Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất gỗ cao su đến sản lượng và chất lượng nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

Bài viết Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất gỗ cao su đến sản lượng và chất lượng nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự sinh trưởng của ba nấm Linh chi và tuyển chọn nguồn cơ chất thích hợp để trồng nấm Linh chi trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ doi: 10.15625/vap.2022.0139 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CƠ CHẤT GỖ CAO SU ĐẾN SẢN LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) Đỗ Thị Xuân1, Trần Văn Bé Năm1, Nguyễn Bá Thái2, Đỗ Tấn Khang1, Trần Nhân Dũng1* Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Học viên cao học, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ *Email: tndung@ctu.edu.vn TÓM TẮT Nghiên cứu thực với mục tiêu đánh giá sinh trưởng ba nấm Linh chi tuyển chọn nguồn chất thích hợp để trồng nấm Linh chi điều kiện phịng thí nghiệm Ba dịng nấm nghiên cứu phát triển hệ sợi môi trường PDA, môi trường hạt môi trường chất (mùn cưa, gỗ nhỏ, gỗ to từ cao su) Thành phần suất đánh giá thông qua đường kính trọng lượng quả thể Đặc tính chất lượng đánh giá hàm lượng polysaccharide chỉ số IC50 Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng nấm Nhật phát triển chậm nhất, kế đó dòng Thất Sơn, dịng Hàn Q́c phát triển nhanh nhất, mơi trường PDA, meo hạt chất trồng quả thể Đối với chất gỗ to, dịng Thất Sơn có hàm lượng polysaccharide cao (0,68 g/L) Dịng Hàn q́c có giá trị kháng oxide IC50 quả thể tốt gỗ nhỏ (161,85 µg/mL) Dựa kết quả so sánh trình tự, dịng Hàn Q́c dịng Nhật có độ tương đồng tương tự nấm Ganoderma lucidum, dòng nấm Linh chi Thất Sơn có độ tương đồng với nấm Ganoderma australe Từ đó cho thấy, dòng nấm Linh chi Hàn, Linh chi Thất Sơn trồng chất gỗ to có tiềm để sản xuất sản phẩm thương mại có hàm lượng polysaccharide, hoạt tính oxy hố cao Từ khóa: Ganoderma lucidum, gỗ nhỏ, gỗ to, IC50, mùn cưa, polysaccharide ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Linh chi loại nấm dược liệu phá gỗ, đặc biệt thuộc Đậu (Fabales) Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần nấm Linh chi (tơ nấm, quả thể, bào tử) có chứa nhóm chất có hoạt tính sinh học như: triterpenoid, polysaccharide, nucleotide, strerol, alkaloid, steroid [1, 2, 3, 4] Các nhóm chất có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus (bao gồm virus HIV), chớng lão hóa, chớng oxy hóa, chống phát triển khối u,… [1, 4, 5] Trong khai thác lâm nghiệp đặc biệt thu nhựa cao su, gỗ cao su thải bỏ sau khai thác nhựa mùn cưa cao su, gỗ cao su Gỗ cao su có loại: gỗ nhỏ gỗ to Các nguồn phụ phẩm có tiềm làm chất để trồng nấm Linh chi Tuy nhiên chưa có nghiên cứu so sánh ảnh hưởng loại giá thể từ phụ phẩm cao su lên suất, sản lượng, chất lượng nấm Linh chi Do đó nghiên cứu thực với mục tiêu chọn nguồn chất thích hợp để trồng nấm Linh chi cho sản lượng cao, chất lượng tốt đạt hiệu quả kinh tế cao 91 Đỗ Thị Xuân cs PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện nghiên cứu Giớng nấm: Giớng/dịng nấm Linh chi Nhật Bản, Linh chi Hàn Quốc Linh chi Thất Sơn cung cấp từ ngân hàng giống Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Dòng nấm Linh chi Nhật, Linh chi Hàn Quốc phân lập từ giống nấm phỗ biến từ Hàn Q́c Nhật Dịng nấm Linh chi Thất Sơn phân lập từ Trường Đại học An Giang có nguồn gốc Thất Sơn, Châu Đốc - An Giang Cơ chất phục vụ nghiên cứu: Cơ chất cấp 1: môi trường PDA sử dụng để khảo sát tớc độ lan tơ cấp dịng nấm Cơ chất cấp 2: hỗn hợp hạt lúa, cám gạo cám bắp phối trộn với tỉ lệ 9: 0,5:0,5 Cơ chất cấp 3: Cơ chất cao su được mua Tây Ninh chuẩn bị bao gồm giá thể (1) Mùn cưa cao su xử lý với nước vôi cho vào túi chịu nhiệt với đường kính 10 cm, dài 25 cm; (2) Gỗ to cao su có đường kính 15 - 20 cm, dài 25 cm (3) Gỗ nhỏ cao su có đường kính - 10 cm, dài 25 cm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Định danh dòng nấm Linh chi Ba dòng nấm Linh chi ni cấy tách dịng mơi trường PDA Hình thái độ thuần tơ nấm kiểm tra kính hiển vi điện tử Phịng thí nghiệm chuyên sâu Trường Đại học Cần Thơ Đánh giá tớc độ lan tơ dịng nấm môi trường PDA [6] Hệ sợi khuẩn ty dịng nấm thu, trích DNA theo quy trình Gardes & Burns (1993) [7] tiến hành thực phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) [8] Sản phẩm PCR kiểm tra gửi giải trình tự Công ty Macrogen Hàn Quốc Sau đó dùng phần mềm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) so sánh trình tự sở liệu Ngân hàng Gen NCBI (National Center for Biotechnology Information) để xác định loài [9] 2.2.2 Khảo sát phát triển khuẩn ty nấm Linh chi môi trường meo cấp cấp Thí nghiệm 1: Đánh giá sinh trưởng hệ sợi nấm giớng/dịng nấm Linh chi nuôi cấy môi trường dịch chiết khoai tây (PDA) với thành phần môi trường sau: 200 g dịch chiết khoai tây + 20 g D-glucose + 15 g agar Thí nghiệm 2: Khảo sát phát triển khuẩn ty dòng nấm Linh chi phát triển môi trường meo hạt từ hạt lúa tài nguyên có bổ sung cám gạo cám bắp với tỉ lệ 9: 0,5: 0,5 (meo cấp 2) Thí nghiệm bớ trí thể thức hồn tồn ngẫu nhiên với nhân tớ dịng nấm ngày khảo sát Hệ sợi tơ dịng nấm Linh chi ni đĩa Petri (Thí nghiệm 1) meo hạt (Thí nghiệm 2) với lần lặp lại lặp lại với đĩa Petri hoặc bịch meo hạt với tổng cộng 45 đơn vị thí nghiệm Các chỉ tiêu theo dõi Thí nghiệm bao gồm: Tớc độ mọc trung bình hệ sợi (mm/ngày), thời gian hệ sợi mọc kín đĩa, độ dày hệ sợi nấm Trong đó, tốc độ lan tơ chiều dài tơ nấm/số ngày cấy 2.2.3 Khảo sát sản lượng dòng nấm Linh chi trồng cơ chất từ gỗ cao su Đánh giá sinh trưởng hình thành quả thể ba dòng nấm Linh chi loại chất mùn cưa cao su, gỗ to gỗ nhỏ Thí nghiệm bớ trí hồn tồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu thừa sớ với nhân tớ bao gồm dịng nấm Linh chi (Linh chi Nhật A1, Linh chi Hàn A2 Linh chi 92 Khảo sát ảnh hưởng chất gỗ cao su đến sản lượng chất lượng nấm Linh chi … Thất Sơn A3) loại chất (mùn cưa cao su B0, gỗ nhỏ B1, gỗ to B2), với nghiệm thức, ba lần lặp lại lần lặp lại 10 đơn vị với tổng cộng 270 đơn vị thí nghiệm - Quy trình trồng nấm Linh chi mùn cưa thực theo Hình Hình Quy trình trồng nấm Linh chi mùn cưa - Quy trình trồng nấm Linh chi chất gỗ cao su Bước 1: Xử lí nguyên liệu Gỗ cao su mua từ Tây Ninh cắt thành khúc nhỏ với chiều dài khúc 25 cm Tiến hành quét vôi lên vết cắt chờ lớp vôi khô tiến hành ngâm thân nước vôi % tuần, vớt để nước sau đó cho khúc gỗ vào bọc nylon chịu nhiệt đem trùng nồi công suất lớn, hấp nhiệt độ cao liên tục 24 giờ Bước 2: Chủng meo giống Chọn meo giớng bịch có tớc độ lan tơ nhanh, trắng đều, khơng nhiễm bệnh từ thí nghiệm 2.2.2 Mở bọc nylon chứa gỗ, giống nấm chủng vào khúc gỗ (trong bọc nylon trùng) với lượng khoảng muỗng cà phê/khúc gỗ, meo cấy để gọn bề mặt cắt khúc gỗ tránh làm meo rơi xuống đáy bịch Bước 3: Chăm sóc thu hoạch Sau chủng nấm, khúc gỗ đặt nằm ngang kệ nhà trồng có hệ thớng phun sương để ủ Bổ sung ẩm độ để đạt 60 - 65 % giai đoạn quả thể phát triển tạo độ ẩm nhà trồng từ 85 - 95 % Quả thể (tai nấm) tăng trưởng đến khơng cịn viền trắng nấm thu hoạch Chỉ tiêu đánh giá: Tốc độ lan tơ (cm/ngày), thời gian tơ nấm ăn kín đáy bịch phơi hoặc khúc gỗ (ngày), ghi nhận thời gian thu hoạch quả thể chất xác định đường kính quả thể (cm) to cụm quả thể phát triển từ bịch phôi nghiệm thức; khối lượng quả thể tươi xác định cách cân cụm quả thể nấm phát triển từ bịch chất quan sát hình thái giải phẩu nấm Linh chi theo thời gian sinh trưởng phát triển quả thể 93 Đỗ Thị Xuân cs 2.2.4 Đính tính định lượng thành phần số dược tính có nấm Định tính thành phần dược tính có nấm Linh chi bao gồm saponin, triterpenoid phản ứng Liebermann-Burchard, khả kháng oxy hóa dòng nấm theo phương pháp Gounder & Lingamallu (2012) [10] Định lượng hàm lượng polysaccharide thực phương pháp tạo dịch chiết Yihui Gao cs (2001) [11] xác định hàm lượng polysaccharide theo phương pháp Tang & Zhong (2002) [12] 2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu Sớ liệu thu thập lưu trữ phần mềm Excel 2013 xử lý phần mềm Minitab 16.0, phân tích phương sai (ANOVA) So sánh trung bình nghiệm thức theo phương pháp kiểm định Tukey KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát tăng trưởng khuẩn ty dịng nấm Linh chi mơi trường PDA Hình Khuẩn ty dịng nấm Linh chi mơi trường nhân giống cấp môi trường PDA chụp kính hiển vi điện tử SEM (10 kV, SEM-5500) Ghi chú: Hình A, Hình B, Hình C: Khuẩn ty dòng nấm Linh chi Nhật, Linh chi Bảy Núi, Linh chi Hàn sau ngày cấy giống đĩa petri có kích thước cm (giống phân lập từ thể) Hình D, Hình E, Hình F: Khuẩn ty dòng nấm Linh chi Nhật (ngày 7), Linh chi Bảy Núi (ngày 6), Linh chi Hàn (ngày 5) tơ lan kín bề mặt đĩa đạt yêu cầu giống cấp 1; Hình G, Hình H: Khuẩn ty ngày cấy thứ độ phóng đại 900X (20 𝜇𝑚) 3.000X (5 𝜇𝑚); Hình I, Hình K: Khuẩn ty ngày cấy thứ 10 độ phóng đại 900X (20 𝜇𝑚) 3.000X (5 𝜇𝑚) Sau ngày khảo sát cho thấy tốc độ lan tơ ba dòng nấm tăng dần theo thời gian, đó dịng nấm Linh chi Hàn Q́c có tớc độ lan tơ nhanh (8,0 cm), tiếp đến dòng Thất Sơn dịng Nhật có tớc độ lan tơ chậm Tớc độ lan tơ trung bình theo dịng nấm (cm/ngày) dòng nấm khác biệt ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa %, đó dịng Hàn Q́c tăng trưởng nhanh dịng Thất Sơn cao dòng Nhật, tương ứng với kết quả khảo sát tớc độ tăng trưởng dịng nấm Linh chi Nhật Linh chi Hàn Quốc Thời gian lan tơ đạt yêu cầu giống cấp (ngày) nhanh dịng Hàn Q́c 4,77 ngày; dịng Thất Sơn 6,38 ngày; dòng Nhật 94 Khảo sát ảnh hưởng chất gỗ cao su đến sản lượng chất lượng nấm Linh chi … 7,23 ngày, đó tăng trưởng PDA dòng Linh chi Hàn Q́c tương với dịng nấm Linh chi Đỏ Nhật [13] Kết quả quan sát phát triển tơ nấm cho thấy dòng nấm Linh chi có đặc điểm tương đồng màu sắc mật độ sợi nấm: màu trắng, tơ dày khuẩn ty phát triển đới xứng toả trịn bề mặt chất PDA từ điểm cấy giai đoạn tăng trưởng, sau đó hệ sợi chuyển sang vàng giai đoạn lão hoá Sợi khuẩn ty chủ yếu sinh trưởng, phát triển bề mặt không tạo khuẩn ty ăn sâu vào phần chất (Hình 2) Tuy nhiên màu sắc, cách lan tơ dòng nấm Linh chi có khác biệt ngày cấy giống sớ Hình (A) dịng Nhật khuẩn ty có màu sắc trắng sáng, sợi tơ dày, mịn Hình (B) dòng Thất Sơn khuẩn ty có màu trắng đục, sợi tơ dày, trơn Hình (C) dịng Hàn Q́c khuẩn ty có màu trắng trong, sợi tơ dày, gồ ghề Hình D, Hình E, Hình F khuẩn ty dòng nấm Linh chi sau đạt kích thước tới đa đĩa petri: hệ sợi đồng nhất, tơ lan kín bề mặt đĩa Petri Do tăng trưởng nhanh nên hệ sợi dịng Hàn Q́c dịng Thất Sơn có tượng tạo bào tử sớm dòng Nhật chuyển sang màu vàng ngày 3.2 Khảo sát tăng trưởng khuẩn ty dịng nấm Linh chi mơi trường meo hạt Sau ngày khảo sát thì kết quả Bảng cho thấy tớc độ lan tơ trung bình theo dịng nấm (cm/ngày) Linh chi Hàn nhanh (tương ứng 1,14 cm/ngày), dòng Thất Sơn (tương ứng 0,98 cm/ngày), ći dịng Nhật (tương ứng 0,85 cm/ngày) Bảng Tốc độ, thời gian lan tơ dịng tơ nấm Linh chi mơi trường nhân giớng meo hạt Dịng nấm Thời gian lan tơ (cm) Ngày Ngày Ngày Ngày Tốc độ lan tơ trung bình theo dịng nấm (cm/ngày) Linh chi Nhật 0,86G,c 2,55E,c 4,29C,c 6,03A,c 0,85c 8,33c Linh chi Hàn 1,39G,a 3,64E,a 5,71C,a 7,00A,a 1,14a 6,20a Linh chi Thất Sơn 1,17G,b 3,15E,b 5,07C,b 6,85A,ab 0,98b 7,21b Tốc độ lan tơ trung bình theo ngày (cm) 1,14G 3,11E 5,02C 6,63A 2,97 7,25 * * 2,25 % 6,84 % F CV(P-value < 0,05) Thời gian lan tơ đạt yêu cầu giống cấp (ngày) Ghi chú: Các số trung bình cột hàng có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê qua phép kiểm định Tukey (*) khác biệt mức ý nghĩa % Tốc độ lan tơ theo dòng nấm theo thời gian có khác biệt có ý nghĩa thớng kê (p