CHƯƠNG 1 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ GIỚI THIỆU Nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú và đa dạng, bao gồm động vật, thực vật Trong đó, dược liệu từ cây cỏ vẫn có vị trí qua[.]
Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ GIỚI THIỆU Nguồn dược liệu Việt Nam phong phú đa dạng, bao gồm động vật, thực vật Trong đó, dược liệu từ cỏ có vị trí quan trọng thành phần, chủng loại giá trị sử dụng Ngoài phong phú, thảo dược cịn có giá trị chỗ sử dụng rộng rãi cộng đồng để chữa nhiều bệnh khác Một thuốc nam sử dụng nhiều nhân dân Bình vơi Cây Bình vơi có tên khoa học Stephania spp, họ Tiết dê (Menispermaceae), loại dây leo, phần thân phát triển thành củ to, bám vào núi đá, có củ to, nặng tới 40kg, da thân củ màu nâu đen, xù xì giống hịn đá, củ cịn gọi “củ một”, “củ mối trơn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”, “củ gà ấp”, “cà tom” (đồng bào Thổ) Cây Bình vơi thường ưa mọc vùng có núi đá tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Hồ Bình, Hà Tây (cũ), Nam Hà, Ninh Bình, Hải Phịng, Cao Bằng, Lạng sơn, Thanh Hố v.v Củ Bình vơi chứa alkaloid với hàm lượng khác loài Các alkaloid L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin, có dược tính cao Đặc biệt rotundin với tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hồ tim, giãn trơn, giảm đau co thắt trơn… Nghiên cứu thành phần, cấu tạo dược tính hợp chất alkaloid Bình vơi nhằm bào chế dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên phục vụ cho nhu cầu sức khỏe người Do đó, việc chiết tách hợp chất alkaloid Bình vơi nghiên cứu phát triển Chun ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ NỘI DUNG CHƯƠNG I: CƠ SỞ LÝ LUẬN 1.1.Khái niệm alkaloid Alkaloid hợp chất hữu có chứa nitơ đa số có nhân vịng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật đơi động vật, thường có dược lực tính mạnh độc, cho kết tủa phản ứng màu với số thuốc thử gọi thuốc thử alkaloid (R.H.F Manske, 1973) 1.2.Phân bố Theo Carey, A.Francis (1987), alkaloid thường chứa phận hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Đôi phận giàu alkaloid phận khác lại khơng có Lượng alkaloid tỷ lệ thành phần alkaloid thay đổi tùy theo mùa thu hái, tuổi cây, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng… Trong thường chứa alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống Đặc biệt số có chứa vài chục alkaloid thuốc phiện, canhkina Các alkaloid tồn dạng muối với hợp chất hữu acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic Tỉ lệ phần trăm alkaloid phận cao từ 10 đến 15% thấp vài phần nghìn, chí vài phần vạn Thảm thực vật vùng nhiệt đới thường có nhiều có chứa alkaloid với hàm lượng cao 1.3.Sự tạo thành alkaloid Trước người ta cho nhân alkaloid chất đường hay thuộc chất chất đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh Ngày phương pháp dùng nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh alkaloid tạo từ acid amin Qua định tính định lượng alkaloid phận khác theo dõi thay đổi chúng trình phát triển người ta thấy nơi tạo alkaloid khơng phải ln ln nơi tích tụ alkaloid Nhiều alkaloid tạo rễ lại Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ vận chuyển lên phần mặt đất cây, sau thực biến đổi thứ cấp chúng tích lũy lá, hạt (Carey, A.Francis, 1987) 1.4.Tính chất chung alkaloid Theo Phan Đình Châu (1997), alkaloid thường có cấu trúc phức tạp gồm có C, H, N, O, nitơ thường nằm mạch vịng (dị vịng có nitơ) mang lại tính kiềm cho Chúng có số tính chất lí hóa sau: 1.4.1.Tính chất lí học Thể trạng: Alkaloid thường chất có trọng lượng phân tử cao, thường thể rắn nhiệt độ thường.Các alkaloid thể rắn thường alkaloid không bay hơi, alkaloid bay thường thể lỏng Các alkaloid thể rắn thường chất kết dễ kết tinh có độ chảy xác định.Một số alkaloid khơng đo độ chảy bị phá hủy nhiệt độ thấp độ chảy Các alkaloid dạng lỏng nhiệt độ thường thường oxy phân tử (nicotin, spartein ) Các alkaloid dạng lỏng dạng tự tạo muối với acid chuyển sang thể rắn (spartein thể lỏng spartein sulfat thể rắn) Tuy nhiên có trường hợp ngoại lệ số alkaloid có oxy phân tử thể lỏng arecolin , pilocarpin Màu sắc Đa số alkaloid thường không màu màu trắng (các alkaloid có nitơ bậc 3), số có màu vàng (các alkaloid hydroxyd amoni bậc 4) Ngoài có số alkaloid dạng base khơng màu muối với acid lại có màu (Ví dụ sanguinarin base khơng màu muối có màu đỏ) Mùi vị Alkaloid thường có vị đắng Độ tan Alkaloid thường không tan nước, trừ số trạng thái lỏng nicotin dễ tan nước Alkaloid tan tốt dung môi hữu cồn, benzene, toluene, diclomethan Ngược lại, muối với acid hữu vơ dễ tan nước Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ số dung môi hữu phân cực không tan dung môi hữu không phân cực Các dung môi hữu phân cực mạnh ethanol methanol thường hòa tan alkaloid dạng muối dạng base 1.4.2.Tính chất hóa học Tính kiềm: Alkaloid có nitơ hóa trị 3, có tính kiềm tương tự NH tác dụng với acid tạo muối Alkaloid có nitơ hóa trị tạo muối với acid loại bỏ nước Các muối thường bền vững bền alkaloid base trạng thái muối chúng khó biến thành đồng phân hỗ biến Mặt khác dạng muối với acid chúng tan tốt nước nên chúng thường dùng làm thuốc Độ bền vững muối alkaloid thủy phân phụ thuộc vào tính kiềm mạnh yếu khác alkaloid chất acid mà kết hợp với Alkaloid base yếu nên chúng dễ dàng bị base mạnh trung bình NaOH, Ca(OH)2, Na2CO3 đẩy khỏi muối chúng với acid tạo alkaloid base Tính chất alkaloid ứng dụng chiết xuất alkaloid từ dược liệu 1.5.Tầm quan trọng alkaloid Alkaloid nói chung chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất độc Tác dụng alkaloid thường khác loại khác Trên giới dùng nhiều thuốc tổng hợp khơng bỏ alkaloid lấy từ cỏ, có chất chưa tổng hợp được, có nhiều thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ chiết xuất tác dụng chất tổng hợp chưa tác dụng chất lấy từ Do người ta dùng phương pháp chiết xuất từ ví dụ ajmalin, morphin, reserpin, quinin, eserin…hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừa bán tổng hợp ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine, vincamin…( Phạm Thanh Kỳ et al 1997) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 2: CÂY BÌNH VƠI VÀ CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY 2.1.Chi Bình vơi (Stephania spp) 2.1.1.Phân loại khoa học Giới (regnum): Plantae (không phân hạng): Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ (ordo): Ranunculales Họ (familia): Menispermaceae Chi (genus): Stephania Lour Bảng Phân loại khoa học Chi Bình vơi (Stephania spp) ( nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_B%C3%ACnh_v%C3%B4i ) Chi Bình vơi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp, đồng nghĩa: Perichasma) chi thực vật có hoa họ Biển cát (Menispermaceae hay cịn gọi họ Tiết dê), có nguồn gốc miền đông nam châu Á Australasia Tên gọi dân dã tiếng Việt Bình vơi Tuy nhiên, nhiều lồi có tên gọi địa phương trùng nhau.(Thuy TT et al 2005) PlantSystematics.org liệt kê 120 danh pháp cho Chi Gồm số loài sau: Stephania aculeata (FM Bailey) Stephania bancroftii (FM Bailey) Stephania brevipes (Craib) Stephania cambodica (Gagnep.): bình vơi campuchia Stephania capitata ((Blume) Spreng.) Stephania cephalantha (Hayata): kim tuyến điếu ô quy, hán phịng kỷ, phấn phịng kỷ, bình vơi hoa đầu Stephamia corymbosa ((Blume) Walp.) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Stephania crebra (Forman) Stephania dielsiana (C.V.Wu): củ dòm, củ ngỗng, củ gà ấp Stephania elegans (Hook.f & Thomson) Stephania glabra ((Roxb.) Miers): bình vơi Stephania glandulifera (Miers) Stephania gracilenta (Miers) Stephania hernandiifolia ((Willd.) Walp.): dây lõi tiền Stephania hispidula (Yamamoto) Stephania japonica ((Thunb.) Miers): dây lõi tiền, thiên kim đằng, dây mối Stephania longa (Lour.): dây lõi tiền, phẩn đốc Stephania merrillii (Diels) Stephania oblata (Craib) Stephania papillosa (Craib) Stephania pierrei (Diels): bình vơi, dây đồng tiền Stephania reticulata (Forman) Stephania rotunda (Lour.): bình vơi, củ một, dây mối trơn, cà tịm (tiếng Tày), co cáy (tiếng Thái), củ gà ấp, tở lùng dịi (tiếng Dao) Stephania sinica (Diels): bình vôi Stephania suberosa (L.L.Forman) Stephania subpeltata (H.S.Lo) Stephania tetrandra (S Moore): thạch thiềm thừ, phòng kỷ, phấn phòng kỷ, hán phòng kỷ, đảo địa củng Stephania tomentella (Forman) Stephania venosa ((Blume) Spreng.) 2.1.2.Đặc điểm thực vật Theo Phạm Thanh Kỳ et al.(1997), loại Bình vơi có đặc điểm chung sau: Dây leo, thân nhẵn, thường xanh, gốc hóa gỗ,sống lâu năm Rễ phình to thành củ đa Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ dạng, to ( nặng 20kg ) vỏ ngồi xù xì màu nâu, nâu đen, hình dáng thay đổi tùy theo nơi củ phát triển Lá mọc so le, cuống dài, dính vào phiến khoảng 1/3, phiến hình tim gần trịn có cạnh tam giác trịn, mép ngun lượn song, hai mặt nhẵn, gân xuất phát từ chổ đính cuống lá, rõ mặt lá.Cụm hoa hình xim tán mọc kẽ cành già rụng lá; hoa đực hoa khác gốc; hoa đực có đài xếp thành hai vòng, cánh hoa màu vàng cam; nhị hàn liền thành tục với bao phấn màu vàng nhạt xếp thành vòng tròn Khi hoa nở bao phấn mở nắp ngang quay xung quanh Hạt phấn nhỏ màu vàng; hoa có đài; hai cánh hoa, bầu hình trứng Quả hạch hình cầu dẹt, chín có màu đỏ da cam, hạt cứng hình móng ngựa, hình trứng hình gần trịn tùy theo lồi Mùa hoa: tháng 26; mùa vào tháng 7-10 Hinh Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) 2.1.3.Phân bố, trồng hái chế biến Các loại Bình vơi nước ta có diện phân bố rộng ba miền Bắc, Trung, Nam Thường tập trung vùng núi đá vôi Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Vũng Tàu, Bà Rịa Riêng loài Stephania pierei Diels tập trung chủ yếu tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Hiện ta thu hái củ Bình vơi chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại Khi thu cạo vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi sấy khô đem chiết rotundin Có thể trồng Bình vơi hạt phần đầu củ Thu hái chín vào khoảng tháng 8-10, lấy hạt bảo quản cát ẩm gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2-3) Ngoài ươm giống từ hạt, cắt phần đầu củ để làm giống Mỗi đầu xẻ làm mảnh trồng vào mùa xuân Thu hoạch trồng sau 2-3 năm, thời gian lâu suất cao Trồng hạt có suất cao trồng từ mầm củ Năng suất trung bình củ khơ/1 (Đỗ Tất lợi, 1991.) 2.2.Các hợp chất alkaloid có Bình vơi Trong củ Bình vơi có chứa nhiều alkaloid, alkaloid thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất nhân isoquinolin Trong quan trọng rotundin (0,2-3,55%).Hàm lượng alkaloid toàn thân rotundin thay đổi tùy theo loài tùy vùng thu hái Theo Bùi Thị Bằng (2006), hàm lượng rotundin đạt tới 3,55% loài S.brachyandra Diels (thu Hoàng Liên Sơn), 1,31% loài S.sinica Diels (thu Hà Nam Ninh), 1,30% loài S.Kwangsiensis H.S.Lo ( thu Quảng Ninh), 0,72% lồi S.hainanensis H.S.Lo et Y.TSoong (thu Thanh Hóa), 0,62% loài S.cambodia Gagnep ( thu Lâm Đồng ), 0,29% lồi S.cepharantha (thu Hà Sơn Bình), 0,21% loài S.peirrei Diels ( thu Tây Ngun) Ngồi routundin, Bùi Đình Sang phân lập lần từ lồi S.rotunda Lour (1940), năm 1964 Ngơ Văn Thu chiết roemerin Từ rễ củ loài S.pierrei Diels thu hái vùng ven biển tỉnh Bình Định, Ngô Thị Tâm phân lập cepharantin (1%) Theo Phạm Thanh Kỳ et al.(1997), từ rễ củ loài S.brachyandra có: isocorydin (1,5%), tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin (0,3%) ,sinomenin (0,1%), corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%), isoboldin (0,004%), dihydrosalutaridin (0,001%) N-metyllaurotetanin (0,006%).Trong rễ củ lồi S.Kwangsiensis có: tetrahydropalmatin, capaurin, isocorydin, roemerin, dihydroromerin, dehydrostephanin, stephanin, dihydropalmatin palmatin Trong rễ củ lồi S.sinica có alkaloid Rotundin (1,2-15%) Chun ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Từ rễ củ loài S.cepharantha phân lập alkaloid cepharanthin alkaloid phụ khác: isotetrandin,berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin, crebanin,o-nornuciferin, stesakin, palmatin, cepharamin Trong rễ củ lồi S.dielsiana có: crebanin (0,3%), sinoacutin (0,2%), stephanin (0,2%), tetrahydropalmatin (0,1%) dehydrostephanin 2.2.1 Rotundin Đặc điểm cấu trúc hóa học Cơng thức phân tử: C21H25NO4 Công thức cấu tạo: Khối lượng phân tử: 355,43 Tên khoa học: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- 6H dibenzo [a,g] quinolizine Các thơng số hóa lý Bột kết tinh trắng vàng, không mùi không vị Độ tan: không tan nước, tan Cloroform, dễ tan trơng acid lỗng Điểm chảy (mp): 141-1440C Phổ tử ngoại: có đỉnh hấp thụ 281 nm Tác dụng sinh học: an thần, gây buồn ngủ Một số kết quà nghiên cứu hoạt tính sinh học Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi P.Bonnet phát hỗn hợp alkaloid củ bình vơi, đặt tên rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn trơn, giảm đau Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ co thắt trơn, đưa Việt Nam trở thành nước giới chiết rotundin (1944: Nhật; 1957: CHDC Đức; 1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc ) Theo Ngô Đại Quang (1999) tác đụng dược lý rotundin nghiên cứu nước ta từ thời Pháp thuộc Rotundin áp dụng từ năm 1944 suốt kháng chiến chống Pháp dùng để điều trị có kết số trường hợp đau tim, ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt gây ngủ an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có ưu điểm bật độc tính thấp, dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau ngủ không bị mệt mỏi không gây nhức đầu loại thuốc tổng hợp từ hoá chất Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức cán khoa học khác Viện Dinh dưỡng Học viện Quân y thử nghiệm rotundin liều cao chuột (150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết khơng xác định LD50 đường uống Điều chứng tỏ độ an toàn cao chế phẩm. Rotundin độc Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, vật bị mệt thời lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, dạng viên 30mg 60mg, rotundin cịn có dạng tiêm rotundin sunfat, ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ điều trị loét dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, ngủ lo âu, căng thẳng thần kinh v.v Hình Tinh thể rotundin 2.2.2.Các hợp chất alkaloid khác Roemerin Công thức cấu tạo: Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 10 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Tác dụng: Theo Fakhrutdinov Sf (1962), roemerin gây tê niêm mạc phong bế Đối với tim ếch lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ tần số co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập thời kỳ tâm trương Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột acetylcholine Đối với hệ thần kinh trung ương với liều thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong Roemerin cịn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp Liều LD50 chuột 0,125g/kg tương đương với liều độc cocain hydroclorid Cepharanthin Công thức cấu tạo: Tác dụng: Theo kết nghiên cứu Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada Masao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng dãn mạch nhẹ mạch vi tuần hồn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt bệnh giảm bạch cầu bệnh nhân bị bom nguyên tử, chiếu tia phóng xạ, dùng Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 11 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ thuốc chữa ung thư, biến động số lượng hồng cầu sắc tố máu khơng có thay đổi dùng cepharanthin Tác dụng phụ uống cepharanthin liều cao không thấy xuất CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT ALKALOID VÀ ỨNG DỤNG 3.1.Các phương pháp chiết tách hợp chất alkaloid Theo môn Công nghiệp Dược (2001), Dựa vào tính chất chung alkaloid người ta đưa phương pháp chung để chiết tách alkaloid khỏi nguyên liệu thực vật Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 12 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Bao gồm phương pháp chiết alkaloid dạng base dung môi hữu không phân cực phương pháp chiết alkaloid dạng muối dung môi nước, nước acid cồn (ethanol, methanol ) 3.1.1 Phương pháp chiết alkaloid dạng base dung môi hữu không phân cực Ưu điểm: Hiệu suất chiết hoạt chất từ dược liệu cao dịch chiết rút sạch, dễ tinh chế loại tạp kèm theo Các dung môi hữu không phân cực thường dung mơi có khả chiết chọn lọc alkaloid dạng base Nhược điểm: Dung môi hữu thường dung môi đắt tiền Khi sử dụng dung môi để chiết đòi hỏi thiết bị phức tạp Phương pháp bao gồm giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu Để tăng khả chiết ta phải chia nhỏ dược liệu trước chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giứ hai pha rắn lỏng đẩy nhanh trình khuếch tán Tuy nhiên ta chia nhỏ dược liệu q dung mơi khó chuyển động qua khối dược liệu ta khó thu dịch chiết, tùy thuộc vào loại dược liệu ta xay nhỏ khác vừa để đảm bảo đẩy nhanh trình khuếch tán vừa dể dàng rút dịch chiết Kiềm hóa làm trương nở nguyên liệu dung dịch kiềm ( thường dùng Ca(OH)2, NH4OH, Na2CO3…) để chuyển alkaloid nguyên liệu sang dạng base Giai đoạn 2:Chiết Sử dụng dung môi chiết dung môi hữu khơng phân cực (các dung mơi khơng hịa lẫn với nước ) Giai đoạn 3: Tinh chế Tinh chế thu alkaloid cách chuyển dạng muối với acid chuyển dạng base kiềm phân chia chúng hai pha dung môi hữu không phân cực nước để loại tạp chất alkaloid Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 13 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Hình Sơ đồ chiết alkaloid dạng base dung môi hữu không phân cực Ứng dụng: Hiện hầu hết alkaloid sản xuất nước giới sữ dụng phương pháp Mặt khác phương pháp sử dụng chiết dược liệu có nhiều chất nhầy có độ trương nở cao, tránh trương nở mức dược liệu hịa tan chất nhầy vào dung mơi gây khó khăn cho rút dịch chiết tinh chế 3.1.2.Phương pháp chiết alkaloid dạng muối dung môi nước, nước acid cồn (ethanol, methanol ) Ưu điểm: Dung môi rẻ tiền, dể kiếm Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư Nhược điểm: Dịch chiết rút lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế mát nhiều khâu tinh chế làm cho hiệu suất chiết thấp Đối với vật liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi chiết gặp khó khăn khâu rút chiết Phương pháp tiến hành bao gồm giai đoạn sau: Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 14 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Chuẩn bị nguyên liệu: Nguyên liệu thực vật xay thơ, sau làm ẩm cho trương nở nước Tiến hành chiết : Sử dụng dung môi nước chiết alkaloid dạng muối tự nhiên muối với acid vô cơ, dung môi cồn ethylic methylic để chiết alkaloid dạng muối base Tinh chế: Trong trường hợp chiết nước, alkaloid base giải phóng từ dịch chiết cách thêm kiềm sau chiết dung mơi hữu khơng hịa tan nước Tiếp tục tinh chế cách bốc dung môi kết tinh lại dung môi hữu chuyển sang dạng kết tinh lại Trong trường hợp chiết cồn, dịch chiết cồn cô đặc , thêm acid loại tạp chất cách chiết dung môi hữu không phân cực, thêm kiềm chuyển alkaloid sang dạng base chiết alkaloid dung môi hữu Bốc dung môi hữu kết tinh alkaloid chuyển sang dạng muối kết tinh lại Đối với alkaloid khó tách sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ phương pháp trao đổi ion 3.2 Ứng dụng chiết tách rotundin từ củ Bình vơi Theo Ngơ Đại Quang (1999) quy trình chiết tách tiến hành sau: Chiết tách sản phẩm thơ: Trước hết củ bình vơi rửa cạo vỏ ngồi xát nhỏ thành miếng với kích thước thích hợp ngâm bể chứa dung dịch chiết xuất gồm nước chất đệm vơ pH thích hợp Các hoạt chất alcaloit hoà tan chiết khỏi bã Quá trình chiết thực 2-3 lần bã ép kiệt Dịch chiết để lắng, lọc trung hồ ph thích hợp để thu kết tủa Kết tủa lọc, phơi sấy Sản phẩm thô sau sấy có hàm lượng rotundin vào khoảng 27- 32% Q trình tinh chế: Chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 15 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Sản phẩm thô tinh chế thành dạng dược dụng có hàm lượng rotundin > 98,2% (theo Dược điển Trung Quốc) Quá trình tinh chế tiến hành theo giai đoạn sau: Giai đoạn I: Sản phẩm thơ nghiền nhỏ, hồ tan dung dịch đệm kết tinh môi trường pH = Trong giai đoạn phần lớn sản phẩm phụ tạp chất muối vô cơ, xenluloza, tinh bột loại bỏ Tuy nhiên bán sản phẩm (dạng bột) có màu sẫm, nhiệt độ nóng chảy chưa ổn định hàm lượng rotundin đạt khoảng 80% Giai đoạn 2: Trong giai đoạn bán sản phẩm hoà tan hỗn hợp dung mơi Những dung mơi hồ tan chủ yếu alcaloit mà khơng hồ tan muối vơ hợp chất hữu mạch dài xenluloza, tinh bột, đường khử Để sản phẩm không bị phân huỷ biến màu nên giai đoạn gia nhiệt nhẹ Dung dịch lọc nóng kết tinh chậm nhiệt độ thấp thời gian 10-12 Tinh thể lọc rửa nhiều lần hỗn hợp dung mơi nói (đã làm lạnh) đến nhận bán thành phẩm có hàm lượng rotundin tới 90% Giai đoạn 3: Tinh chế tẩy màu Bán thành phẩm có hàm lượng rotundin 90% hoà tan từ từ hỗn hợp dung mơi điều chỉnh nồng độ thích hợp Nếu nồng độ cao trình kết tinh diễn nhanh làm thành phẩm không sạch; nồng độ thấp lượng hao hụt lớn, hiệu suất kết tinh thấp Sau chất tẩy chất ức chế oxy hoá cho thêm, đồng thời khuấy vịng 30-45 phút Sau để yên đế kết tinh Sản phẩm tạo dạng muối sunfat nitrat hay clorua tuỳ theo mục đích điều chế Tiếp q trình lọc hút chân không kết tinh lại nhiệt độ thấp Thành phẩm thu tinh thể hình kim, màu trắng ngà Quá trình tinh chế lại nâng hàm lượng rotundin từ 90% lên 98,2%, hiệu suất tinh chế đạt 88,2% Đây giai đoạn quan trọng, cần xác định tỷ lệ dung mơi hồ tan thật thích hợp thu thành phẩm có chất lượng tết hiệu suất tinh chế cao Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 16 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ KẾT LUẬN Alkaloid hợp chất tổng hợp từ tự nhiên, phần lớn có dược tính cao nên chúng thường dùng để bào chế thuốc Trong đó, Bình vơi với hợp chất rotundin, roemerin nghiên cứu sử dụng Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 17 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Hoạt chất rotundin dùng chữa suy nhược rối loạn tâm thần, lt tá tràng, roemerin có tác dụng gây ngủ nên Bình vơi dùng làm thuốc an thần, chữa nhức đầu, sốt nóng, đau dày (thuộc nhiệt), ho nhiều đờm, hen suyễn, khó thở Phối hợp với vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngứa lở da, mụn nhọt Trong y học cổ truyền, nhân dân ta dùng Bình vơi thái lát, phơi khô ngâm rượu Trong y học đại dùng toàn cây, cao alkaloid bào chế thành dạng thích hợp Hiện nay, Viện Dược Liệu Việt Nam đưa Bình vơi vào danh sách nhóm nguy cấp (CR) có khả tuyệt chủng Do vấn đề đặt bảo tồn giống dựa kỹ thuật vi nhân giống tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid sở áp dụng kỹ thuật hóa sinh tiên tiến TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tạp chí Ngơ Đại Quang 1999.Tạp Chí cơng nghiệp hóa chất, NXB Vinachem Chun ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 18 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ Sách Bộ môn Bào chế 2003 Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc, tập I Trường ĐH Dược Hà Nội Bộ môn Công nghiệp Dược 2001 Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập I, trường ĐH Dược Hà Nội Bùi Thị Bằng 2006.Các phương pháp hóa lí ứng dụng phân tích kiểm nghiệm dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đàm Trung Bảo, Lê Quang Toàn.1971 Kỹ thuật bào chế dạng thuốc chế phẩm, phần 2, tập IV, trường ĐH Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi 1991 Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB BNN Đỗ Văn Đài, Nguyễn Bin, Phạm Xuân Toản, Đỗ Ngọc Cử 1999 Cơ sở trình thiết bị cơng nghệ hóa học, tập I, trường ĐH Bách khoa Lê Quang Tồn 1971 Kỹ thuật Hóa dược , tập 1, Nhà xuất Y học Nguyễn Bin 2005 Các q trình, thiết bị cơng nghệ hóa chất thực phẩm,tập IV, NXB KHKT Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu 1985 Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh 1997 Bài giảng dược liệu, tập II, trường Đại học Dược Hà Nội Phan Đình Châu 1997.Cơ sở kỹ thuật tổng hợp Hóa dược, tài liệu giảng dạy sau Đại học, trường Đại học Dược Hà Nội Nước ngồi Tạp chí R.H.F Manske 1973 The alkaloid- chemistry and Physiology, volume XIV, Academic Press- New York- London Sách Carey, A.Francis 1987 Organic Chemistry, New York Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 19 Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ P.H List and P.C Schmidt, Phytopharmaceutical technology, CRC Press InC,1989 Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada Masao Tomita 1984 A major alkaloid of the leaves and stems of Stephania Rotunda, Kyoto pharmaceutical University, Misasagy, yamasbina- ku, Kyoto 607, Japan Fakhrutdinov Sf.1962.On the pharmacology of the alkaloid Roemerin and its derivatives, Med Zh Uzb Thuy TT, Porzel A, Franke K, Wessjohann L, Sung TV 2005 Isoquinolone an protoberberine alkaloids from Stephania rotunda, Institute of Chemistry, Vietnamese Academy of Science and Technology, Hanoi, Viet Nam Trang web http://www.plantsystematics.org/ (ngày 30/02/2011) http://ybacsi.com/tra-cuu/dong-y/index.php?get=2&id=37/ (ngày 30/02/2011) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học 20 ... trung bình củ khơ/1 (Đỗ Tất lợi, 1991.) 2.2.Các hợp chất alkaloid có Bình vơi Trong củ Bình vơi có chứa nhiều alkaloid, alkaloid thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất nhân isoquinolin Trong quan trọng rotundin. .. Học Phương pháp Nghiên Cứu Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 2: CÂY BÌNH VƠI VÀ CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY 2.1.Chi Bình vơi (Stephania spp) 2.1.1.Phân loại khoa học Giới (regnum): Plantae... nhọt Trong y học cổ truyền, nhân dân ta dùng Bình vơi thái lát, phơi khơ ngâm rượu Trong y học đại dùng toàn cây, cao alkaloid bào chế thành dạng thích hợp Hiện nay, Viện Dược Liệu Việt Nam đưa Bình