Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học 90 TỔNG HỢP VÀ CHUYỂN CẤU TRÚC microRNA NHÂN TẠO VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L ) Hà Thị Trúc Mai, Đặng Lê Trâm, N[.]
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học TỔNG HỢP VÀ CHUYỂN CẤU TRÚC microRNA NHÂN TẠO VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) Hà Thị Trúc Mai, Đặng Lê Trâm, Nguyễn Thế Phương, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Nguyễn Vũ Phong* Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: nvphong@hcmuaf.edu.vn TÓM TẮT Effector protein cụ thể tuyến trùng tiết vào tế bào thực vật, tạo thuận lợi cho trình ký sinh chủ Bất hoạt effector làm giảm khả ký sinh tuyến trùng giúp hạn chế tác hại tuyến trùng gây Gene Minc14137 mã hóa cho effector chưa rõ chức tạo dòng từ tuyến trùng Meloidogyne incognita Mục tiêu nghiên cứu tổng hợp microRNA nhân tạo có khả bất hoạt gene Minc14137 Cấu trúc microRNA chèn vào vector biểu chuyển vào đậu nành vi k��� A tumefaciens nhằm tìm hiểu chức effector MINC14137 tiến trình ký sinh thực vật tuyến trùng sưng rễ thông qua đường làm câm lặng gene chủ (HIGS) Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, htpII, nốt mầm, microRNA, PCR overlapping CONSTRUCTION AND TRANSFORMATION AN ARTIFICIAL microRNA STRUCTURE TO SOYBEAN (Glycine max L.) Ha Thi Truc Mai, Dang Le Tram, Nguyen The Phuong, Nguyen Thi Ngoc Loan, Nguyen Vu Phong* Nong Lam University Ho Chi Minh City *Corresponding Author: nvphong@hcmuaf.edu.vn ABSTRACT Effectors are specific proteins secreted by nematodes into plant cells that facilitate their parasitism to host plants Inactivation of these effectors reducing the parasitic ability of nematodes on plants to help reduce the damage caused by nematodes Gene Minc14137 encodes an effector unknown function that is cloned from the Meloidogyne incognita The objective of the study was to synthesize artificial microRNAs capable of inactivating gene Minc14137 This microRNA structure was inserted into an expression vector in soybean by A tumefaciens to investigate the function of effector MINC14137 in the parasitic process of rootknot nematode via gene silencing by host plant (HIGS) Keywords: Agrobacterium tumefaciens, htpII, cotyledonary node, microRNA, PCR overlapping TỔNG QUAN Đậu nành (Glycine max (L.)) trồng mang lại giá trị kinh tế cao Những năm gần đây, sản lượng đậu nành ngày giảm mạnh tuyến trùng gây hại Việc sử dụng hóa chất kiểm sốt tuyến trùng có hiệu lại ảnh hưởng lớn đến môi trường sức khỏe người Vì vậy, bên cạnh phương pháp sinh học truyền thống, việc tìm kiếm phương pháp mới, thân thiện với môi trường quan tâm nghiên cứu (Nguyễn Vũ Phong, 2018) Tuyến trùng tiết effector tạo thuận lợi cho trình ký sinh chủ Bất hoạt effector làm giảm khả ký sinh tuyến trùng, từ hạn 90 chế nhiều tổn thất tuyến trùng gây Trong nghiên cứu này, gene Minc14137 mã hóa cho effector chưa rõ chức năng, tạo dòng từ tuyến trùng M incognita, sử dụng làm liệu để tổng hợp microRNA nhân tạo có khả bất hoạt gene Cấu trúc microRNA sau chèn vào vector biểu chuyển vào đậu nành DT22 vi khuẩn A tumefaciens VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế tổng hợp miRNA nhân tạo Trình tự gene Minc14137 dịng tuyến trùng Mi-PN03, độ tương đồng đến 95% với Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học (đồng nuôi cấy mẫu vi khuẩn ngày) 25oC, điều kiện ánh sáng mờ Để loại bỏ vi khuẩn mẫu lây nhiễm, rửa mẫu 50 ml môi trường tạo chồi có bổ sung kháng sinh cefotaxime 100 mg/l, vancomycin 50 mg/l, timentin 50 mg/l Thời gian rửa mẫu - phút Mẫu sau rửa cấy nghiêng góc 45o mơi trường lọc có chứa cefotaxime 100 mg/l, timentin 50 mg/l Chọn lọc kiểm tra chồi giả định chuyển gene Sau 14 ngày môi trường lọc, mẫu chuyển sang môi trường tạo chồi có bổ sung tác nhân chọn lọc hygromycin với nồng độ mg/l Sau 28 ngày, tiếp tục chuyển mẫu sang mơi trường chọn lọc có nồng độ 10 mg/l hygromycin để xác định chồi chuyển gene Chồi giả định chuyển gene tách chiết DNA hóa chất theo phương pháp Doyle Doyle (1990), đo OD để xác định nồng độ độ tinh trước thực phản ứng PCR, sử dụng cặp primer HptII-F (5’-CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC-3’) primer HptII-R (5’GCCATCGGTCCAGACGGCCCGCGC-3’) khuếch đại gene hptII kháng hygromycin có cấu trúc plasmid cDNA tuyến trùng M incognita GenBank (ID: AW441106.1), sử dụng để thiết kế miRNA nhân tạo nhờ phần mềm WMD3 (Cấu trúc amiRNA mục tiêu chọn dựa theo tiêu chí đề xuất Schwab ctv 2006) Công cụ Oligo phần mềmWMD3 sử dụng để thiết kế primer thay đoạn 21 nu precursor athmi319a đoạn miRNA 21 nu nhờ kỹ thuật PCR overlapping Cấu trúc amiRNA sau nhân dịng vector pJET1.2/blunt (Thermo Scentific) giải trình tự nhằm đảm bảo tính xác trước gắn vào vector biểu Gắn cấu trúc amiRNA vào vector biểu Đoạn miR319a vector pSM103 (Melito ctv, 2010) thay đoạn trình tự amiRNA tổng hợp Vector pSM103 đoạn amiRNA xử lý enzyme cắt BamHI PstI (Thermo Scientific) nối với nhờ enzyme T4 DNA ligase (Thermo Scientific) để tạo vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp pSM103-amiRNA tạo dòng tế bào E coli TOP10 khả biến phương pháp sốc nhiệt, sau biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 để chuyển cấu trúc amiRNA vào chủ Chuẩn bị mầm đậu nành DT22 Hạt khử trùng theo quy trình khử mẫu Trần Thị Cúc Hòa (2008) Chuẩn bị mẫu mầm đậu nành theo quy trình Phan Lê Tư ctv (2018): đậu nành (5 - ngày) giữ lại phần trụ hạ diệp cách nốt mầm khoảng - mm, đồng thời dùng dao tạo vết thương mặt vị trí trụ hạ diệp tiếp giáp mầm Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 Chủng vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 mang vector pSM103-amiRNA nuôi môi trường YEB rắn (An ctv, 1988) bổ sung 50 mg/l kanamycin 28oC 48 Khuẩn lạc đơn phát triển tốt tăng sinh môi trường YEP lỏng chứa 50 mg/l kanamycin 28oC đến OD600 đạt 1,0 - 1,2 Tiến hành thu sinh khối vi khuẩn pha loãng môi trường IM lỏng thành dạng huyền phù Đồng nuôi cấy tái sinh chồi đậu nành Mẫu nốt mầm ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn 30 phút Mẫu sau nhiễm thấm khô đặt úp lên môi trường CCM KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế tổng hợp miRNA nhân tạo Từ danh sách amiRNA gợi ý, amiRNA ứng viên chọn theo tiêu chí: 1) bất hoạt gene mục tiêu tuyến trùng mà không bất hoạt gene khác đậu nành; 2) vị trí gắn miRNA nhân tạo với mRNA mục tiêu nằm vùng 3’; 3) lượng liên kết amiRNA với mRNA mục tiêu từ -35 đến -40 kcal/mol, không -30 kcal/mol; 4) khơng bắt cặp sai từ vị trí - 12 amiRNA đoạn mục tiêu Trong nghiên cứu này, microRNA nhân tạo chọn ký hiệu amiR14137, có trình tự 5’-UAACUAUAAUCUAGGGCACGU-’3 tổng hợp theo quy trình miêu tả Schwab ctv (2006), precursor mang cấu trúc amiRNA tổng hợp có kích thước khoảng 428 bp Cấu trúc precursor mang amiR14137 tạo dòng nhờ vector pJET1.2/blunt tế bào E coli TOP10 sàng lọc PCR khuẩn lạc Plasmid tái tổ hợp dòng vi khuẩn ngẫu nhiên tách chiết giải trình tự với primer pJET1.2-F Kết sau hiệu đính 91 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học bp đoạn 2974 bp Trên thực tế, kết điện di sản phẩm cắt vector pSM103 cho băng có kích thước lớn 10 kb băng tương đương 400 bp, plasmid pJET1.2/bluntamiR14137 cho băng có kích thước gần kb băng 400 bp (Hình 1) cho thấy cấu trúc amiR14137 có chiều dài trình tự với dự tính Tạo vector biểu cấu trúc amiRNA Theo lí thuyết, pSM103 sau cắt tạo sản phẩm gồm hai đoạn có kích thước 412 bp khoảng 12 kb; pJET1.2/blunt-amiR14137 cho đoạn 428 Hình Kết cắt vector (a) pSM103 (b) pJET1.2-amiR14137 (M): DNA marker kb; (1): plasmid; (2): cắt BamHI PstI Vector pSM103 mở vòng đoạn amiR14137 sàng lọc PCR khuẩn lạc (Hình 2) Kết thu hồi từ gel agarose GeneJET Gel tạo dịng thành cơng amiRNA vi Extraction Kit (Thermo Scientific) tái tổ khuẩn E coli Cấu trúc thu nhận, hợp enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens nối sau biến nạp vào tế bào khả nạp LBA4404 kanamycin áp dụng tạo đậu E coli TOP10 phương pháp sốc nhiệt nành chuyển gene Các dòng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp Hình Kết điện di sản phẩm PCR sàng lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp (M): DNA marker 100 bp; (1-10): k����� bào thực vật Mẫu môi trường đồng nuôi Đồng nuôi cấy tái sinh chồi Trong q trình chuyển gene thơng qua vi cấy cảm ứng (phình to, mép cong lên khuẩn A tumefaciens, đồng nuôi cấy giai khỏi mặt tiếp xúc với môi trường) Trên môi đoạn vi khuẩn thực chế chuyển đoạn trường lọc tái sinh chồi từ vị trí vết T-DNA vào tế bào Quá trình ảnh hưởng thương tạo mẫu tái sinh từ - chồi lớn đến khả xâm nhiễm vi khuẩn chồi có chiều cao từ - cm, chồi có màu xanh nhạt kết trình chuyển gene vào tế 92 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học Hình Hình thái mẫu đậu nành chồi tái sinh môi trường a) đồng nuôi cấy ; b) tái sinh chồi; c) 5mg/L hygromyci; d) 10mg/L hygromycin mg/l hygromycin tiếp tục theo dõi Trên Kết chọn lọc chồi chuyển gene Trong nghiên cứu này, chồi giả định chuyển môi trường bổ sung 10 mg/l hygromycin gene chọn lọc môi trường bổ sung nhận thấy hầu hết chồi nhanh bị ức chế sinh 10 mg/l hygromycin tương đồng với nghiên trưởng, vàng chết Bảng cho thấy kết cứu (Phan Lê Tư ctv, 2018) Kết quả thu nhận thời gian ngày đồng Hình cho thấy, chồi giả định chuyển nuôi cấy: mẫu chồi đợt (2,5%), mẫu gene chuyển lên môi trường chọn lọc chồi đợt (1,67%); thời gian ngày chứa mg/l hygromycin phát triển với tỷ đồng nuôi cấy: mẫu chồi đợt (5,0%) lệ mẫu sống 90% nhiên phần Mẫu chồi đậu nành sống mơi trường mầm có dấu hiệu vàng, xuất đốm 10 mg/l hygromycin kiểm tra đen mầm chồi phát sinh, trụ mầm phương pháp PCR chuyển sang mơi trường bị hố nâu Sau 28 ngày, mẫu chồi vươn chồi chuyển lên môi trường chọn lọc chứa 10 Bảng Kết chọn lọc chồi giả định chuyển gene đậu nành DT22 Tỷ lệ mẫu sống (%) Đồng nuôi Đợt +5 mg/l hygromycin, +10 mg/l hygromycin, cấy 28 ngày 28 ngày 96,0 (24/25) 12,0 (3/25) 92,3 (24/26) 7,69 (2/26) 93,6 (44/47) 12,8 (6/47) Kết điện di sản phẩm PCR (Hình 4) cho thấy dịng giả định chuyển gene có xuất băng DNA có kích thước khoảng 500 bp so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thước gene hptII khuếch đại 507 bp), phù hợp với kích thước gene hptII plasmid kích thước gene hptII chồi đậu nành chuyển gene thành công nghiên cứu trước Trong mẫu đối chứng âm (-) (cây khơng chuyển gene) cho kết âm tính Do đó, khẳng định diện gene hptII mẫu thí nghiệm 93 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học Hình Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra diện gene hptII mẫu chồi giả định chuyển gene (L) Hyper Ladder 100bp, Bioline;(P) plasmid; (+) đối chứng dương; (-) đối chứng âm; (1 - 11) tương ứng với dòng giả định chuyển gene giống DT22 Hiệu chuyển nạp cao tiền đề nhằm nghiên KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ cứu chức gene chọn giống theo Dựa vào trình tự gene Minc14137, cấu trúc phương pháp phân tử Chuyển gene gián tiếp amiRNA có khả bất hoạt biểu thông qua vi khuẩn A tumefaciens phương gene tổng hợp biến nạp pháp thường dùng để cải tiến giống trồng, thành công vào vi khuẩn A tumefaciens bốn yếu tố ảnh hưởng đến hiệu LBA4404 để tạo đậu nành biến đổi gene xâm nhiễm vi khuẩn Agrobacterium Thời gian đồng nuôi cấy ngày giúp tăng số bao gồm mật độ vi khuẩn, giống đậu nành, môi mẫu tạo chồi sau lây nhiễm hiệu trường huyền phù thời gian đồng nuôi cấy chuyển nạp gene so với thời gian đồng nuôi Thời gian đồng nuôi cấy ngày giống đậu cấy ngày Cần tiếp tục cải tiến quy trình nành DT22 giúp tăng tỷ lệ mẫu cảm ứng, từ chuyển gene tạo đậu nành, sau thực tăng số chồi tái sinh hiệu chuyển nạp khảo sát thực tế với tuyến trùng M incognita gene TÀI LIỆU THAM KHẢO MELITO S., HEUBERGER A.L., COOK D., DIERS B.W., MACGUIDWIN A.E., BENT A.F 2010 A nematode demographics assay in transgenic roots reveals no significant impacts of the Rhg1 locus LRR-Kinase on soybean cyst nematode resistance BMC Plant Biol 10: 104 NGUYỄN VŨ PHONG 2018 Tạo vector biểu chứa cấu trúc microRNA nhân tạo nhằm bất hoạt gene tuyến trùng Meloidogyne incognita Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp.2: 48-49 PHAN LÊ TƯ, TÔN BẢO LINH, NGUYỄN VŨ PHONG (2018) Đánh giá khả tái sinh chuyển gene nhờ vi kh��= Agrobacterium tumefaciens số giống đậu nành Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp.1: 8-15 SCHWAB R, OSSOWSKI S, RIESTER M, WARTHMANN N, WEIGEL D, 2006 Highly specific gene silencing by artificial miRNAs in Arabidopsis Plant Cell 18: 1121- 1133 TRẦN THỊ CÚC HỊA (2008) Tối ưu hóa quy trình chuyển nạp gene đậu tương cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn 9: 8-11 94 ... kỹ thuật PCR overlapping Cấu trúc amiRNA sau nhân dịng vector pJET1.2/blunt (Thermo Scentific) giải trình tự nhằm đảm bảo tính xác trước gắn vào vector biểu Gắn cấu trúc amiRNA vào vector biểu... vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp pSM103-amiRNA tạo dòng tế bào E coli TOP10 khả biến phương pháp sốc nhiệt, sau biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 để chuyển cấu trúc amiRNA vào chủ Chuẩn... mẫu chồi giả định chuyển gene (L) Hyper Ladder 100bp, Bioline;(P) plasmid; ( +) đối chứng dương; ( -) đối chứng âm; (1 - 1 1) tương ứng với dòng giả định chuyển gene giống DT22 Hiệu chuyển nạp cao