Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5 2016 Trang 105 Tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành cây Lily Sorbonne Trần Thanh Thắ[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 Tìm hiểu ảnh hưởng chất điều hịa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily Sorbonne Trần Thanh Thắng Trần Thanh Hương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 27 tháng 07 năm 2016, nhận đăng ngày 02 tháng 12 năm 2016) TÓM TẮT phân chia tế bào với hình thành tế bào có Trong nghiên cứu này, chất điều hòa nhân to, vách mỏng không chứa hạt tăng trường thực vật 2,4-dichlorophenoxyacetic tinh bột; tạo vùng phát sinh hình thái chồi; hình acid (2,4-D), picloram, 6-benzylaminopurine thành mơ phân sinh chồi cuối (BA) hay thidiazuron (TDZ) nồng độ khác chồi với phác thể Trong phát sinh chồi nhau, riêng lẻ hay phối hợp dùng để cảm có gia tăng cường độ hơ hấp, hoạt tính IAA ứng phát sinh chồi từ vảy hành Lily Sorbonne zeatin Sự dùng chất ức chế vận chuyển Các biến đổi hình thái sinh lý trình auxin,1-naphthoxyacetic acid (1-NOA) N-1hình thành chồi phân tích Sự phát sinh naphthylphthalamic acid (NPA) cho thấy vai trò chồi đạt cao môi trường Murashige di chuyển hữu cực auxin Skoog (MS) có phối hợp bổ sung 2,4-D phát sinh chồi Mối liên hệ chất điều mg/L, BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L indole-3hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hô hấp acetic acid (IAA) 0,5 mg/L Sự hình thành chồi có phát sinh chồi thảo luận nguồn gốc từ tế bào nhu mơ cách biểu bì vài lớp tế bào trải qua giai đoạn: hoạt hóa Từ khóa: chất điều hòa tăng trưởng thực vật, Lily, di chuyển hữu cực auxin, phát sinh chồi, vảy hành MỞ ĐẦU Lily lồi hoa có giá trị kinh tế cao xếp thứ bảy thị trường hoa cắt cành giới thứ hai lồi hoa thuộc nhóm thực vật có hành sau Tulip nhờ đa dạng màu sắc, hình dạng, hương thơm độ bền [1] Ngoài ra, Lily cịn loại thảo dược có giá trị chứa nhiều hợp chất thứ cấp acid gallic, rutin, epicatechin [2] Trong tự nhiên, Lily phát triển từ hột hành Tuy nhiên, nảy mầm hột Lily cần thời gian dài (khoảng tháng) Bên cạnh đó, tỉ lệ nảy mầm hột thấp sau nảy mầm tăng trưởng chậm dẫn đến thời gian cần để hoa bị kéo dài Do đó, sản xuất, hành Lily thường sử dụng làm giống giúp rút ngắn thời gian để thu hoạch hoa Hiện nay, Việt Nam hành giống Lily phần lớn nhập từ nước từ việc giâm vảy hành điều kiện vườn ươm Tuy nhiên, phương pháp gặp nhiều khó khăn hệ số nhân giống thấp, chất lượng giống không đồng điều dễ bị thối hóa Bên cạnh đó, việc tạo hành giống theo phương pháp dễ làm lây lan bệnh nấm virus Vi nhân giống điều kiện in vitro phương pháp giúp tạo số lượng lớn đồng tương đối bệnh [3] Chính vậy, chúng tơi tiến hành phân tích thay đổi hình thái Trang 105 Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 sinh lý trình phát sinh chồi in vitro từ vảy hành Lily Sorbonne VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Hành (củ) Lily tuần tuổi (Hình 1) tăng trưởng môi trường Murashige Skoog (MS) [4], có nguồn gốc từ ni cấy vảy hành Lily trồng vườn Phương pháp Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật riêng lẻ phát sinh chồi từ vảy hành Lily Các vảy hành có chiều rộng khoảng cm dài cm từ hành Lily in vitro tuần tuổi tăng trưởng môi trường MS cô lập cấy vào erlen 100 mL chứa 30 mL mơi trường MS hay MS có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật riêng lẻ, nồng độ thay đổi sau: Picloram nồng độ 1, 2, hay mg/L; 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) nồng độ 0,5; 1,0; 2,0 hay 3,0 mg/L; 6-Benzylaminopurine (BA) nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 hay 2,0 mg/L; hay Thidiazuron (TDZ) (0,05; 0,10; 0,15 hay 0,20 mg/L) Các mẫu cấy đặt nuôi tối, nhiệt độ 22 ± oC ẩm độ 58 ± % Thí nghiệm lặp lại lần, lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi số vảy lá/chồi xác định Khảo sát ảnh hưởng phối hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily Các vảy hành có chiều rộng khoảng cm dài cm từ hành Lily in vitro tuần tuổi tăng trưởng môi trường MS cô lập cấy vào erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường MS có bổ sung 2,4-D mg/L riêng lẻ hay phối Trang 106 hợp với BA (0,5; 1,0; 1,5 hay 2,0 mg/L) hay TDZ (0,05; 0,10; 0,15 hay 0,20 mg/L) Các mẫu cấy đặt nuôi tối, nhiệt độ 22 ± oC ẩm độ 58 ± % Thí nghiệm lặp lại lần, lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi số vảy lá/chồi xác định Quan sát biến đổi hình thái Các biến đổi hình thái trình phát sinh chồi từ vảy hành quan sát trực tiếp, dùng kính hiển vi soi hay kính hiển vi quang học sau cắt tay hay máy vi phẫu Sự cắt máy vi phẫu thực sau: Mẫu cấy cố định dung dịch FAA (ethanol 70 % : formalin : acetic acid = 8:1:1 v/v) Sau 18 giờ, loại FAA ethanol 70 % đặt chuỗi dung dịch ethanol (80, 85, 90, 95, 100 %) butanol Sau loại nước, mẫu vùi parafin tan 56 oC (mã số 1.07337.1000, Merck) cắt dọc thành lát mỏng µm máy vi mẫu (Rotary microtome, Microm HM340E) Các lát mỏng parafin mang mẫu dán lam nhờ dung dịch gelatin % Sự loại parafin thực nhờ chuỗi dung dịch methylcyclohexan, ethanol (100, 95, 85, 70, 50, 30) nước cất [5] Cuối cùng, mẫu nhuộm phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin – xanh iod quan sát kính hiển vi quang học Đo cường độ hơ hấp Cường độ hơ hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/giờ) mẫu cấy xác định điện cực oxygen dựa giảm tỉ lệ oxygen buồng đo (LeafLab2, Hansetech) theo thời gian, nhiệt độ 22 oC, tối Kết giá trị trung bình lần lặp lại Ly trích đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin (indole-3-acetic acid) (IAA), cytokinin (zeatin), TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 gibberellin abcisic acid (ABA) có mẫu cấy ly trích lập cách dùng dung mơi thích hợp thực sắc ký mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), nhiệt độ 29 oC với dung môi di chuyển chloroform : methanol : acetic acid (80:15:5 v/v) Vị trí hormone tăng trưởng thực vật phát nhờ quan sát trực tiếp tia ultraviolet (UV) Hoạt tính hormone tăng trưởng thực vật đo sinh trắc nghiệm: diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) cho auxin acid abcisic, tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.) cho cytokinin mầm xà lách (Lactuca sativa L.) cho gibberellin [6, 7] Khảo sát ảnh hưởng chất ức chế vận chuyển auxin phát sinh chồi từ vảy hành Lily Các vảy hành có chiều rộng khoảng cm dài cm từ hành Lily in vitro tuần tuổi tăng trưởng môi trường MS cô lập cấy vào erlen 100 mL chứa 30 mL mơi trường MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L hay MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L N-1-Naphthylphthalamic acid (NPA) 3,45 mg/L (10 µM) (chất ức chế vận chuyển auxin khỏi tế bào) hay 1Naphthoxyacetic acid (1-NOA) 4,95 mg/L (10 µM) (chất ức chế vận chuyển auxin vào khỏi tế bào) Các mẫu cấy đặt nuôi tối, nhiệt độ 22 ± oC ẩm độ 58 ± % Thí nghiệm lặp lại lần, lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi số vảy lá/chồi xác định Áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily Các vảy hành có chiều rộng khoảng cm dài cm từ hành Lily in vitro tuần tuổi tăng trưởng môi trường MS cô lập cấy vào erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L hay MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L zeatin 0,2 mg/L IAA 0,2 mg/L Các mẫu cấy đặt nuôi tối, nhiệt độ 22 ± oC ẩm độ 58 ± % Thí nghiệm lặp lại lần, lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi, chiều rộng chồi số vảy lá/chồi xác định Xử lý thống kê Kết thí nghiệm phân tích chương trình thống kê SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) dùng cho Window phiên 15.0 Sự khác biệt có ý nghĩa mức 95 % giá trị thể mẫu tự chữ số kèm theo KẾT QUẢ Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật riêng lẻ phát sinh chồi từ vảy hành Lily Sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung auxin hay cytokinin riêng lẻ nồng độ thay đổi, tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt cao mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có bổ sung 2,4-D mg/L Số chồi/mẫu cấy đạt cao nuôi cấy mơi trường có bổ sung BA 1,5 hay mg/L Số vảy lá/chồi đạt cao mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có bổ sung BA hay 1,5 mg/L Chiều cao chồi đạt cao mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có bổ sung TDZ nồng độ 0,1; 0,15 hay 0,2 mg/L Trên mơi trường có bổ sung picloram, bên cạnh phát sinh chồi có hình thành mơ sẹo, nồng độ picloram cao hình thành mơ sẹo nhiều (Hình 2AE, Bảng 1) Trang 107 Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Bảng Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nồng độ thay đổi phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau tuần nuôi cấy Chất điều hòa Nồng độ tăng trưởng (mg/L) thực vật Đối chứng (MS) 0,50 1,00 2,4-D 2,00 3,00 1,00 2,00 Picloram 3,00 4,00 0,50 1,00 BA 1,50 2,00 0,05 0,10 TDZ 0,15 0,20 Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu cấy Chiều cao chồi (mm) Số vảy lá/chồi 22,22 ± 2,22f 51,11 ± 2,22d 75,55 ± 2,22a 64,45 ± 2,22bc 48,89 ± 2,22d 15,50 ± 1,50g 9,53 ± 1,84h 2,20 ± 1,50i 37,78 ± 2,22e 48,89 ± 2,22d 55,56 ± 4,44cd 64,45 ± 2,22bc 26,67 ± 0,00f 53,33 ± 6,67c 55,55 ± 2,22cd 66,67 ± 0,00b 1,33 ± 0,33cd 1,67 ± 0,33bcd 1,53 ± 0,26bcd 1,83 ± 0,17bc 1,33 ± 0,33cd 1,12 ± 0,12d 1,11 ± 0,26d 1,00 ± 0,04d 1,30 ± 0,15cd 1,88 ± 0,19bc 3,33 ± 0,17a 3,76 ± 0,15a 1,17 ± 0,08cd 1,48 ± 0,26cd 1,31 ± 0,03cd 1,13 ± 0,07d 5,50 ± 0,29e 5,67 ± 0,17e 7,50 ± 0,29cd 7,67 ± 0,33c 5,67 ± 0,33e 7,67 ± 0,33cd 6,67 ±0,33d 5,67 ± 0,33e 4,50 ± 0,29f 6,83 ± 0,17d 7,00 ± 0,00cd 7,17 ± 0,17cd 8,50 ± 0,29b 9,50 ± 0,29a 9,83 ± 0,17a 9,33 ± 0,33a 2,67 ± 0,33e 2,33 ± 0,33e 3,00 ± 0,00de 3,67 ± 0,33d 3,00 ± 0,58de 2,53 ± 0,67e 2,53 ± 0,33e 2,33 ± 0,33e 6,67 ± 0,33c 11,67 ± 0,33a 12,33 ± 0,33a 10,00 ± 0,00b 2,67 ± 0,33e 2,67 ± 0,33e 2,67 ± 0,33e 3,00 ± 0,58e Sự hình thành mô sẹo + ++ +++ ++++ Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (-), Khơng có phát sinh chồi; (+), Mẫu cấy có hình thành mơ sẹo Ảnh hưởng phối hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily Sau tuần ni cấy mơi trường MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L BA hay TDZ nồng độ thay đổi, tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt cao mơi trường có bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L Số chồi/mẫu cấy đạt cao mơi trường có bổ sung 2,4-D mg/L BA nồng độ 1,5 mg/L hay mg/L Sự phối hợp bổ sung 2,4-D với BA hay TDZ nồng độ thay đổi không giúp gia tăng chiều cao chồi Sự bổ sung BA nồng độ khác (0,5-2,0 mg/L) giúp chồi gia tăng số vảy (Hình 2F, Bảng 2) Bảng Ảnh hưởng phối hợp 2,4-D BA hay TDZ nồng độ thay đổi phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau tuần ni cấy Chất điều hịa tăng Nồng độ trưởng thực vật (mg/L) Đối chứng (MS với 2,4-D mg/L) 0,50 1,00 BA 1,50 2,00 0,05 0,10 TDZ 0,15 0,20 Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) 75,55 ± 2,22b 71,11 ± 2,22b 68,89 ± 2,22b 84,45 ± 2,22a 73,33 ± 0,00b 55,56 ± 2,22d 71,11 ± 2,22b 62,22 ± 2,22c 57,78 ± 2,22cd Số chồi/mẫu cấy 1,53 ± 0,26d 2,33 ± 0,17c 3,00 ± 0,29b 4,43 ± 0,07a 4,53 ± 0,17a 1,17 ± 0,17d 1,23 ± 0,15d 1,17 ± 0,17d 1,07 ± 0,17d Chiều cao chồi (mm) 7,50 ± 0,29a 5,17 ± 0,17cd 4,23 ± 0,15e 4,10 ± 0,06e 4,07 ± 0,15e 5,73 ± 0,15b 5,13 ± 0,07d 4,50 ± 0,29e 4,53 ± 0,29e Số vảy lá/chồi 3,00 ± 0,00c 12,67 ± 0,33a 13,00 ± 0,00a 13,33 ± 0,33a 13,33 ± 0,33a 3,33 ± 0,33c 6,00 ± 0,58b 3,67 ± 0,33c 3,00 ± 0,00c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Trang 108 TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 Sự phát sinh hình thái chồi Vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy, tế bào nhu mô vảy hành có xếp tương đối đồng chứa nhiều hạt tinh bột (Hình 3) Sau ngày ni cấy, số tế bào nhu mơ biểu bì hoạt hóa phân chia Các tế bào trạng thái phân chia có nhân to khơng chứa hạt tinh bột (Hình 4) Sau 10 ngày ni cấy, vùng phát sinh hình thái chồi xuất với diện tế bào có kích thước nhỏ, nhân to khơng chứa hạt tinh bột (Hình 5) Sau 17 ngày ni cấy, vịm mô phân sinh chồi giai đoạn phân chia hình thành phác thể hình thành (Hình 6) Sau 20 ngày ni cấy, xuất vịm mô phân sinh chồi với hai phác thể (Hình 7) sau 24 ngày ni cấy, xuất chồi hồn chỉnh (Hình 8) Cường độ hô hấp Cường độ hô hấp mẫu cấy tăng trưởng mơi trường MS có phối hợp bổ sung 2,4D mg/L BA 1,5 mg/L cao so với mẫu cấy tăng trường môi trường MS khơng hay có bổ sung 2,4-D hay BA riêng lẻ (Bảng 3) Bảng Cường độ hô hấp mẫu cấy phát sinh chồi môi trường khác sau tuần ni cấy Các chất điều hịa tăng trưởng thực vật xử lý Đối chứng (MS) 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L Cường độ hơ hấp (µL O2/ g trọng lượng tươi/giờ) 40,48 ± 7,70b 45,01 ± 7,12b 50,17 ± 2,17b 57,88 ± 3,46a Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật Hoạt tính IAA gibberellin đạt cao mẫu cấy tăng trưởng môi trường MS có bổ sung 2,4-D mg/L Hoạt tính zeatin đạt cao mẫu cấy tăng trưởng mơi trường MS có bổ sung BA 1,5 mg/L, thấp mẫu cấy tăng trưởng môi trường MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L với BA 1,5 mg/L thấp mẫu cấy tăng trưởng mơi trường MS hay MS có bổ sung 2,4-D mg/L Hoạt tính ABA đạt cao mẫu cấy tăng trưởng môi trường đối chứng MS (Bảng 4) Bảng Hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật mẫu cấy phát sinh chồi môi trường khác sau tuần nuôi cấy Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật xử lý Đối chứng (MS) 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh (mg/L) IAA Zeatin Gibberellin ABA 0,39 ± 0,05b 0,15 ± 0,02c 0,17 ± 0,02b 0,61 ± 0,01a 0,84 ± 0,01a 0,15 ± 0,01c 0,37 ± 0,08a 0,19 ± 0,02b b a b 0,41 ± 0,02 0,52 ± 0,03 0,15 ± 0,04 0,16 ± 0,03b b b b 0,32 ± 0,03 0,33 ± 0,01 0,17 ± 0,02 0,14 ± 0,03b Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Ảnh hưởng chất ức chế vận chuyển auxin phát sinh chồi từ vảy hành in vitro Sau tuần nuôi cấy, xử lý với NPA 3,45 tạo chồi mẫu cấy Tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi mg/L hay 1-NOA 4,95 mg/L (các chất ức chế giảm mạnh xử lý với 1-NOA (Hình 2Gvận chuyển auxin) làm giảm khả H, Bảng 5) Trang 109 Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Bảng Ảnh hưởng chất ức chế vận chuyển auxin phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau tuần nuôi cấy Xử lý Đối chứng * NPA 3,45 mg/L Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) 84,45 ± 2,22a 66,67 ± 0,00b Số chồi/mẫu cấy 4,43 ± 0,07a 2,17 ± 0,17b Chiều cao chồi (mm) 4,10 ± 0,06a 3,67 ± 1,86ab Số vảy lá/chồi 13,33 ± 0,33a 12,67 ± 0,67a 33,33 ± 19,25c 1,67 ± 0,33b 3,33 ± 0,33b 11,67 ± 1,93a 1-NOA 4,95 mg/L Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (*), MS có bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L Áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily in vitro Sự phối hợp bổ sung zeatin 0,2 mg/L IAA chồi/mẫu cấy Chiều rộng chiều cao chồi, số 0,5 mg/L vào môi trường 2,4-D mg/L BA vảy lá/chồi khơng có thay đổi (Hình 2I, Bảng 1,5 mg/L giúp gia tăng tỉ lệ mẫu tạo chồi số 6) Bảng Áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau tuần nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ mẫu tạo chồi Số chồi/mẫu cấy Chiều rộng chồi (mm) Chiều cao chồi (mm) Số vảy lá/chồi Chất điều hòa tăng trưởng thực vật áp dụng (mg/L) Đối chứng * Zeatin 0,2 mg/Lvà IAA 0,5 mg/L 84,45 ± 2,22 100,00 ± 0,00 4,43 ± 0,07 5,17 ± 0,17 3,67 ± 0,67 4,77 ± 0,33 4,10 ± 0,06 4,33 ± 0,33 13,33 ± 0,33 13,67 ± 0,67 T-Test + + - (+), Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (T-Test) (*), MS với 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L THẢO LUẬN Vào thời điểm trước ni cấy, tế bào nhu mơ biểu bì vảy hành Lily có xếp tương đối đồng Tuy nhiên, đóng vai trị mơ dự trữ, tế bào chứa nhiều hạt tinh bột (Hình 3) Sau ngày ni cấy mơi trường có bổ sung phối hợp 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L, tế bào nhu mô hoạt hóa phân chia để hình thành vùng phát sinh hình thái (Hình 4) với diện tế bào có nhân to, vách mỏng hạt tinh bột nhỏ (hay khơng cịn) Các đặc điểm hình thái tìm thấy tế bào mơ phân sinh chồi có khả phát sinh quan [8] hay tế bào dịch treo có khả phát sinh phơi chuối Cau Mẵn [9] Các hạt tinh bột nhỏ thường xem dấu hiệu dùng tinh bột dự trữ cho phản ứng biến dưỡng tế bào phân hóa tế bào [10] Chính vậy, sau 10 ngày Trang 110 ni cấy, vùng phát sinh hình thái chồi hình thành gồm nhóm tế bào nhỏ có nhân to, tế bào chất đậm đặc khơng cịn chứa hạt tinh bột (Hình 5) Sau đó, vùng phát sinh hình thái tiếp tục phát triển để hình thành mô phân sinh chồi với diện sơ khởi vào ngày thứ 17 (Hình 6), mơ phân sinh chồi với hai phác thể vào ngày 20 (Hình 7) chồi vào ngày 24 (Hình 8) Như vậy, tương tự phát sinh chồi từ số đối tượng thực vật hay từ mô phân sinh chồi chuối, phát sinh chồi từ vảy hành Lily trải qua giai đoạn: hoạt hóa phân chia tế bào, tạo vùng phát sinh hình thái chồi, hình thành mô phân sinh chồi cuối chồi với phác thể Ở nồng độ, khả cảm ứng tạo chồi 2,4-D mạnh so với picloram (Hình 2B-C, Bảng 1) Theo Bukowska (2006), 2,4-D TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 picloram có vai trị giúp tế bào vào đường phản phân hóa [11] Sau đó, 2,4-D giúp tế bào tiếp tục vào đường tái phân hóa trở trạng thái mơ phân sinh cấp hai hoạt động phân hóa thành chồi Trong đó, picloram auxin mạnh, thường sử dụng chất cảm ứng có tác dụng khử phân hóa tế bào q trình tạo mơ sẹo hay phơi thể hệ Có lẽ, tác động q mạnh picloram phân chia tế bào cản tế bào vào đường tái phân hóa để hình thành mơ phân sinh cấp hai hoạt động, làm giảm khả phát sinh chồi Ảnh hưởng nồng độ auxin phát sinh chồi thể rõ tăng nồng độ 2,4-D từ đến mg/L Tỉ lệ mẫu tạo chồi giảm dần theo gia tăng nồng độ 2,4-D (Bảng 1) Theo Bùi Trang Việt (2000), gia tăng nồng độ 2,4-D dẫn đến cạnh tranh thể nhận phân tử auxin làm hình thành phức hợp bất hoạt auxin mang hai thể nhận [10] Do đó, truyền tín hiệu nội bào khơng xảy Bên cạnh việc dùng auxin riêng lẻ, TDZ (một chất điều hòa tăng trưởng thực vật vừa có hoạt tính auxin vừa có hoạt tính cytokinin) thường sử dụng cho khả tạo chồi hiệu giống trồng Lily L oxypetalum, L longforium, [12, 13] Tuy nhiên, nghiên cứu này, với giống trồng Sorbonne, việc xử lý TDZ không đạt hiệu cảm ứng cao trình tạo chồi 2,4-D hay BA (Bảng 1) Điều khác kiểu gene Ảnh hưởng BA phát sinh chồi ghi nhận nhiều đối tượng thực vật [8], [10] Trong phát sinh chồi từ vảy hành Lily, bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy giúp mẫu cấy gia tăng số chồi mà gia tăng số vảy chồi Sự phát sinh chồi hoạt động sinh lý mạnh mẫu cấy đòi hỏi nguồn lượng lớn để cung cấp cho hoạt động phân chia tế bào Cường độ hô hấp mẫu cấy vảy hành tăng trưởng mơi trường có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L gia tăng mạnh so với mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có bổ sung 2,4-D hay BA riêng lẻ (Bảng 3) Điều dẫn đến khả phát sinh chồi mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L cao so với mẫu cấy tăng trưởng mơi trường cịn lại (Bảng 2) Ngồi việc cung cấp lượng, hoạt động hô hấp tế bào cung cấp sản phẩm biến dưỡng tiền chất cho trình sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh Trong trường hợp vảy hành Lily, tăng mạnh hoạt tính IAA hay zeatin mẫu cấy vảy hành khơng phải yếu tố giúp cho phát sinh chồi xảy mạnh nhất, mà diện IAA zeatin với nồng độ thích hợp yếu tố định (Bảng 5) Thật vậy, việc xử lý phối hợp IAA 0,5 mg/L zeatin 0,2 mg/L vào môi trường nuôi cấy giúp gia tăng tỉ lệ mẫu tạo chồi số chồi/mẫu cấy (Bảng 6) Bên cạnh tác động phối hợp với cytokinin, di chuyển hữu cực auxin có vai trị quan trọng tạo chồi Sự dùng 1-NOA NPA, chấ t ức chế sự di chuyể n của auxin , chứng minh tác động di chuyển hữu cực auxin tạo chồi Khả tạo chồi mẫu cấy tăng trưởng môi trường có diện 1-NOA (4,95 mg/L) hay NPA (3,45 mg/L) giảm mạnh so với đối chứng Theo Balzan cộng (2014), vận chuyển hữu cực auxin điều hòa hoạt động phức hợp protein đóng vai trị thể mang auxin vào tế bào (AUX, LAX ABCB) khỏi tế bào (PIN ABCB) [14] Các nghiên cứu gần cho thấy NPA ức chế hoạt động thể mang auxin khỏi tế bào 1-NOA vừa ức chế hoạt động thể mang auxin vào tế bào vừa có khả ức chế hoạt động thể mang auxin khỏi tế bào [15] Điều giải thích khả phát sinh chồi mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có diện 1-NOA thấp so với mẫu cấy tăng trưởng mơi trường có NPA (Hình G-H, Bảng 5) Cùng với tác động phối hợp zeatin auxin, giảm hoạt tính ABA mẫu cấy Trang 111 Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 góp phần giúp gia tăng tạo chồi (Hình 2F-I, Hình 4-6) IAA zeatin có vai trị cảm ứng tạo chồi ABA ngược lại, cản trình [10] KẾT LUẬN Sự phát sinh chồi từ vảy hành Lily in vitro có nguồn gốc từ tế bào nhu mơ cách biểu bì vài lớp tế bào, trải qua giai đoạn: hoạt hóa phân chia tế bào với hình thành tế bào có nhân to, vách mỏng không chứa hạt tinh bột; tạo vùng phát sinh hình thái chồi; hình thành mơ phân sinh chồi cuối chồi với phác thể Mơi trường MS có phối hợp bổ sung 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L IAA 0,5 mg/L thích hợp cho phát triển chồi từ vảy hành Lily Trong phát sinh chồi có gia tăng cường độ hơ hấp, hoạt tính IAA zeatin Sự dùng 1-NOA (4,95 mg/L) hay NPA (3,45 mg/L) cho thấy vai trò di chuyển hữu cực auxin phát sinh chồi Role of plant growth regulators on shoot formation from bulb sacles of Lily Sorbonne Tran Thanh Thang Tran Thanh Huong University of Science, VNU-HCM ABTRACT In this study, plant growth regulators included 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), picloram, 6-benzylaminopurine (BA) and thidiazuron (TDZ), at different concentrations were used individually or in combination to induce adventitious shoots from bulb scales of Lily Sorbonne Morphological and physiological changes in shoot formation from bulb scales were analysed The maximum number of shoots per explant were obtained on Murashige and Skoog medium (MS) supplemented with 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L and indole-3-acetic acid (IAA) 0,5 mg/L The adventitious shoots were derived from parenchymal cells, which placed under epidermis cells This process included the following stages: activation of cell division with large nucleus, thin-walled and without starch granules; initiating of meristematic region; formation of shoot primordium and shoot with leaves Use of 1naphthylphthalamic acid (1-NOA) and N-1naphthoxyacetic acid (NPA), auxin transport inhibitors, showed the role of polar auxin transport in shoot formation The correlation of plant hormone, respiration rate and shoot formation from bulb scales was discussed Key words: adventitious shoots, bulb scales, Lily, plant growth regulators, polar auxin transport TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A.V Varshney, P.S Dhawan, Srivastava, A protocol for in vitro mass propagation of asiatic hybrids of Lily through liquid stationary culture, In Vitro Cell Develop, 36, 383–391 (2000) Trang 112 [2] J Lei, Z Yanlong, Y Linmao, G Yulong, N Lixin, Phenolic compounds and antioxidant activity of bulb extracts of xix Lilium species native to China, Molecules, 17, 9361–9378 (2012) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] T.T Vân, V.T Đông, Cơ sở khoa học kỹ thuật sản xuất hoa Lily, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội (2005) T Murashige, F Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures, Plant Physiol, 15, 3, 473–497 (1962) K.S Lee, F.J Zapata-Arias, H Brunner, R Afza, Histology of somatic embryoinitiation and organogenesis from rhizome explants of Musa sp., Tissue and Organ Culture, 51, 1–8 (1997) H Meidner, Class experiments in Plant Physiology, George Allen and Unwin, London (1984) B.T Việt, Tìm hiểu hoạt động chất điều hòa sinh trưởng thực vật thiên nhiên tượng rụng "bông" "trái non" Tiêu (Piper nigrum L.), Tập san khoa học ĐHTH TPHCM, 1, 155–165 (1992) T.H Tran, T.V Bui, T.Y Feng, Role of plant growth regulators on shoot development of shoot apical meristems of banana genotypes Acta Hort, 1114, 211– 218 (2016a) T.H Tran, T.V Bui, T.Y Feng, The role of auxin and cytokinin on somatic embryogenesis from cell suspension [10] [11] [12] [13] [14] [15] cultures of the banana cultivar 'Cau Man', Acta Hort, 1114, 219–226 (2016b) B.T Việt, Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh (2000) B Bukowska, Toxicity of 2,4Dichlorophenoxyacetic acid – molecular mechanisms, Polish J of Environ Stud., 15, 3, 365–374 (2006) L Bacchetta, P.C Remotti, C Bernardini, F Saccardo, Adventitious shoot regeneration from leaf explants and stem nodes of Lilium, Plant Cell Tissue Organ Cult, 74, 37–44 (2003) X LingFei, M FengWang, L Dong, Plant regeneration from in vitro cultured leaves of Lanzhou Lily (Lilium davidii var unicolor), Sci Hortic, 119, 458–461 (2009) S Balzan, G.S Johal, N Carraro, The role of auxin transporters in monocots development, Frontiers in plant science, 5, 380–393 (2014) P Klíma, M Laňková, E Zažímalová, Inhibitors of plant hormone transport, Protoplasma, 253, 6, 1–14 (2015) mm Hình Hành Lily in vitro tuần tuổi tăng trưởng môi trường MS Trang 113 Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 A B mm D C E mm G F mm mm H mm mm mm I mm mm Hình Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily in vitro sau tuần nuôi cấy điều kiện tối (A), MS (B), MS với 2,4-D mg/L (F), MS với 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L (C), MS với picloram mg/L (G), MS với 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L NPA 3,45 mg/L (D), MS với TDZ 0,1 mg/L (H), MS với 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L NOA 4,95 mg/L (E), MS với BA 1,5 mg/L (I), MS với 2,4-D mg/L, BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L IAA 0,5 mg/L Trang 114 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 Hình Lát cắt ngang qua vảy hành in vitro (mẫu cấy ngày 0) với diện tế bào nhu mô chứa nhiều hạt tinh bột Hình Sự hình thành vùng phát sinh hình thái (mũi tên) sau 10 ngày nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L Hình Lát cắt ngang qua mẫu cấy tăng trưởng mơi trường MS có bổ sung 2,4-D mg/L BA 1,5 mg/L sau ngày nuôi cấy Mũi tên: tế bào phân chia chuẩn bị cho hình thành vùng phát sinh hình thái Hình Vịm mơ phân sinh chồi (mũi tên) giai đoạn chuẩn bị hình thành phác thể sau 17 ngày nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/L BA 1,5 mg/L Trang 115 Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Hình Vịm mơ phân sinh chồi với hai phác thể sau 20 ngày nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/L BA 1,5 mg/L Trang 116 Hình Chồi hồn chỉnh sau 24 ngày ni cấy mơi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/L BA 1,5 mg/L ... tạo chồi, số chồi/ mẫu cấy, chiều cao chồi số vảy lá /chồi xác định Áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh chồi từ vảy hành Lily Các vảy hành có chiều rộng khoảng cm dài cm từ hành Lily. .. trưởng môi trường đối chứng MS (Bảng 4) Bảng Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật mẫu cấy phát sinh chồi môi trường khác sau tuần ni cấy Các chất điều hịa tăng trưởng thực vật xử lý Đối. .. phân sinh chồi với diện sơ khởi vào ngày thứ 17 (Hình 6), mơ phân sinh chồi với hai phác thể vào ngày 20 (Hình 7) chồi vào ngày 24 (Hình 8) Như vậy, tương tự phát sinh chồi từ số đối tượng thực vật