Điện di trên polyacrylamide gel

Điện di trên polyacrylamide gel

Chủ đề : Điện di trên polyacrylamide gel

GVHD: TH.S Nguyễn Thị Vân Anh

SVTH: Nguyễn Thị Thuần

Điện di là gì ?

Điện di Polyacrylamide gel

Ứng dụng 4

Điện di trên gel (electrophoresis

hay gel electrophoresis ) áp dụng trong sinh học

phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử

DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm

vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay

điểm đẳng điện tích (isoelectric point)

Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường

là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền

để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.

II.1 Polyacrylamide gel là gì ?

Quá trình polymer hóa c xúc tác

tetramethylethylenediamine (TEMED).

Quá trình polymer hóa c xúc tác

b i ammoniumpersulfate (APS),N,N,N’,N’-

Gel poly acry lamide là gel c t o thành

do s poly mer hóa c ác n phân t acry lamide và N,N’- methy lene- bis- acry lamide.

Gel poly acry lamide là gel c t o thành

do s poly mer hóa c ác n phân t acry lamide và N,N’- methy lene- bis- acry lamide.

 Tách các đoạn DNA có kích thước 0,5 – 20

Kb

 Điện di theo phương nằm ngang

 Phân giải thay đổi khi nồng độ Agarose

hay loại Agarose thay đổi

 Bước chuẩn bị đơn giản

 Phân tách đoạn DNA có kích thước < 1000 cặp base

 Điện di theo phương thẳng đứng

 Độ phân giải cao và ít thay đổi có thể phân biệt được những đoạn chỉ cách nhau 1 nucleotide

 Bước chuẩn bị phức tạp hơn phương pháp sử dụng Agarose

Gel Agaros e

Gel Polyacrylamide

NGUYÊN TẮC: Dựa vào đặc tính tích điện, tốc độ

di chuyển khác nhau của các phân tử ion hay các

tiểu phần protein trong trường điện

Tách riêng biệt theo khả năng di động trong trường

điện từ về 2 cực âm và dương

sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước nhỏ

Nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phépphân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại nếu nồng độ gel cao

sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước nhỏ

Các phân tử tích điện âm

sẽ di chuyển về cực dương

Các phân tử tích điện âm

sẽ di chuyển về cực dương

2 Điện di Polyacrylamide gel

1 Nguyên tắc điện di trên polyacrylamide

Dùng dể phân tách các đoạn phân tử DNA, RNA

và DNA/RNAGel phải được đặt giữa 2 tấm kính ngăn cách bởi miếng đệm

( gel spacers) để ngăn cho polyacrylamide không tiếp xúc với không khí

Gel có thể dài từ 10 – 100

cm tùy thuộc vào yêu cầu phân tích và chúng thường chạy trong phương thẳng đứng

Có thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5% - 20% tùy thuộc vào kích thước phân tử protein hoặc DNA quan tâm

Chiều dài chuỗi

Nồng độ acrylamide

Nồng độ acrylamide

Mức độ liên kết chéo

Mức độ liên kết chéo

Độ xốp của gel

Độ xốp của gel

Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel

1 Nguyên tắc điện di trên polyacrylamide

Cơ chế

3

 Phân tích và thu hồi các đoạn

DNA có chiều dài từ 5-2.000 bp

Nồng độ polyacrylamide gel

được sử dụng trong khoảng từ

3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của

đoạn DNA quan tâm

Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là:

- Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đôi

- Polyacrylamide gel biến tính bằng urea và

formamide dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đơn

loại gel hay được sử dụng nhất

Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide,

kích thước và điện tích của DNA

Khi nồng độ acrylamide cao thì hiệu quả phân tích nucleotide càng thấp

Rót dung dịch gel vào giữa 2 tấm kính Rồi gắn lược vào

Acrylamide polyme hóa trong vòng 60 phút, t phòng

Rút lược, tháo băng, gắn khuôn gel vào buồn điện di bằng đệm 1*TBE

Trộn mẫu DNA với lượng thích

hợp của đệm, đặt mẫu vào giếng

Nối buồng điện di với bộ

nguồn

2 Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel

Nhuộm bằng ethidium bromide

Ngâm nhẹ gel trong dung

dich nhuộm (0,5 ug/mL

EtBr trong 1 TBE)

Lấy gel và tấm kính đỡ

raThấm khô bề mặt gel bằng giấy thấm Kimwipe

Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap)

Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại

Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr, do đó không thể

phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp

hơn 10 g

tránh tạo ra bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap

Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc

 Cho phép phát hiện một

lượng protein ở dạng vết

trong polyacrylamide gel và

một lượng nhỏ nucleic acid

2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử

có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm

Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng

Cố định nucleic acid trong acetic acid

Ứng dụng 4

Nghiên c u bi u hi n β-galactosidase trong

E.co li B L2 1

β-galactosidase là enzym xúc tác ph n ng th y phân

liên k t β1,4 D galactosidase trong ng lactos e

N p v ào t bào E.co li B L21

Bi u hi n c pro tein này nhi t và pH thích h p sau khi c m ng v i IPGT

Bi u hi n c pro tein này nhi t và pH thích h p sau khi c m ng v i IPGT

S n xu t c enzym này v à g iúp cho các s n ph m s a d tiêu hó a ( nh t là

ng i trong h tiêu hó a c a h thi u

i n di SD S trên polyacrylami de gel

i n di bi n tính trên polyacrylami de gel 12,5 % theo Laemmli(197 0)

i n di bi n tính trên polyacrylami de gel 12,5 % theo Laemmli(197 0)

(v /v )acid axetic cho n khi có màu trong

còn b ng protein có màu xanh

R a v i dung d ch 30%( v/v) metano l +10%

(v /v )acid axetic cho n khi có màu trong

còn b ng protein có màu xanh

C m n cô và các b n ã l ng nghe