Điện Di Trên Agarose gel

Điện Di Trên Agarose gel

Chủ đề: agaROSE

GVHD: Th.s Nguyễn Thị Vân Anh

SVTH: Nguyễn Thị Bảo Uyên

Ứng dụng của Điện di

Điện di thuốc trị liệu

Điện di protein Một số ứng dụng khác

kỹ thuật rất hữu ích sử dụng nhằm phân tích xác

định và tinh sạch các đoạn DNA

Chữa bệnh vào cơ thể hoặc

lấy các ion thuốc có hại ra

khỏi cơ thể

Tác dụng của dòng điện một

chiều:

• Làm giãn mạch

• Tác động lên hệ thần kinh

Tác dụng của ion thuốc:

• Không gây tổn thương da

• Không gây đau, không lây truyền

các bệnh đường máu

Giúp phát hiện nhanh những

tính chất nổi bật của lúa như

mùi thơm, protein, amilose

Giúp thực hiện công tác chọn lọc tao giống lúa thuần

rẻ tiền và hiệu quả cao

Chọn ra được giống nếp bè năng suất cao hơn 15% và protein trên 10%

Ở mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh học, trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein Vì vậy việc tìm hiểu, phân tích các phân tử DNA, RNA là rất cần thiết Khi hiểu rõ cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất các hợp chất thứ cấp dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh…

hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường

kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tíchvà cấu hình của chúng

ĐIỆN DI LÀ GÌ?

Nguyên tắc

thực hiện

Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thướt lỗ của thể nền (gel)

Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốckhác nhau nhờ vào sự khác nhau của:

•Lực điện trường tác động lên chúng(nếu các phân tử tích điện khác nhau)

•Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel

•Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

Phương pháp điện di

Điện di trên gel agarose:

khả năng phân tách gel

50bp – 20kb

Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb

Ngoài ra còn điệndi trong trườ

ng xung (PFGE Pulse Field GelElectrophonesi c)

ĐiệN di trên gel agarose

Agarose

-Agarose(polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da -Polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose

-Cấu trúc agarose không đồng nhất: vừa tích điện vừa trung hòa trong phân tử có chứa nhóm sunfat, metoxyl,

cacboxyl hàm lượng sunfat trong agarose được coi là chỉ số độ sạch của agarose chỉ số này càng thấp thì chất lượng càng cao thường trong agarose có chứa 0.04% sunfat

-Agarose là một polyme trung tính tạo nên tính đông tụ của agar

Agarose được tách ra ở dạng thạch từ một số loài biển đỏ tảo, hoặc rong biển, được tìm thấy tại California và miền đông châu Á

Agarose gel

Agarose gel là một chất trong suốt hoặc

trong mờ giống như agar, được tạo thành

khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm

điện di) được đun nóng tới >100và sau

đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở

khoảng 40-45

Agarose gel là một loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 20 kb

Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế

và cường độ thích hợp

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose

gel

Các phân tử DNA có

kích thước càng lớn

(khối lượng phân tử lớn)

thì tốc độ dịch chuyển

càng chậm

Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNAnhỏ và ngược lại

Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng

có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau

Kích thước phân tử Cấu hình DNA Nồng độ agarose

Thành phần thực hiện điện di

Quy trình điện di

Chuẩn bị agarose Đặt mẫu DNA vào giếng

Nhuộm DNA bằng EtBr Quan sát và chụp hình

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp

Dễ dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp

Dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP) hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE

type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphat

e

8

                 

        

 

 polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE

Các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chấtcho các enzyme naỳ

Khi tăng điện thế của quá trình điện di các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ từ cực âm đến cực dương

Tùy thuộc vào từng mục đích điện

di khác nhau có thể sử dụng nồng

độ DNA cao hoặc thấp Thường dùng micropipette 20-200và đặt buồng điện di trên bàn có màu đen

Quan sát sự dịch chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện

di

Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr EtBr được dùng đê ̉phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn

Tuy nhiên ái lực của thuốc nhuộm đối với nucle acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu suất huỳnh qang không cao Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở

trong gel

Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel

Một số phương pháp thu hồi DNA agarose gel

Agarose gel có nhiệt độ nóng

chảy thấp

Chiết bằng phenol/chloroform

và kết tủa

Dung dịch gel có DNA

Bổ sung muối đến nồng độ 0,5M Đoạn DNA quan

tâm

Cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1

Cắt

1 Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp

70

Agarose gel chứa bằng DNA

Dung ly DNA ra khỏi màng

Rửa cột vài lần

DNA liên kết với

màng

Ly tâm ở 10.000-15.000 rpm trong10-15 phút

Cho vào tube ly tâm

Đoạn DNA quan

tâm

Cho vào đệm chiết làm nóng

hòa tan

Thủy tinh đặt trong một cột

lọc

2 Ly tâm

Cắt một rãnh nhỏ phía trước băng DNA quan

tâm

Tách chiết DNA bằng phenol và kết tủa

Rửa mẫu giấy và dung

ly DNA trong đệm

Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào

mẫu giấy

Đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45

Cắt một rãnh nhỏ trước băng DNA quan tâm

Làm đầy bằng glycerol

Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel

vào trong dung dịch glycerol

Chiết dung dị ch glycerol-DNA bằng pipette

3 Điện di vào bẫy

Cách 1

Cách 2

Hòa tan gel trong dung dịch

muối NaI (4 M)

DNA liên kết với hạt thủy tinh Tách chiết DNA bằng phenol

và kết tủa

Dung ly DNA ra khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp

Bổ sung hạt thủy tinh vào dung

dịch

Rửa và kết tủa tiểu thể

4 Dùng hạt thủy tinh

Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng )

Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân

tử hoặc in dấu ditruyền )

Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNAtrước khi thẩm tích Northern

Ứng

dụng

của điện

di

agarose

gel

Có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định

Gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide Mẫu cũng dễ thu hồi

Ưu điểm

và nhược

điểm

Kết luận

Phương pháp điện di giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA Nhờ phương pháp này mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả.

Có nhiều loại khuôn đỡ được áp dụng cho kỹ thuật này Nhưng mỗi loại phân tử khác nhau sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau Điện di agarose gel là phương pháp tối ưu nhất đối với DNA

Cảm ơn cô và các bạn

đã lắng nghe !