesis has optimized the composition of liquid medium of 3bacterial strains on the Box - Behnken model as follows: the composition of themediumofBacilluslicheniformisB85atthedensityof3,14x1011CFU/mLincludes molasses, yeast extract and NaCl The density ofPseudomonas stutzeriKL15 was 2,37 x 1011CFU/mL with the media composition including molasses,yeast extract and MgSO4 For the strainRhodococcus rhodochrousT9, the mediacomposition was glucose, peptone and NaCl with a bacterial density of 2,52 x 10 10CFU/mL Theabovethreebacterialstrainswereculturedonsemi-solidmediawithsuitable time and humidity,thendriedandgroundtoproduceapowderedprobioticproduct with a bacterial density of 10 9CFU/ gram Powder microbiology mode isstored at two temperature ranges: cold temperature 4-8oC and room temperature 28-32oC.Atatemperatureof4- oC,thebacterialdensitywasbetterpreserved,after 360 days, the density ofP.stutzeriKL15,R.rhodochrousT9 decreased from 109CFU/g to 106CFU/g,B.licheniformisB85 reduced from 109CFU/g to 107CFU/g.For storage at temperature 28-32oC, after 360 days, the density ofP.stutzeriKL15andR.rhodochrousT9 decreased from 109CFU/g to 105CFU/g, the density ofB.licheniformicsB85 reduced from 109CFU/g to 106CFU/g.B licheniformicsB85is a group of spore-forming bacteria,s o i t h a s a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f b a c t e r i a thanP.stutzeriKL15 andR.rhodochrousT9 Theresultsofevaluationoftheenvironmentaltreatmentefficiencyo f probiotic products in water of the white leg shrimp nursing cement tank showed theability to control the content of TAN, NO2 and NO3 well with a density of 10 8CFU/g,used periodically every 6days MỤCLỤC Trangtựa i Lờicảm ơn .ii Lờicamđoan iii Tómtắt iv Summary vi Mụclục viii Danhsáchchữviếttắt .xiv Danhsách cácbảng xv Danhsách cáchình xvii MỞ ĐẦU CHƯƠNG1T Ổ N G QUAN TÀILIỆU 1.1 Tổngquan tình hìnhni tơm hùm lồngbè 1.2 Hiệntrạngônhiễm môitrườngnước vùngnuôitôm hùmVịnhXuânĐài 1.3 Visinhvật môi trườngnướcmặn 1.4 Sơđồchutrình chuyển hóanitơ tronghệsinhtháibiển 1.5 Cácqtrìnhchuyểnhốnitơvàvaitrịcácnhómvikhuẩnthamgiachuyểnh óa 11 1.6 Đặcđiểmcủa cácnhómvikhuẩn thamgia qtrìnhchuyểnhóa Nitơ 13 1.6.1 Đặcđiểmsinhhọccủa vikhuẩnBacillus 13 1.6.2 ĐặcđiểmsinhhọccủavikhuẩnRhodococcus 15 1.6.3 Đặcđiểm sinhhọccủavikhuẩnPseudomonas 15 1.6.4 Đặcđiểm sinhhọccủavikhuẩnStenotrophomonas 16 1.6.5 Đặcđiểm sinhhọccủa cácnhómvi khuẩnchuyểnhóanitơkhác 17 1.7 Cácyếu tố ảnhhưởng đếnquá trình nhân sinhkhốivikhuẩn 18 1.7.1 NguồnCacbon 18 1.7.2 NguồnNitơ 18 1.7.3 Nguồnkhoáng vàvitamin 18 1.7.4 Mậtđộgiống 19 1.7.5 Thờigian nuôi cấy 19 1.7.6 Nhiệtđộ 19 1.7.7 ĐộpH 19 1.7.8 Độnghọccủaquá trình vi sinhvật 19 1.8 Sơlượcvềma trận Plackett-Burman vàBox -Behnken 20 1.8.1 Giớithiệu phươngphápbềmặt đápứng (RSM) 20 1.8.2 Matrận Plackett-Burman 20 1.8.3 MatrậnBox-Behnken(BBD) 21 1.9 Cácyếu tốảnhhưởng đếnmôitrườngnướcnuôi tôm thẻchântrắng 21 1.9.1 Ammoniatổngcộng (TAN-Total AmmoniaNitrogen) 21 1.9.2 Nitritevà Nitrate 22 1.10 Tìnhhình nghiêncứu ứngdụng củavisinhvậttrongni trồngthủy sản .22 1.10.1 Tìnhhìnhứngdụngvi sinhvật trongni trồng thủysản trongnước 22 1.10.2 Tìnhhìnhứngdụngvisinh vậttrongni trồng thủy sảntrênthếgiới 24 CHƯƠNG2P H Ư Ơ N G PHÁPNGHIÊNCỨU 26 2.1 Sơđồnghiêncứu .26 2.2 Thờigian địađiểm nghiêncứu 26 2.3 Phươngphápthumẫubùnđáy .27 2.3.1 Vịtríthu mẫu 27 2.3.2 Phươngphápphân tíchhóa lý củamẫubùn 27 2.4 Nộidung1:PhânlậpvàđịnhdanhvikhuẩnchuyểnhóaNitơtừnềnđáyvùngni tơmhùm 28 2.4.1 Phânlập địnhdanh vikhuẩnBacillussp chuyểnhóa ammonia 28 2.4.1.1 PhânlậpvikhuẩnBacillussp 28 2.4.1.2 Phươngphápđịnh danh sinhhóavi khuẩnBacillussp 28 2.4.1.3 Phươngphápđịnh danhsinhhọcphântử vikhuẩnBacillussp 28 2.4.2 Phânlập vàđịnhdanh vikhuẩn chuyểnhóaammonia(AOB) 29 2.4.2.1 Mơitrườngphân lậpvikhuẩn chuyểnhóa ammonia(phụlục 1.3.1) 29 ... làchưa đượccơng bố trongthờigiantrướcđâybởi tácgiảkhác TRƯƠNGPHƯỚC THIÊNHỒNG TĨM TẮT Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ đáy vùng nuôi tôm hùm( Panulirussp.)phụcvụnuôitrồngthủysảnđượcthựchiệnvớicácnộidungs... Tìnhhìnhứngdụngvi sinhvật trongni trồng thủysản trongnước 22 1.10.2 Tìnhhìnhứngdụngvisinh vậttrongnuôi trồng thủy sảntrênthếgiới 24 CHƯƠNG2P H Ư Ơ N G PHÁPNGHIÊNCỨU 26 2.1 Sơđồnghiêncứu ... HỌCNƠNGLÂMTHÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNGPHƯỚC THIÊNHỒNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CHUYỂN HĨA NITƠ TRONGNỀNĐÁY VÙNG NITƠM HÙM(Panulirussp.) PHỤCVỤ NITRỒNG THỦYSẢN Chunngành :CơngnghệsinhhỌcMã sớ : 9.42.02.01