Đang tải... (xem toàn văn)
Điện di trên polyacrylamide gel
Chủ đề : Điện di trên polyacrylamide gel NỘI DUNG 1 2 Cơ chế 3 Điện di là gì ? Điện di Polyacrylamide gel Ứng dụng 4 electrophoresis gelelectrophoresis ) !"#$%& !'()*+,-./!0&& &!' DNA1 RNAprotein2& &.3&./) 4-5&6&78+0&89&1:; điểm đẳng điện tích $#&&!#< =,-($'")*&.)>??<./ @4(;#.8A.B1)*>C8A (#$!#&)<.D4E(/B ./! && &!'14(& &&F*)+ & )>#)1>;&1GH##)$$<./! 40& &!'$+. 1 Điện di là gì ? IIJK#&)(:L Quá trình polymer hóa c xúc tác b i ammoniumpersulfate (APS),N,N,N’,N’- tetramethylethylenediamine (TEMED). Quá trình polymer hóa c xúc tác b i ammoniumpersulfate (APS),N,N,N’,N’- tetramethylethylenediamine (TEMED). - Acrylamide là m t n phân t có c u trúc: CH2=CH–CO–NH2 - Bis-acrylamide có c u trúc: CH2=CH–CO–NH–CH2–NH–CO– CH=CH2. - Acrylamide là m t n phân t có c u trúc: CH2=CH–CO–NH2 - Bis-acrylamide có c u trúc: CH2=CH–CO–NH–CH2–NH–CO– CH=CH2. Gel polyacrylamide là gel c t o thành do s polymer hóa các n phân t acrylamide và N,N’-methylene-bis- acrylamide. Gel polyacrylamide là gel c t o thành do s polymer hóa các n phân t acrylamide và N,N’-methylene-bis- acrylamide. && &.#;&D+0&89&M1NOPM => #!8QR) K C .S + T .* #$ #;#$.S U89&&V>đơn giản K &.#;&D+0&89&WJMMM&3! >$ #!8QX.Y *!C(0.S&D/!> .8Z&[.#;&\& &J&# U89& &V > phức tạp hơn !8Q ! ! $' "#$ Gel Agarose Gel Agarose Gel Polyacrylamide Gel Polyacrylamide NGUYÊN TẮCDựa vào đặc tính tích điện, tốc độ di chuyển khác nhau của các phân tử ion hay các tiểu phần protein trong trường điện Tách riêng biệt theo khả năng di động trong trường điện từ về 2 cực âm và dương Sự dịch chuyển Của các phân tử trên gel i n tích c a phân t c n phân tách Kích th c c a l gel i n tr ng ]T.*F!$^;#_91&#!`! ! && &!'$%&&D+0&89&94(8Z&;]T.*&# $^;#_a1&#!`!! && &!'$%&&D+0&89&a ]T.*F!$^;#_91&#!`! ! && &!'$%&&D+0&89&94(8Z&;]T.*&# $^;#_a1&#!`!! && &!'$%&&D+0&89&a H &!'0&.) $^&/4B&2&8Q H &!'0&.) $^&/4B&2&8Q 2 Điện di Polyacrylamide gel Jb&.!#&) c/! && & .#;!'1d 4(ed !C.8Z&.3[P F)+0f& &>g )].) $!&$<./f&# !#&)+h]! G7&49+h+0 &D/(iJMOJMM &)c*&4(#& !0&4(&78A &;#!8QX .Y HD/.7&>Cg& & T.*+ &&6 !#&)ij1Nkl PMkc*&4(#+0& 89&!'!##3& m) Chiều dài chuỗi Chiều dài chuỗi Nồng độ acrylamide Nồng độ acrylamide Mức độ liên kết chéo Mức độ liên kết chéo Độ xốp của gel Độ xốp của gel n+]&`#&6& &)##)4(& & &+]&D/.8Z&.B&\./+/)$# )Y&.*Go!&6+h Jb&.!#&) Cơ chế 3 !!!"# $%#&'()'&(*+$+& ,-./0$)$12$34 !56'%17,89( :(* ;(&#&'()'&(*+$+& ,<$,-./0$&= &'()'&(*+$+&1>$"?6$@# A. > &'()'&(*+$+&"?"B$)+( C)*(*+6$@#A. D &$+&(',-./ 0$E ;F:29(.G#)$&$+&'#0%$%9(()'&(*+4 17,8F9( H$%()'&(*+(IF:2#&+A+$E# [...]...Phương pháp điện di polyacrylamide gel không biến tính Chuẩn bị polyacrylamide Chuẩn bị dung dịch không biến tính Lau sạch 2 tấm kính dùng làm khuôn gel avà miếng đệm Nối buồng điện di với bộ Rót dung dịch gel vào giữa 2 tấm nguồn kính Rồi gắn lược vào Rút lược, tháo băng, gắn Trộn mẫu DNA với lượng thích khuôn gel vào buồn điện di hợp của đệm, đặt mẫu vào giếng bằng đệm... gel sau khi nhuộm bạc Phát triển màu của gel Phóng xạ tự ghi Tiến hành rửa gel trong nước khử Cố định nucleic acid trong acetic acid ion 7,5% Ủ phim phóng xạ khoảng 24h Dùng giấy thấm Kimwipe để thấm khô bê ̀mặt Quan gel sát kết quả Đánh dấu phóng xạ và sấy gel ở 80trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel Chạy điện di Ly tâm 12.000 vòng/phút polyacrylamide gel. .. polyme hóa trong vòng 60 phút, t phòng 2 Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel Nhuộm bằng ethidium bromide tránh tạo ra bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap Ngâm nhẹ gel trong dung Lấy gel và tấm kính đỡ dich nhuộm (0,5 ug/mL raThấm khô bề mặt gel bằng EtBr trong 1 TBE) giấy thấm Kimwipe Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap) Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr, do đó không... vector t o dòng vào vector bi u hi n pET22b (+) c nhu m b ng i n di bi n tính trên Coomassie Brillliant Blue polyacrylamide gel 12,5 % Bi n n p vector bi u hi n vào trong 3 gi theo Laemmli(1970) E.coli BL21 R a v i dung d ch 30%(v/v) metanol +10% (v/v)acid axetic cho n khi có màu trong còn b ng protein có màu xanh i n di SDS trên polyacrylamide gel Nuôi c y E.coli BL21 và bi u hi n C m n cô và các b n ã... silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng Các bước nhộm bằng bạc Cố định nucleic acid trong acetic acid Rửa gel trong nước khử ion tối Nhuộm gel trong dung dịch... sát và chụp ảnh phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp trên máy soi tử ngoại hơn 10 g Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc Cho phép phát hiện một 1) Dùng các dung dịch diamine silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung dịch acid của lượng protein ở dạng vết formaldehyde trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid (pg) nhạy gấp 1.000-10.000 Hai phương pháp nhuộm... Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel Chạy điện di Ly tâm 12.000 vòng/phút polyacrylamide gel ở 4ºC, lấy thể nổi Xác định vị trí DNA Kết tủa DNA bằng ethanol ở 4ºC trong 30ph Cắt băng DNA ra khỏi gel, chuyển vào eppendorf tube Ly tâm 12.000 vòng trong 10ph ở 4ºC để thu hồi DNA Bổ sung đệm chiết ủ ở 37ºC kèm lắc nhẹ Hòa tan trở lại DNA trong 200 L đệm TE (pH 7,6) Ứng dụng 4 β-galactosidase là enzym . n di SDS trên polyacrylamide gel i n di SDS trên polyacrylamide gel i n di bi n tính trên polyacrylamide gel 12,5 % theo Laemmli(1970) i n di bi n tính trên polyacrylamide gel. Chủ đề : Điện di trên polyacrylamide gel NỘI DUNG 1 2 Cơ chế 3 Điện di là gì ? Điện di Polyacrylamide gel Ứng dụng 4 electrophoresis gel electrophoresis. $' "#$ Gel Agarose Gel Agarose Gel Polyacrylamide Gel Polyacrylamide NGUYÊN TẮCDựa vào đặc tính tích điện, tốc độ di chuyển khác nhau của các phân tử ion hay các tiểu phần protein trong trường điện Tách